孫子惠,李德法,關(guān)湘妍,王 晴,馬瑜鍇,李和平

(東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護地學(xué)院,哈爾濱 150040)

我國是世界養(yǎng)鹿大國之一,鹿養(yǎng)殖業(yè)歷史悠久,養(yǎng)鹿歷史可以追溯到新石器時代[1]。梅花鹿、馬鹿、馴鹿等是我國人工飼養(yǎng)的主要鹿種,其中梅花鹿的存欄量最多[2]。梅花鹿肉低脂肪、高蛋白,具有較高的食用、保健和藥用價值,是重要的藥膳進補畜肉來源之一[3-4]。隨著養(yǎng)鹿業(yè)的發(fā)展及人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變,鹿肉的消費群體也在不斷擴大,越來越多的人開始接受這種高檔肉類。由于肉類的脂肪酸組成和含量在很大程度上決定了其營養(yǎng)價值和加工后產(chǎn)品的風(fēng)味[5],探究梅花鹿各組織內(nèi)脂肪酸合成與代謝的影響因素,對開發(fā)梅花鹿肉資源及研究梅花鹿肉營養(yǎng)價值與風(fēng)味有著重要的意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是一類配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子,屬Ⅱ型核受體超家族,因其能被過氧化物酶體增殖物激活而得名[6]。而PPARγ是PPARs家族中最具脂肪細胞專一性的異構(gòu)體,它主要在脂肪組織中表達,并在脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化過程中起重要作用[7]。PPARγ主要通過控制脂肪的儲存和釋放來促進脂肪細胞的表達,調(diào)節(jié)胰島素抵抗和血糖的穩(wěn)定,維持機體能量的相對平衡;能與增強子結(jié)合蛋白家族結(jié)合,共同協(xié)調(diào)誘導(dǎo)脂肪細胞的分化,并對早期脂肪細胞的分化起到正向調(diào)節(jié)作用,顯著增加了其對脂肪酸的儲存能力[8]。因此,研究和探討PPARγ的表達與動物體內(nèi)脂肪酸代謝之間的關(guān)系具有重要意義。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)是葡萄糖合成脂肪酸的關(guān)鍵酶,機體中的葡萄糖通過糖酵解合成丙酮酸,丙酮酸再轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,進而轉(zhuǎn)化為檸檬酸,在ATP存在下經(jīng)過檸檬酸裂解酶的作用合成乙酰CoA,再通過羧化酶的作用形成丙二酰CoA,最后在FAS作用下合成長鏈脂肪酸。在動物機體中,FAS基因在肺臟、腎臟、肌肉和腦組織中均有表達,且在脂肪和肝臟中高表達[9]。FAS基因在組織中的表達量對動物體內(nèi)脂肪含量有重要的調(diào)控作用,其表達量的多少可以顯著地影響三酰甘油在機體內(nèi)的含量。

激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)是動物體內(nèi)脂肪代謝中重要的限速酶,其作用是在脂肪分解代謝過程中將三酰甘油水解成甘油和脂肪酸,為動物機體代謝提供能量[10]。隨著日齡的增長和脂肪含量的增加,兔體內(nèi)的HSL基因表達量逐漸下降,表明HSL基因可能與脂肪代謝密切相關(guān)。

關(guān)于PPARγ、HSL、FAS基因表達性差異的研究主要集中在常規(guī)畜禽領(lǐng)域,在鹿科動物中還沒有深入研究的報道。本試驗初步探討PPARγ、HSL、FAS基因在梅花鹿不同組織與不同性別的表達差異規(guī)律,為進一步探索它們與脂肪酸含量的關(guān)系奠定前期基礎(chǔ),也為改善鹿肉品質(zhì)及選育優(yōu)良品種提供可借鑒的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)信息、為進一步選育肉質(zhì)優(yōu)良梅花鹿提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

成年健康雌性、雄性梅花鹿各3只,均由吉林省長春市雙陽區(qū)世鹿鹿業(yè)集團有限公司提供。屠宰后分別取背最長肌、肋間肌、股四頭肌、臀大肌、心臟(乳頭肌)、肝臟(左葉)、肺臟(右肺上葉)、皮下脂肪8種新鮮組織,分割成50 mg左右小塊放于凍存管中,標號后迅速置于液氮罐中冷凍,帶回實驗室保存,備用。

1.2 總RNA的提取

取8個高溫滅菌處理過的研缽,加入液氮研磨樣品(50 mg),待組織研磨成粉末后,迅速置于離心管中,按照AllPrep DNA/RNA Mini Kit 說明書進行RNA提取,將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并檢測濃度,根據(jù)OD260/OD280比值判斷RNA質(zhì)量。

1.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TaKaRa),對樣品總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 。反應(yīng)體系:5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,gDNA Eraser 1.0 μL,Total RNA 2.0 μL,RNase Free dH2O 5.0 μL;反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min;37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s。

1.4 實時熒光定量PCR

1.4.1 熒光定量引物設(shè)計

分別參考NCBI 中白尾鹿(Odocoileusvirginianus)、牛(Bostaurus)、羊(Ovisaries)等同源物種的PPARγ、FAS、HSL的mRNA序列,以GADPH為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0設(shè)計梅花鹿PPARγ、FAS、HSL、GADPH的同源性引物,引物信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物信息Tab.1 Real-time PCR primer information

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測

以ABI 7500熒光定量儀為實驗平臺,以GADPH基因為內(nèi)參基因,檢測PPARγ、FAS、HSL基因在雄性、雌性梅花鹿背最長肌、肋間肌、股四頭肌、臀大肌、心臟、肝臟、肺臟和皮下脂肪組織中的表達情況。反應(yīng)體系:SYBR PremixEx Taq Ⅱ ( TliRNaseH Plus) (2×) 10.0 μL,上、下游引物各 0.8 μL,cDNA 模板 2.0 μL,ROX Reference Dyeor Dye Ⅱ 0.4 μL,RNase Free dH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 34 s,72 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min, 95 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。每個組織每個基因設(shè)置3個重復(fù),以保證數(shù)據(jù)的準確性。

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理

利用2-ΔΔCt法計算不同基因在不同組織中及同一基因在不同性別同一組織中的相對表達量。使用 SPSS Statistics 24.0 軟件對熒光定量 PCR所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。各組織的基因表達量均以肺臟組織為對照進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPARγ基因在梅花鹿不同組織中的表達量分析

以肺臟組織為對照,PPARγ基因在雄性梅花鹿不同組織中的表達順序為皮下脂肪>心臟>肺臟>肝臟>肋間肌>背最長肌>股四頭肌>臀大肌,見圖1。

注:*、**、****分別表示P≤0.05、P≤0.01、P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖1 PPARγ基因在雄性梅花鹿不同組織中的相對表達量Fig.1 Relative expression of PPARγ gene in different tissues of male sika deer

PPARγ基因在雌性梅花鹿的不同組織中均有表達,表達量由大到小的順序為皮下脂肪>肺臟>肝臟>心臟>肋間肌>背最長肌>臀大肌>股四頭肌,見圖2。

注:*、**、****分別表示P≤0.05、P≤0.01、P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖2 PPARγ基因在雌性梅花鹿不同組織的相對表達量 Fig.2 Relative expression levels of PPARγ gene in different tissues of female sika deer

PPARγ基因在不同性別梅花鹿同一組織中的表達量僅在心臟及肺臟中存在顯著差異(P≤0.05,P≤0.001),其他組織中均無顯著差異(P>0.05),見圖3。

2.2 FAS基因在梅花鹿不同組織中的表達量分析

FAS基因在雄性梅花鹿的不同組織中均有表達,表達量由大到小的順序為皮下脂肪>肝臟>肺臟>心臟>肋間肌>背最長肌>股四頭肌>臀大肌,見圖4。

注:***、****分別表示P≤0.001、P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖4 FAS基因在雄性梅花鹿不同組織中的相對表達量 Fig.4 Relative expression of FAS gene in different tissues of male sika deer

FAS基因在雌性梅花鹿的不同組織中均有表達,表達量由大到小的順序為皮下脂肪>肺臟>肝臟>肋間肌>心臟>背最長肌>臀大肌>股四頭肌,見圖5。

注:****表示P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖5 FAS基因在雌性梅花鹿不同組織中mRNA的相對表達量Fig.5 Relative mRNA expression levels of FAS gene in different tissues of female sika deer

FAS基因在不同性別梅花鹿同一組織中表達量均無顯著差異(P>0.05),見圖6。

注:無柱標表示差異不顯著(P>0.05)。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖6 FAS基因在不同性別梅花鹿同一組織中的相對表達量Fig.6 Relative expression of FAS gene in the same tissue of sika deer with different sex

2.3 HSL基因在梅花鹿不同組織中的表達量分析

HSL基因在雄性梅花鹿的不同組織中均有表達且存在差異,HSL基因在雄性梅花鹿不同組織中的表達量由大到小的順序為皮下脂肪>肝臟>肺臟>背最長肌>肋間肌>臀大肌>股四頭肌>心臟,見圖7。

注:****表示P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖7 HSL基因在雄性梅花鹿不同組織中mRNA的相對表達量 Fig.7 Relative mRNA expression levels of HSL gene in different tissues of male sika deer

HSL基因在雌性梅花鹿的不同組織中均有表達且存在差異。由大到小的順序為皮下脂肪>肝臟>肺臟>肋間肌>背最長肌>股四頭肌>心臟>臀大肌,見圖8。

注:*、**、***、****分別表示P≤0.05、P≤0.01、P≤0.001、P≤0.000 1。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖8 HSL基因在雌性梅花鹿不同組織中mRNA的相對表達量 Fig.8 Relative mRNA expression levels of HSL gene in different tissues of female sika deer

HSL基因在不同性別梅花鹿同一組織表達量均無顯著差異(P>0.05),見圖9。

注:無柱標表示差異不顯著(P>0.05)。P.皮下脂肪;X.心臟;F.肺臟;G.肝臟;L.肋間肌;B.背最長肌;T.股四頭肌;N.臀大肌。圖9 HSL基因在不同性別梅花鹿同一組織中的相對表達量Fig.9 Relative expression levels of HSL gene in the same tissue of sika deer with different sex

3 討 論

3.1 PPARγ基因的組織表達差異分析

本試驗通過實時熒光定量PCR對PPARγ基因在梅花鹿8個不同組織中的表達情況進行研究,結(jié)果表明,PPARγ基因在梅花鹿的皮下脂肪、心臟、肺臟、肝臟、肋間肌、背最長肌、股四頭肌和臀大肌組織中均有表達,且在脂肪組織中的表達量高于肌肉組織。且相對表達量在不同性別梅花鹿同一組織中存在顯著差異,在心臟中,雄性梅花鹿PPARγ基因表達量高于雌性梅花鹿。雌性梅花鹿肺臟PPARγ基因表達量高于雄性梅花鹿。在皮下脂肪、肋間肌、肝臟、臀大肌和背最長肌中,雄性梅花鹿與雌性梅花鹿PPARγ基因的表達量無顯著差異。

脂肪是動物體內(nèi)重要的貯能物質(zhì),其合成與分解是一個復(fù)雜的生理生化過程,受多方面因素的影響。而PPARγ是脂肪合成基本轉(zhuǎn)錄因子,可直接或間接介導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮脂肪調(diào)控作用,促進脂肪細胞中與脂肪代謝相關(guān)基因的表達。PPARγ基因在荷斯坦公牛不同部位脂肪組織(背部脂肪、腰部脂肪、腸系膜脂肪和腎周脂肪)和肌肉組織(半腱肌和背最長肌)中均有表達,且在脂肪組織中的表達量高于肌肉組織。以不同月齡廣靈大尾羊和小尾寒羊為研究對象,用實時熒光定量法研究發(fā)現(xiàn),PPARγ在脂肪組織的相對表達量顯著高于肌肉組織。在本試驗中,PPARγ基因在皮下脂肪組織中的表達量極顯著高于其他組織,進一步表明PPARγ在脂肪細胞分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

3.2 FAS基因的組織差異表達分析

本試驗中,FAS基因在梅花鹿皮下脂肪組織中的表達量顯著高于其他組織,在肝臟、肺臟組織中的表達量顯著高于心臟和肌肉組織,在肌肉組織中的表達量最低;且在不同性別梅花鹿同一組織中其相對表達量無顯著差異。FAS主要參與動物脂肪酸的合成。有研究表明,FAS表達水平的升高能夠顯著增加三酰甘油在體內(nèi)的沉積而導(dǎo)致肥胖[11]。通過對牛19號染色體的QTL連鎖分析發(fā)現(xiàn),FAS基因的SNPs與脂肪和乳脂形成有關(guān)[12]。無獨有偶,豬胴體脂肪含量、胴體脂肪率與脂肪酸合成酶含量密切相關(guān)。由此可見,FAS基因可作為影響動物體脂肪含量的主效基因之一。通過對不同品種豬的不同組織中FAS基因表達模式進行研究,發(fā)現(xiàn)FAS基因在不同品種豬的皮下脂肪中表達量最高,其次是肝臟和肌肉組織[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),在嚙齒類動物和禽類中FAS基因主要在肝臟中表達,而豬的FAS基因主要在脂肪組織中表達,這說明FAS基因的表達具有明顯的物種和組織特異性[14]。綜上所述,本試驗結(jié)果表明,FAS基因在梅花鹿皮下脂肪中的表達量最高,在肌肉組織中的表達量最低,與上述研究結(jié)論基本一致。研究證明,FAS基因表達水平與肌內(nèi)脂肪呈顯著的正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,FAS基因在皮下脂肪中的表達水平最高,在肌肉組織中的表達水平最低。

3.3 HSL基因的組織差異表達分析

本試驗中,HSL基因在梅花鹿8個組織器官中均有表達,其在皮下脂肪中的表達水平最高,在心臟組織中的表達量最低。且在不同性別梅花鹿同一組織中其相對表達量無顯著差異。HSL被認為是三酰甘油水解的限速酶,在控制機體能量穩(wěn)定性方面也發(fā)揮著重要作用。HSL蛋白含有三個主要的結(jié)構(gòu)域:催化域、編碼磷酸位點的調(diào)節(jié)域和與脂滴蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。以延邊牛的HSL基因為研究對象,發(fā)現(xiàn)其A1729B位點與牛的胴體質(zhì)量和背膘厚度呈顯著相關(guān),A1921G位點與胴體質(zhì)量與眼肌面積顯著相關(guān)。Wagyu雜交牛HSL活性與肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋有關(guān),HSL基因表達量的增加能顯著降低三酰甘油在細胞中的沉積。研究人員對HSL基因在綿羊中的表達水平進行了測定,結(jié)果表明,其在皮下脂肪中的表達水平顯著高于背最長肌、股二頭肌和心臟[16]。在研究不同日糧水平對綿羊不同組織中HSL基因表達影響時發(fā)現(xiàn),各組織器官中HSL基因的表達量具有組織差異,肌肉組織、心臟中HSL基因的表達量遠低于脂肪組織[17]。本研究結(jié)果表明,HSL基因在皮下脂肪組織中的表達水平較高,在心臟和肌肉組織中的表達量較低,與上述研究結(jié)果一致。因此,HSL基因是調(diào)節(jié)動物體內(nèi)脂肪分解代謝的一個主要候選基因。

4 結(jié) 論

PPARγ、FAS和HSL基因在梅花鹿不同組織中均有表達,且存在顯著差異。雌性、雄性梅花鹿的皮下脂肪、心臟、肺臟和肝臟組織是PPARγ基因mRNA的主要分布組織;雌性、雄性梅花鹿的皮下脂肪、肝臟和肺臟組織是FAS基因mRNA的主要分布組織;雌性、雄性梅花鹿的皮下脂肪、肺臟和肝臟是HSL基因mRNA的主要分布組織。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PPARγ、FAS和HSL基因在不同性別的梅花鹿不同組織中均有表達且存在一定的差異,這為進一步選育肉質(zhì)優(yōu)良梅花鹿提供新的理論參考。