王靜, 邵小美, 盛娜, 楊震

南京江北醫(yī)院 1.呼吸與危重癥科,2.呼吸科,江蘇南京 210000

人支氣管上皮(human bronchial epithelium,HBE)在維持呼吸系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[1]。炎癥細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等在多種刺激下均可在HBE細胞中上調(diào)[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與多種生理和病理過程,包括炎癥反應(yīng)。在膿毒癥中,抑制lncRNA NEAT1的表達可阻礙膿毒癥的發(fā)展和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的細胞損傷及炎癥反應(yīng)[3]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)與細胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。香煙煙霧提取物通過激活16HBE細胞中NF-κB通路促進細胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5]。本文采用LPS建立氣道炎癥模型,分析lncRNA NEAT1在LPS誘導(dǎo)的HBE細胞炎癥中的作用以及NF-κB信號通路所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人16HBE細胞購于深圳Otwo Biotech公司。胎牛血清購于蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司;DEME培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司;LPS購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑、SuperScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國英杰生命技術(shù)有限公司;Total RNA提取試劑盒購于福州飛凈生物科技有限公司;SYBR Green qPCR Master Mix購于美國Med Chem Express(MCE)生物科技公司;人IL-1β、IL-6及TNF-α的ELISA試劑盒均購于武漢菲恩生物科技有限公司;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物購于上海雅吉生物科技有限公司;RIPA裂解緩沖液購于美國AMRESCO公司;一抗PCNA、p53、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化-IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65、p-NF-κB p65及內(nèi)參α-tubulin均購于英國Abcam公司;異硫氰酸熒光素標(biāo)記IgG(FITC-IgG)購于上海阿拉丁試劑有限公司;引物及針對lncRNA NEAT1特定的小干擾RNA(si-NEAT1)及siRNA干擾對照(si-NC)均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。Applied Biosystems ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;Multlskan Mk3酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司;BD Accuri?C6流式細胞儀購自美國BD公司;FV1000激光共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

采用含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16HBE細胞,待其生長鋪滿培養(yǎng)皿85%時,去除培養(yǎng)基,使用PBS清洗后添加胰蛋白酶消化,顯微鏡觀察到細胞回縮,間隙變大后終止消化,去除消化液后添加新的培養(yǎng)基,按照1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)。選取培養(yǎng)的16HBE細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(1×106個/孔),當(dāng)細胞生長至培養(yǎng)板75%時,向每孔中添加50 mg/L LPS[6],再繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集細胞進行后續(xù)研究。

16HBE細胞分為Control組(等體積生理鹽水培養(yǎng))、LPS組(50 mg/L LPS處理24 h)、LPS+si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染24 h后添加50 mg/L LPS處理24 h)和LPS+si-NEAT1組(si-NEAT1轉(zhuǎn)染24 h后添加50 mg/L LPS處理24 h)。參照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.3 lncRNA NEAT1及炎癥細胞因子水平檢測

使用Total RNA提取試劑盒依次從各組培養(yǎng)的16HBE細胞中提取總RNA,使用SuperScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,隨后使用SYBR Green qPCR Master Mix配制反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀中對mRNA進行定量分析。以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個循環(huán)。ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量,所有操作流程均根據(jù)試劑盒說明書進行。

lncRNA NEAT1:F-5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3′,R-5′-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3′;IL-6:F-5′-CCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3′,R-5′-CGTCGAGGATGTACCGAATTT-3′;IL-1β:F-5′-CTCTCACCTCTCCTACTCACTT-3′,R-5′-TCAGAATGTGGGAGCGAATG-3′;TNF-α:F-5′-GGATGGATGGAGGTGAAAGTAG-3′,R-5′-TGATCCTGAAGAGGAGAGAGAA-3′;β-actin:F-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′,R-5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活力

取各組16HBE細胞,以2×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后,向每孔中添加100 μL DEME培養(yǎng)基(含10% MTT溶液)后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,添加100 μL Formanzan溶解液繼續(xù)培養(yǎng)細胞約4 h,直至觀察Formazan被完全溶解,使用37 ℃預(yù)熱的酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔光密度值(OD)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取各組16HBE細胞,以1×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h,去除上清,收集細胞,使用培養(yǎng)基稀釋細胞為1×105個/mL,添加200 μL 1×Binding buffer懸浮細胞后添加5 μL Annexin V-FITC和PI,在室溫避光孵育15 min,添加300 μL 1×Binding buffer,混勻后于流式細胞儀中分析各組細胞凋亡率。

1.6 Western blotting檢測

將各組16HBE細胞在含1%蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中冰上裂解30 min,裂解后離心10 min,收集上清液,98 ℃變性5 min。將獲得的總蛋白通過10% SDS-PAGE電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。添加5%脫脂牛奶封閉2 h,將膜與相對應(yīng)的一抗(PCNA、p53、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65及α-tubulin)4 ℃下孵育過夜,隔天將膜與二抗IgG-H&L(1∶2 000)孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對蛋白質(zhì)印跡條帶進行可視化,Image J分析條帶灰度值。最終目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 免疫熒光技術(shù)檢測細胞NF-κB p65定位

取各組5×104個/μL細胞添加在12孔板的載玻片上。PBS沖洗3次,室溫下用4%多聚甲醛固定10 min,添加抗體p-NF-κB p65孵育細胞。PBS洗滌后,加入FITC-IgG。最后,對載玻片進行沖洗、安裝,在激光共聚焦顯微鏡(488 nm)上進行觀察拍照,并通過熒光定量進行細胞核和細胞質(zhì)中NF-κB p65的比率分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件分析。使用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞炎癥因子的影響

與Control組比較,LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α及其mRNA、lncRNA NEAT1表達水平顯著上調(diào)(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組上述指標(biāo)表達水平顯著下調(diào)(P<0.05;表1)。

表1 各組16HBE細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1及IL-1β、IL-6及TNF-α水平及其mRNA相對表達量

2.2 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞增殖及凋亡的影響

與Control組比較,LPS組16HBE細胞增殖活力及PCNA表達水平均明顯降低,凋亡率及p53表達水平明顯升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組16HBE細胞增殖活力及PCNA表達水平均明顯升高,凋亡率及p53表達水平明顯降低(P<0.05;圖1)。

圖1 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞增殖、凋亡的影響A為MTT法檢測細胞活力;B、C為Western blotting檢測蛋白水平及柱狀圖;D、E為流式細胞儀檢測細胞凋亡及柱狀圖。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與LPS+si-NC組比較。

2.3 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響

與Control組比較,LPS組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05;圖2)。

圖2 Western blotting檢測IκBα、p-IκBα、NF-κB p65與p-NF-κB p65蛋白水平a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與LPS+si-NC組比較。

2.4 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞中NF-κB p65定位的影響

與Control組比較,LPS組16HBE細胞中p-NF-κB p65相對熒光強度(細胞核/細胞質(zhì))升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組細胞中p-NF-κB p65相對熒光強度降低(P<0.05;圖3)。

圖3 免疫熒光技術(shù)測定p-NF-κB p65在16HBE細胞中的表達(100×)

3 討 論

LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)會產(chǎn)生大量炎癥細胞因子,進一步誘發(fā)細胞凋亡和損傷[7]。本研究結(jié)果顯示,LPS上調(diào)16HBE細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及其mRNA表達水平。IL-1β作為免疫反應(yīng)的放大器,其過量產(chǎn)生可引起自身炎癥,也廣泛參與細胞的炎癥反應(yīng)[8-9];TNF-α屬于TNF家族,是主要的促炎細胞因子[10]。本研究結(jié)果顯示,LPS抑制16HBE細胞增殖活力及PCNA蛋白水平,并上調(diào)凋亡率和p53蛋白水平。PCNA是一種必不可少的蛋白質(zhì),參與各種DNA代謝過程,可作為細胞增殖的重要指標(biāo)[11];而p53是一種轉(zhuǎn)錄因子,可通過調(diào)控多個基因轉(zhuǎn)錄激活促進細胞凋亡[12]。

lncRNA是許多生物事件發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子,可廣泛參與細胞內(nèi)多種生物過程的發(fā)生發(fā)展[13]。lncRNA NEAT1廣泛存在哺乳動物的細胞中,參與多種疾病炎癥反應(yīng)[14-15]。但lncRNA NEAT1在HBE細胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機制尚未可知。本研究結(jié)果顯示,沉默lncRNA NEAT1可降低LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞增殖活力。Gao等[4]發(fā)現(xiàn),lncRNA NEAT1可促進腎小管內(nèi)皮細胞中LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥損傷。本研究結(jié)果提示,沉默lncRNA NEAT1可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE的炎癥細胞因子合成與釋放及細胞凋亡,并促進細胞增殖。

本研究結(jié)果顯示,LPS處理后16HBE細胞中p-IκBα與p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高。據(jù)以往報道顯示,NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子[16-17]。NF-κB信號通路被激活時,最終引起NF-κB從細胞質(zhì)NF-κB/IκBα復(fù)合體中釋放出來,細胞質(zhì)NF-κB迅速轉(zhuǎn)移到細胞核中并啟動靶基因表達[18-19]。以上數(shù)據(jù)提示,LPS處理激活了IκBα和NF-κB p65的磷酸化和細胞質(zhì)中p-NF-κB p65向細胞核中轉(zhuǎn)移,表明LPS可能通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)16HBE細胞炎癥反應(yīng)。沉默lncRNA NEAT1可明顯逆轉(zhuǎn)LPS對16HBE細胞中NF-κB信號通路的激活作用。沉默lncRNA NEAT1可抑制IκBα和NF-κB p65的磷酸化和細胞質(zhì)中的p-NF-κB p65向細胞核中轉(zhuǎn)移,進而對LPS誘導(dǎo)的16HBE細胞的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制作用。

綜上所述,沉默lncRNA NEAT1可通過抑制NF-κB通路激活進而減輕LPS誘導(dǎo)16HBE細胞的炎癥反應(yīng)。