崔鵬鵬,單瑞達,王怡淑,b,李 霞,b,孫登岳,b*,曾志雄*

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) a.生物工程學(xué)部;b.生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353

帕金森病是一種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,其主要發(fā)病原因為患者大腦中的黑質(zhì)和紋狀體神經(jīng)細胞受到損傷[1-2],從而損壞多巴胺神經(jīng)元,引起多巴胺生成不足[3]。由于帕金森病無法根治,目前利用藥物緩解病癥成為常見的治療手段。帕金森病多發(fā)于中老年群體,隨著人類進入老齡化社會,帕金森病發(fā)病率逐年增多[4-5]。對于治療帕金森病新藥的研制和藥品原料的合成尤為重要。

左旋多巴(levodopa,L-DOPA)是多巴胺的前體物質(zhì),具有多巴胺不具備的功能——通過血腦屏障[6-7],L-DOPA進入腦細胞后,經(jīng)體內(nèi)脫羧酶的催化生成多巴胺,而起到治療帕金森病的作用[8-9]。目前臨床上常用的藥物為左旋多巴或者以左旋多巴為主要成分的藥物,如美多芭[10]、帕金寧[11]、息寧[12]等。L-DOPA對于治療弱視、非藥源性震顫麻痹綜合征[13]等疾病有一定作用。此外,還具有輔助治療精神分裂癥[14]和抗衰老的功效。

目前,L-DOPA的合成方法主要有植物提取法、化學(xué)合成法和生物合成法。藜豆和貓豆[15-16]等含有L-DOPA的植物是植物提取左旋多巴的重要原料,但由于原料少、產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜[17]等原因植物提取法逐漸被淘汰?；瘜W(xué)合成法是以乙內(nèi)酰脲和香草醛為原料,利用不對稱合成手段,需要8步化學(xué)反應(yīng)[18],但反應(yīng)中使用大量金屬催化劑,對環(huán)境有污染,產(chǎn)物中含有有毒的D-DOPA[19],不利于工業(yè)生產(chǎn)。隨著生物技術(shù)的進步,利用生物合成法生產(chǎn)L-DOPA受到越來越多的關(guān)注。目前生物合成法常利用的酶有3種[20]：轉(zhuǎn)氨酶(transaminase)、酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenoll-yase,TPL)和酪氨酸酶(tyrosinase)。由于轉(zhuǎn)氨酶法利用含有毒性的前體物質(zhì)和操作步驟繁瑣[21],很少用于商業(yè)生產(chǎn);酪氨酸酚裂解酶法中的底物鄰苯二酚對酶的活性有抑制作用;因此,利用酪氨酸酶生物法合成L-DOPA成為最適宜的選擇,其在酶法催化合成L-DOPA方面具有重要的價值。

報道的酪氨酸氧化酶(tyrosinase,TYR)是一種雙核含銅的氧化還原酶[22],它能催化酪氨酸生成L-DOPA,催化反應(yīng)式如圖1所示[23]。Lunt[24]等在嗜酪氨酸微螺菌(Microspiratyrasinatica)中首次發(fā)現(xiàn)能催化合成L-DOPA 的酪氨酸酶;Krishnaveni[25]等在頂頭孢霉(Acremoniumrutilum)也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸酶,用于合成L-DOPA。由于該酶同時具有二酚酶活性能繼續(xù)催化L-DOPA氧化生成多巴醌,為抑制二酚酶活性需要添加還原劑,但不利于工業(yè)生產(chǎn)。因此尋找新型底物專一性的酪氨酸酶用于L-DOPA的生物催化合成具有重要意義。

圖1 由酪氨酸合成L-DOPA的催化反應(yīng)式

實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)了一種來源于青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的新的酪氨酸酶基因TYR,本研究對該來源的RsTYR蛋白進行異源表達、純化,研究其酶學(xué)性質(zhì),并確定了其酶學(xué)性質(zhì)參數(shù),通過同源序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹對RsTYR的家族屬性進行了分析,確定了催化活性的關(guān)鍵位點。這對以后該酶的改造及應(yīng)用提供了一定基礎(chǔ)。經(jīng)過高效液相色譜法(HPLC)分析,表明RsTYR能特異性的將酪氨酸氧化為L-DOPA且沒有副產(chǎn)物。因此,該酶可直接利用L-酪氨酸作為底物一步催化合成L-DOPA,未來有望于在降低治療帕金森病藥物的成本方面發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α菌株等(博邁德生物公司);酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID公司);NaCl等常規(guī)試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(北京博奧拓達科技有限公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司);蛋白Marker(北京聚合美生物科技有限公司);Ni-NTA Agarose親和樹脂、凝膠過濾色譜柱和離子交換色譜柱(美國GE公司);DNA聚合酶 Prime STAR Max、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ 和連接酶 Solution Ⅰ(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司);超濾管(Millipore公司)。

超聲波破碎儀(美國SONICS公司);Analytikjena凝膠成像系統(tǒng)(德國耶拿公司);高速冷凍離心機(日本日立公司);KTA pure(美國GE公司);SIL-20A高效液相色譜儀(日本島津公司);電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);PCR儀和BioPhotometer plus(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 RsTYR表達載體的構(gòu)建

在金唯智公司合成RsTYR蛋白的基因序列,以合成的基因作為模板設(shè)計PCR引物Primer F：CGCGGATCC ATGGTCGTG CGCCGCAC;Primer R：CCCAAGCTT TTAAATCAC GGCCACTTC AATGC。目的基因經(jīng)過PCR擴增得到。在需擴增目的基因的5＇端和3＇端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點。PCR體系設(shè)置為25 μL。PCR程序流程：98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s;54 ℃退火15 s;72 ℃延伸5 s;30個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。擴增的目的片段和載體pET-28a由限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切,對酶切產(chǎn)物純化回收,用Solution Ⅰ 16 ℃連接30 min。將構(gòu)建好的質(zhì)粒用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,挑取轉(zhuǎn)化子,進行雙酶切驗證,最后把酶切驗證正確的樣品送至測序公司進行驗證。

1.2.2 蛋白純化條件及步驟

通過熱激轉(zhuǎn)化法將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中培養(yǎng)過夜,挑取轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到5 mL試管LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),再將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到1 L搖瓶LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),待OD值達到0.6～0.8后,在培養(yǎng)液中加入IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白過夜表達。4 000 r/min,4 ℃離心15 min收菌。由于RsTYR蛋白在兩端含有His標簽,采用鎳親和層析法對蛋白質(zhì)進行初步純化。將收集的菌體沉淀于裂解緩沖液中懸浮。加入50 mg/mL的溶菌酶,1 mol/L的PMSF和β-巰基乙醇混勻30 min。隨后用超聲波破碎儀在低溫條件下破碎細胞。破碎結(jié)束之后,13 000 r/min、4 ℃離心1 h。把離心得到的上清液與預(yù)先平衡好的Ni樹脂在4 ℃條件下結(jié)合1 h,先用洗脫緩沖液1(裂解緩沖液)洗脫樹脂,再用洗脫緩沖液2(20 mol/L咪唑)洗脫樹脂,最后在4 ℃下用10 mL Elution buffer(250 mol/L咪唑)洗脫,將含有目的蛋白的洗脫組分混合在一起,在4 ℃下通過超濾管進行濃縮,并通過Source Q離子柱和Superdex 75凝膠過濾柱進一步純化。

1.2.3 RsTYR的酶活性測定和催化產(chǎn)物分析

采用島津SIL-20A高效液相色譜儀對催化產(chǎn)物經(jīng)行分析。500 μL反應(yīng)體系：Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)100 mol/L,酪氨酸底物2 mol/L,酶質(zhì)量濃度0.5 mg/mL。將配制好的反應(yīng)體系于室溫反應(yīng)90 min,反應(yīng)結(jié)束后用沸水浴滅活5 min終止反應(yīng)。將催化反應(yīng)后的反應(yīng)液12 000 r/min離心10 min,用0.22 μm濾膜過濾上清液,進行色譜分析。設(shè)定3組平行試驗。各項參數(shù)：C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm,Hanbon,China);流動相為體積分數(shù)2%乙酸溶液-甲醇(90∶10);流速為0.5 mL/min;檢測波長為280 nm;柱溫為室溫;進樣量為40 μL。通過標準曲線對產(chǎn)物進行定量,以產(chǎn)物L(fēng)-DOPA的總量來計算酶活。

1.2.4 RsTYR酶學(xué)性質(zhì)測定

(1)RsTYR蛋白的最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性。測定該酶的最適反應(yīng)溫度,選擇20～60 ℃的溫度條件,在100 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)條件下進行測定。

測定酶的溫度穩(wěn)定性,在20～55 ℃條件下將酶分別保溫(0.5、1、2 h),然后冰浴10 min,測定殘余酶活性,以4 ℃溫度下的酶活性為100%。

(2)RsTYR蛋白的最適反應(yīng)pH及其穩(wěn)定性。測定pH對酶活力的影響,選擇pH 5.5～10.0 (100 mmol/L)的緩沖液。PBS緩沖液(pH 5.5～8.5),Tris-HCl 緩沖液(pH 6.0～9.0),HEPES緩沖液(pH 6.5～9.5),MES緩沖液(pH 5.5～6.5),Gly緩沖液(pH 8.5～10.0)。通過測定RsTYR的殘余活力來計算酶活,把酶活力最高的作為對照。

測定酶的pH穩(wěn)定性,將稀釋至3.6 μmol/L的酶液置于上述緩沖液中,4 ℃ 反應(yīng)1 h,通過測定RsTYR的殘余活力來計算酶活,把酶活力最高的作為對照。

1.2.5 金屬離子對RsTYR酶活性的影響

在最適溫度和最適pH的條件下,測定各種金屬離子對RsTYR活性的影響,金屬離子的濃度為1 mmol/L,以不添加金屬離子的反應(yīng)的酶活性作為100%。

2 結(jié)果討論

2.1 RsTYR的序列同源性及催化結(jié)構(gòu)位點分析

通過文獻發(fā)掘和已經(jīng)被報道的其他來源的酪氨酸酶,我們對這些來源不同的氨基酸序列利用生物學(xué)軟件MEGA X來進行序列比對,利用Espript 3.0對比對結(jié)果進行著色美化,結(jié)果如圖2所示,雖然RsTYR與來源于Streptomycescastaneoglobisporus、Bacillusmegaterium、Juglansregia的酪氨酸酶都是Ⅲ型銅蛋白酶,活性位點均包含6個His[26],但他們的序列相似度較低不到10%,表明雖屬不同來源,但其催化功能方面進化較為一致,具有相同的催化位點。其中,RsTYR酶和報道的來源于Juglansregia的酪氨酸酶序列相似度較高(>50%)。之后,我們將得到的不同來源的酪氨酸酶序列利用MEGA X生物分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析其蛋白家族屬性。結(jié)果如圖3所示,結(jié)合序列比結(jié)果,RsTYR同樣是屬于Tyrosinase Superfamily家族的酶。

圖2 RsTYR序列比對

圖3 RsTYR的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

來源于Juglansregia的酪氨酸酶(jrTYR)的晶體結(jié)構(gòu)已被解析,且和RsTYR序列相似度相對較高,因此,本實驗以jrTYR(PDB：5CE9)晶體結(jié)構(gòu)為模板對RsTYR進行同源建模,分析其催化結(jié)構(gòu)及催化活性位點。三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖4所示,RsTYR同樣具有兩個保守的銅結(jié)合結(jié)構(gòu)域Cu(A)和Cu(B),其保守的催化結(jié)合位點為His81、His93、His102、His227、His231、His253,每個銅活性中心都與3個His結(jié)合在一起,這和報道的jrTYR是一致的[27-28],表明了RsTYR確實屬于Tyrosinase Superfamily家族,且為Ⅲ型銅蛋白酶。

注：(a)RsTYR模擬結(jié)構(gòu)模型。α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的顏色分別為青色、紫色和淺粉色;(b)活性中心和催化位點的示意中心。Cu2+的活性中心呈棕色球狀,催化位點(H81、H93、H102)和(H227、H231、H253)分別呈綠色和黃色棒狀。

2.2 RsTYR-pET-28a載體構(gòu)建

首先,用菌落PCR法對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行驗證,經(jīng)驗證能得到一條1.5 kb的條帶,符合目的基因的大小(圖5(a));然后用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對RsTYR-pET28a進行雙酶切驗證,能夠得到兩條條帶,大小分別為1.5 kb和5.3 kb(圖5(b)),符合目的基因的大小;最后把酶切驗證正確的重組質(zhì)粒送至測序公司進行測序,測序后序列正確,證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.3 RsTYR誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化

運用生物信息學(xué)軟件DANMAN對RsTYR的核酸序列進行分析,預(yù)測得到其分子量約為54.4 ku。誘導(dǎo)溫度設(shè)置為16、25、37 ℃,誘導(dǎo)劑IPTG的濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.5 mmol/L,誘導(dǎo)時間為12 h,優(yōu)化誘導(dǎo)條件,得到最適條件。首先使用DeNovix DS-11分光光度計對不同誘導(dǎo)條件下得到的上清液測定可溶性蛋白的質(zhì)量濃度,再通過Image lab對聚丙烯酰胺凝膠電泳圖進行灰度分析,最后得到目標蛋白的質(zhì)量濃度。結(jié)果如圖6所示,當溫度為25 ℃、誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol/L時誘導(dǎo)12 h,上清液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度達到最高為0.4 mg/mL。由圖可得,隨著溫度和誘導(dǎo)劑濃度升高,目的蛋白的質(zhì)量濃度降低,可能是在高溫條件下,目標蛋白不能正確折疊,從而形成包涵體沉淀。綜上所述,蛋白得正確表達需要適當?shù)恼T導(dǎo)劑濃度和中低溫等誘導(dǎo)條件。

圖6 不同誘導(dǎo)條件下上清液中可溶性RsTYR蛋白的濃度

2.4 RsTYR的表達純化

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖7(a)分析,目的蛋白能夠在上清液中可溶性表達,由Ni樹脂親和層析可以看出在含有250 mol/L咪唑的洗脫緩沖液中含有較多的目的蛋白,表明RsTYR與Ni樹脂有較強的親和力,目的蛋白條帶在45～65 ku之間有明顯表達,且蛋白分子量和預(yù)測值(54.4 ku)大致一樣。然后依次用陰離子交換層析和凝膠過濾層析對目的蛋白進行純化,從陰離子吸附層析(圖7(b))和凝膠過濾層析分析(圖7(c))中能夠看出目的蛋白分別在22.87 mL和12.58 mL位置流出。結(jié)合SDS-PAGE圖分析,經(jīng)純化后能夠得到純度較高的目的蛋白,并且該蛋白為單體,以此蛋白作為后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的測定。

注：(a)RsTYR在質(zhì)粒pET28a中表達的SDS-PAGE分析。泳道1為超聲;泳道2為上清液;泳道3為沉積物;泳道4為通過;泳道5為洗滌緩沖液1;泳道6為洗滌緩沖液2;泳道7為洗脫前的樹脂;泳道8為洗脫后的樹脂;泳道9-12為洗脫緩沖液;(b)使用SOURCE Q柱通過離子交換純化RsTYR;(c)使用Superdex 75 10/300GL柱通過凝膠過濾純化RsTYR。

2.5 RsTYR底物特異性及催化產(chǎn)物分析

首先,按照1.2.3中的催化體系分別測定了RsTYR對L-酪氨酸和L-DOPA的底物特異性,結(jié)果如圖8(a)所示,實驗測得RsTYR可催化2 mmol/L的L-酪氨酸生成0.08 mg/mL的L-DOPA;然而,RsTYR對底物L(fēng)-DOPA的催化體系中僅有底物L(fēng)-DOPA的保留峰且與標品的峰值幾乎相同,說明RsTYR不催化L-DOPA。因此L-酪氨酸是RsTYR的最適底物,并且RsTYR對L-DOPA沒有催化活性。實驗進一步分析了RsTYR對L-酪氨酸的催化產(chǎn)物,HPLC檢測結(jié)果如圖8(b)所示,實驗組在6.577 min出現(xiàn)了產(chǎn)物L(fēng)-DOPA的保留峰且無其他雜峰,表明L-酪氨酸經(jīng)RsTYR酶催化后,產(chǎn)物單一,且為L-DOPA。和報道的酪氨酸酶(如mushroom tyrosinase)[29]相比,RsTYR對L-酪氨酸具有底物特異性,其能夠一步生物催化合成L-DOPA。

(a)RsTYR的底物特異性分析 (b)高效液相色譜法測定L-酪氨酸的催化產(chǎn)物

2.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 溫度對RsTYR催化活性及穩(wěn)定性的影響

溫度的變化會引起酶活性的變化。當溫度的升高時,底物分子熱運動加快,分子碰撞的機會增加,從而提高了酶的活性。本質(zhì)上酶是蛋白質(zhì),過高的溫度往往會引起蛋白質(zhì)的變性,而這種變性是不可逆轉(zhuǎn)的,從而會降低酶活性甚至失活。

溫度與RsTYR酶活性的關(guān)系如圖9(a)所示,RsTYR在45 ℃時酶活性最高。在20～40 ℃,酶活性保持上升趨勢。在40～50 ℃,酶活力在80%以上。但當溫度超過50 ℃時,其催化活性迅速降低,在60 ℃時,活性仍能保持在30%左右。因此RsTYR在體外的最適催化溫度為35～50 ℃。

(a)溫度對RsTYR活性的影響 (b)RsTYR的溫度穩(wěn)定性

將酶置于不同溫度下保溫0.5～2 h,再冰浴冷卻10 min,經(jīng)反應(yīng)后測定其殘余活性。由圖9(b)可知,保溫時間越長,酶活性越低,并且溫度越高,保存時間越長其活性下降幅度越大。在20～45 ℃,保溫2 h的酶仍具有50%以上的活性,當保存溫度升到60 ℃時,隨著保存時間的增加,活性下降幅度越大,但仍有30%左右的殘余酶活,由此可見RsTYR對溫度耐受性比較強,應(yīng)屬于中高溫酶。

2.6.2 pH對RsTYR催化活性及穩(wěn)定性的影響

pH的改變也會導(dǎo)致酶的活性發(fā)生變化。當pH發(fā)生變化時,酶活性中心某些基團的解離程度可能也會發(fā)生改變,這種改變就包含解離基團的底物與其輔酶之間的荷電狀態(tài)的改變,影響酶的親和力,酶活性中心的空間構(gòu)象也會改變,從而引起酶活性的改變。當酶處于過酸或過堿的環(huán)境時,都會造成酶的失活且不可逆。

從圖10(a)中可以看出在不同pH的緩沖液中RsTYR酶活性的變化,RsTYR在pH為6.5的PBS緩沖液中有最高的酶活性,同時隨著該緩沖液pH的增加,酶活性逐漸降低。在相同的pH下,比較Tris-HCl和MES緩沖液,PBS更適合RsTYR的催化反應(yīng)。極端pH條件如8.5及以上,RsTYR僅有20%左右的活性,說明堿性環(huán)境不利于RsTYR的催化。所以,PBS緩沖液是RsTYR催化反應(yīng)最理想的緩沖液,并且最適反應(yīng)pH為6.5。

(a)pH對RsTYR活性的影響 (b)RsTYR的pH穩(wěn)定性

將酶置于pH 5.5～9.5下,4 ℃保溫1 h,測定其殘余活性。由圖10(b)可知,在pH 6.0～7.5 間,酶仍具有50%以上的活性。在pH 7.0時,RsTYR最穩(wěn)定。以上表明RsTYR在pH為中性的環(huán)境酶活性較強也最穩(wěn)定,堿性環(huán)境則會對RsTYR造成破壞,降低其酶活性。

2.6.3 RsTYR的酶動力學(xué)參數(shù)

以L-酪氨酸作為底物(0.05～6.4 μmol/L)測定RsTYR的酶動力學(xué)參數(shù),利用Graphpad Prism 8軟件中的Michaelis-Menten方程[30]對數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合。結(jié)果如圖11所示,RsTYR對L-酪氨酸的酶動力學(xué)參數(shù)Km為0.63 μmol/L、kcat為9.61 s-1,kcat/Km為15.25 μmol·s-1·L-1。

2.7 金屬離子對RsTYR酶活性的影響

RsTYR和各種金屬離子在4 ℃的環(huán)境下孵育1 h,在最適反應(yīng)條件下進行催化,測定其殘余活性。結(jié)果由圖12可知,K+能夠提高RsTYR的活性,活性提高了48%,其他金屬離子均不同程度的抑制了RsTYR的活性,其中Co2+和Cu2+對RsTYR的活性抑制程度最強,其活性僅為不添加金屬離子的7%和6%。但當Cu2+的濃度為50 μmol/L時RsTYR的酶活性達到1.96倍,說明Cu2+的濃度對RsTYR的活性有顯著的影響,在高濃度金屬離子存在的情況下RsTYR穩(wěn)定性較差。

3 結(jié) 論

當今社會老齡化程度越來越高,中老年群體患病幾率逐漸增大,帕金森病患者逐年增加,如今已成為第二大神經(jīng)性疾病[31]。L-DOPA作為治療帕金森病的有效藥物成分,自二十世紀六十年代L-DOPA被Birkmayer[16]證實具有治療PD的療效,對于L-DOPA的工業(yè)生產(chǎn)一直受到重視。由于生物合成法與植物合成法和化學(xué)合成法相比具有成本低、步驟簡單、綠色環(huán)保等特點,也來越受到人們的關(guān)注。酪氨酸酶合成法是生物合成L-DOPA的重要手段,但其本身同時具有二酚酶活性能夠繼續(xù)催化L-DOPA,對工業(yè)生產(chǎn)不利,因此,對于新型酪氨酸氧化酶的研究及其應(yīng)用都具有重要的意義。

本研究將來源于青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的RsTYR成功的在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進行異源表達,并得到了較高的表達量,RsTYR的蛋白分子大小為54.4 ku。經(jīng)過Ni樹脂親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步純化,獲得了純度較高的RsTYR蛋白。與此同時,還對RsTYR蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進行研究,實驗發(fā)現(xiàn)RsTYR酶的最適溫度為45 ℃,這要優(yōu)于Streptomycessp.酪氨酸酶[32-33];最適反應(yīng)溫度范圍為35～50 ℃;最適反應(yīng)pH為6.5,這與一些報道的鏈霉菌酪氨酸酶的相似[32-35];pH在6.0～7.5的范圍內(nèi)該酶較為穩(wěn)定。PBS緩沖液是RsTYR的最適催化反應(yīng)緩沖液。RsTYR的酶動力學(xué)參數(shù)Km為0.63 μmol/L、kcat值為9.61 s-1,kcat/Km為15.25 μmol·s-1·L-1。kcat/Km的值與酶的催化效率成正比,與jrTYR相比kcat/Km的值是其5.6倍[28],說明RsTYR的催化效率更高。采用HPLC對酪氨酸的催化產(chǎn)物進行了分析,證明酪氨酸經(jīng)RsTYR特異性催化后,產(chǎn)物為L-DOPA。通過序列同源性分析,確定了RsTYR屬于Tyrosinase Superfamily,預(yù)測了該酶的催化位點。本研究對RsTYR的理化性質(zhì)進行了基礎(chǔ)研究,這為后續(xù)對于該酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)、催化機制解析和定向改造提供了基礎(chǔ)。