韓 迪,劉興偉*,王家明,張興會(huì),高 月,王曉銘,趙艷嬌

(1.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心,沈陽 110032;2.遼寧絨山羊原種場(chǎng)有限公司,遼寧 遼陽 111000)

遼寧省的絨山羊養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)多數(shù)位于山區(qū),呈現(xiàn)規(guī)模小、分布散的特點(diǎn)。遼寧絨山羊人工授精技術(shù)研究工作開始于20世紀(jì)80年代,在很大程度上解決了優(yōu)秀種公羊不足、種公羊改良輻射面小的難題。隨著遼寧絨山羊選育工作的開展,少數(shù)生產(chǎn)性能優(yōu)越、遺傳性能穩(wěn)定、改良應(yīng)用效果好的優(yōu)秀種公羊被培育出來,成為養(yǎng)殖業(yè)內(nèi)深受歡迎和追捧的明星羊,很多養(yǎng)殖場(chǎng)期盼用這些羊改良本場(chǎng)羊只。在養(yǎng)殖場(chǎng)調(diào)研、培訓(xùn)交流過程中發(fā)現(xiàn),如何提高鮮精保存時(shí)間以擴(kuò)大種公羊改良輻射面,是養(yǎng)殖場(chǎng)非常關(guān)心的問題。為此,將提高鮮精保存時(shí)間的研究提上了日程。

本研究根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)理論、低溫生物學(xué)理論及絨山羊精液的理化特性,通過調(diào)整精液稀釋液配方、精液保存溫度和合理的輸精操作方法,使原精稀釋后精子得到有效保護(hù),精子結(jié)構(gòu)破壞達(dá)到最小。在精液使用的過程中,調(diào)整生產(chǎn)實(shí)踐中精液操作的方法,使稀釋后的精液在零上低溫環(huán)境中輸入發(fā)情母羊的生殖道內(nèi)并成功受孕,從而打破了鮮精配種必須在 20 ℃以上環(huán)境中進(jìn)行的禁錮,使人工授精技術(shù)的環(huán)境條件更適合精子的存活,從而促進(jìn)鮮精人工授精技術(shù)更好地在生產(chǎn)中推廣。

1 材料與方法

1.1 精液稀釋液初選配方的研制

本團(tuán)隊(duì)參考其他研究人員的報(bào)道[1-4],研制了10種精液稀釋液配方,見表1。

表1 精液液態(tài)長期低溫保存稀釋液配方(全部由本研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì))Tab.1 Formula of diluent for long-term cryopreservation of liquid semen (all designed by this research team)

1.2 稀釋液配制方法

配方中鹽、酸、堿、糖均為化學(xué)分析純?cè)噭?純化水為雙次蒸餾;將上述物質(zhì)加入容器煮沸后冷卻至 37 ℃,再加入新鮮卵黃和抗生素,攪拌充分后備用。稀釋時(shí),將稀釋液順集精杯內(nèi)壁緩緩加入精液中并緩慢混勻[5]。

1.3 精液來源

采集遼寧絨山羊原種場(chǎng)有限公司的 5 只成年公羊精液,混合后平均活力為(71.00 ± 5.69)%。

1.4 精液檢查

使用 200～ 600 倍光學(xué)顯微鏡對(duì)混合精液進(jìn)行檢查,并用精子分析系統(tǒng)對(duì)檢查結(jié)果進(jìn)行校正。

1.5 精液稀釋

將混合精液平均分為 10 等分,分別加入 10 mL試管中,再將各配方中的稀釋液分別緩慢加入到混合精液中,上述操作中試管、精液、稀釋液的溫度均相同。

1.6 精液降溫

將 10 支裝有稀釋后精液的試管置于盛有300 mL純化水的燒杯中,然后放入 0～4 ℃的恒溫冰箱中,每 2 h檢查各試管精液的活力、畸形率并記錄檢查的具體時(shí)間,精確到分鐘。

1.7 稀釋液篩選和精子受胎率試驗(yàn)

使用10個(gè)配方配制精液稀釋液,對(duì)精液進(jìn)行稀釋,比較在低溫環(huán)境中精子的保存時(shí)間及精子活力,篩選保存時(shí)間最長、活力最高的稀釋液配方作為初選配方,再對(duì)初選配方中的三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、檸檬酸進(jìn)行加減調(diào)整,再次形成4個(gè)新配方,對(duì)精液再次進(jìn)行稀釋保存試驗(yàn),篩選出最優(yōu)的最終配方。根據(jù)最優(yōu)配方對(duì)精液進(jìn)行稀釋,低溫保存后進(jìn)行輸精試驗(yàn)。所選試驗(yàn)?zāi)秆驗(yàn)檫|寧省遼寧絨山羊原種場(chǎng)有限公司的2～5周歲健康母羊,試驗(yàn)1組42只,試驗(yàn)2組40只,試驗(yàn)3組46只,試驗(yàn)4組48只,對(duì)照組50只。

1.8 測(cè)定項(xiàng)目

1.8.1 精子活力

將稀釋精液搖勻后取中層精液 10 μL,滴于載玻片上,置于 37 ℃恒溫板上停留 1～2 s,蓋上蓋玻片[5]。用邁朗精子分析儀的SCA軟件分析精子活力。

1.8.2 精子存活時(shí)間

每 2 h測(cè)定一次精子活力,最后一次測(cè)量(精子死亡)與上一次測(cè)量取平均值,為精子最后的存活時(shí)間。

1.8.3 情期受胎率

在母羊一個(gè)發(fā)情期內(nèi)配種,妊娠母羊數(shù)(不返情母羊數(shù))占所有參加配種母羊數(shù)的比例為情期受胎率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存時(shí)間精子活力

見表2。

表2 0～4 ℃條件下使用不同稀釋液配方不同時(shí)間的精子活力Tab.2 Sperm survival time under different diluent formulations at 0-4 ℃

在表2中,如果按照精子最后死亡時(shí)間排序,精子死亡時(shí)間相同時(shí)按活力高低排序,則 10 個(gè)稀釋液配方中精子存活時(shí)間從長到短依次為5號(hào)配方、4號(hào)配方、2號(hào)配方、3號(hào)配方、7號(hào)配方、8號(hào)配方、9號(hào)配方、10號(hào)配方、1號(hào)配方、6號(hào)配方,其中以5號(hào)配方效果最好。因此,以5號(hào)配方作為初選的首選配方,4號(hào)配方作為備用配方。

2.2 精液稀釋液配方的進(jìn)一步篩選

以5號(hào)配方為基礎(chǔ),調(diào)整配方成分與含量,形成稀釋液配方5-1、5-2、5-3、5-4,見表3。按照初選時(shí)的檢測(cè)方法與稀釋方法,對(duì)這4種稀釋液配方處理的精液進(jìn)行精子存活時(shí)間測(cè)定,結(jié)果見表4。

表3 進(jìn)一步篩選的稀釋液配方Tab.3 Formulation of diluent for further screening

表4 稀釋液配方進(jìn)一步篩選后不同時(shí)間的精子活力Tab.4 Results of sperm survival time for further screening of diluent formulation

在表4中,如果按照精子最后死亡時(shí)間排序,精子死亡時(shí)間相同時(shí)按活力高低排序,5個(gè)配方稀釋液保存精液時(shí)精子存活時(shí)間依次為5-4、5-3、5-2、5-1,據(jù)此,選擇5-4為最終長期低溫保存的稀釋液配方。

2.3 最佳配方的輸精受胎率試驗(yàn)

以5-4配方配制精液稀釋液,將采集的公羊精液經(jīng)檢查合格后均以 1∶3 的比例進(jìn)行稀釋,分別在0～5 ℃下保存2,3,4,5 d,對(duì)發(fā)情的成年母羊在子宮頸口內(nèi) 1 cm處進(jìn)行輸精,輸精劑量為 0.5 mL(經(jīng)測(cè)定有效精子數(shù)為3 500萬個(gè)),1個(gè)情期輸精1次。其中,精液保存1 d的時(shí)間設(shè)為對(duì)照組,保存2,3,4,5 d的分別為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組,試驗(yàn)4組,輸精效果見表5。

表5 最佳配方稀釋精液的不同保存時(shí)間輸精效果Tab.5 Details of the effects of semen infusion for different storage times of semen diluted with the best formula

從表5可以看出,試驗(yàn)1,2,3組與對(duì)照組比較情期受胎率差異不顯著,說明精液在低溫狀態(tài)下保存<4 d,人工輸精情期受胎率不受保存時(shí)間的影響;試驗(yàn)4組與對(duì)照組比較,情期受胎率的差異達(dá)到極顯著水平,即液態(tài)精液在此配方下保存到第4天,精子的質(zhì)量明顯下降,說明保存時(shí)間對(duì)受胎效果有明顯的影響。

3 結(jié)論與討論

精液稀釋液是精子最直接的外環(huán)境,稀釋液中各種物質(zhì)含量對(duì)精液的滲透壓、pH值、緩沖環(huán)境產(chǎn)生非常大的影響,從而影響精子的代謝活動(dòng)和能量消耗[5-6],因此,精液稀釋液的配方是否科學(xué)合理對(duì)精子存活時(shí)間影響較大。本試驗(yàn)篩選的液態(tài)精液稀釋液配方中的具體成分為三羥甲基氨基甲烷2.42 g,檸檬酸(1H2O)1.34 g,乙二胺四乙酸0.20 g,葡萄糖 1.00 g,新鮮卵黃 20.0 mL,超純水 80.0 mL,青霉素 1.0×105IU,鏈霉素 1.0×105IU組成最為合理,在低溫環(huán)境中保存4 d,也能取得較好的輸精受胎效果。

精液稀釋液配方中的三羥甲基氨基甲烷與檸檬酸(1H2O)、乙二胺四乙酸形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物,可以有效緩沖精液中的酸堿變化,形成穩(wěn)定的對(duì)精子有利的酸堿環(huán)境,從而有利于精子保存。

本試驗(yàn)沒有就精液稀釋液配方用于不同環(huán)境溫度下液態(tài)精液的保存效果比較,設(shè)計(jì)還不夠全面,有可能使稀釋液配方的應(yīng)用效果有一定的局限性,需進(jìn)一步開展相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充和完善。