張?zhí)O 孫曉芳 鐘言茹 孔令茹 吳琦琦 施海燕 王鳴華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

農(nóng)藥施用后會(huì)經(jīng)地表徑流、淋溶和降雨沉降等方式進(jìn)入水環(huán)境，在環(huán)境生物體內(nèi)發(fā)生吸收、分布和代謝，并進(jìn)一步對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生如致死性、酶活性影響和“三致”性等毒性效應(yīng)行為，從而威脅水生生物安全。魚(yú)類模式生物斑馬魚(yú)（Danio rerio）具有軀體透明、周期短、易檢測(cè)且與人類基因同源性高等優(yōu)點(diǎn)，最初用于檢測(cè)水體中環(huán)境污染物[1]，目前已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)、遺傳學(xué)、藥物代謝和新藥篩選創(chuàng)制等研究領(lǐng)域[2-3]。生態(tài)毒理學(xué)研究常采用生物富集因子（BCF）、清除速率常數(shù)和半衰期評(píng)估農(nóng)藥在其體內(nèi)的吸收、分布和代謝過(guò)程的動(dòng)力學(xué)終點(diǎn)[4]。

氯氟醚菌唑（Mefentrifluconazole）是由巴斯夫公司研發(fā)并上市的首個(gè)新型異丙醇三唑類殺菌劑[5]，與傳統(tǒng)三唑類殺菌劑相比，具有更高的選擇性和內(nèi)吸性，對(duì)多種抗性病原菌防治效果顯著，可延緩抗性發(fā)展[6]。氯氟醚菌唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有1 個(gè)手性中心，包含2 個(gè)對(duì)映體。對(duì)映體具有相同的理化性質(zhì)，但通常在活性、毒性和環(huán)境行為方面表現(xiàn)出較大差異[7]。國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）報(bào)告顯示，氯氟醚菌唑?qū)λ锞哂卸拘裕移涠拘赃€具有遺傳性，被視為潛在的肝臟有毒物質(zhì)。目前，已有研究表明氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)早期胚胎發(fā)育和幼魚(yú)生長(zhǎng)具有選擇性致畸和神經(jīng)毒性[8]，并對(duì)其成魚(yú)具有肝臟毒性，進(jìn)而影響其脂質(zhì)代謝過(guò)程[9]，但其在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集及代謝行為尚未明確。

本研究以斑馬魚(yú)為供試水生生物，從對(duì)映體水平研究氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性、富集代謝行為及代謝途徑，為揭示氯氟醚菌唑的對(duì)映體選擇性水生生物毒性效應(yīng)及其水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC Xevo TQ-S Micro 型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世科技（上海）有限公司）；Triple TOF?5600+型液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；FA-25 型高剪切分散乳化機(jī)（德國(guó)FLUKO 公司）；JN25-12D 型超聲波清洗儀（寧波江南儀器廠）；Talboys 數(shù)顯型渦旋混合器（美國(guó)Henry Troemn 公司）；TDL-40B 型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；N-EVAP111 氮吹儀（美國(guó)Organomation 公司）。

甲酸和乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；丙酮（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；C18吸附劑（46～60 μm）和Florisil 吸附劑（100～200 目，即篩孔0.154～0.075 mm）（天津Agela 生物技術(shù)有限公司）；氯氟醚菌唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥93.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）；氯氟醚菌唑?qū)τ丑w（純度≥99.9%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）。

1.2 供試生物預(yù)培養(yǎng)

野生型品系斑馬魚(yú)成魚(yú)（3 月齡，體長(zhǎng)1.5～2.5 cm）購(gòu)自南京市夫子廟花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室條件下用脫氯自來(lái)水馴化培養(yǎng)14 d，水溫（24±1）℃，pH=7.5±0.5，光暗周期為14 h∶10 h，水中溶解氧濃度≥60%，自然死亡率低于5%方可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 急性毒性試驗(yàn)

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則 魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)》（GB/T 31270.12-2014）[10]和OECD 指南203 試驗(yàn)準(zhǔn)則[11]開(kāi)展氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)成魚(yú)的96 h 急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取致死率在10%～90%范圍的劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。Rac-氯氟醚菌唑、R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑的暴露濃度分別設(shè)置6 檔濃度梯度，每個(gè)濃度處理組隨機(jī)置入10 條斑馬魚(yú)，另設(shè)空白對(duì)照和0.1%丙酮溶劑對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)周期為96 h，觀察并記錄斑馬魚(yú)死亡數(shù)并及時(shí)清除死魚(yú)，使用DPS 7.05 計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.3.2 斑馬魚(yú)生物富集和代謝清除試驗(yàn)

參照GB/T 31270.7-2014[10]和OECD 指南305 試驗(yàn)準(zhǔn)則[12]開(kāi)展氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)的對(duì)映體選擇性生物富集和代謝清除試驗(yàn)。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果的1/10 和1/100，設(shè)置20 和200 μg/L 外消旋體濃度暴露組，另設(shè)0.1%丙酮對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組放置200 條斑馬魚(yú)，不設(shè)重復(fù)。藥劑暴露14 d 后，將所有實(shí)驗(yàn)組更換為清水進(jìn)入7 d 代謝清除階段，整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段每24 h 更換50%的培養(yǎng)溶液。分別于暴露2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 后，以及代謝清除開(kāi)始后2 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d 和7 d，從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取10～12 條斑馬魚(yú)，流水反復(fù)沖洗，用濾紙吸取表面水分后于–80 ℃凍存。同時(shí)于暴露階段各取樣時(shí)間點(diǎn)取5 mL 暴露水樣于–20 ℃保存。

1.3.3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w含量測(cè)定

Li 等[13]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結(jié)合Chiralpak IG-3 手性色譜柱實(shí)現(xiàn)了氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的基線分離，并通過(guò)旋光儀和電子圓二色譜確定了氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的旋光性和絕對(duì)構(gòu)型。本研究在此基礎(chǔ)上測(cè)定斑馬魚(yú)和水樣中的氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的含量。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件 Chiralpak IG-3 手性色譜柱，柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈（10∶90，V/V）混合溶液，流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓為2.56 kV；去溶劑溫度為550 ℃；離子源溫度為500 ℃；去溶劑氣（氮?dú)猓┝魉贋?50 L/h；電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；母離子m/z398.3，子離子m/z70.0 和m/z182.2，錐孔電壓為23 V，碰撞能量為21 eV。

1.3.5 樣品前處理

斑馬魚(yú)樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.50 g 經(jīng)液氮粉碎的斑馬魚(yú)樣品，加入1 mL 水和5 mL 乙腈，渦旋5 min、超聲10 min，加入1 g NaCl，渦旋2 min，4000 r/min 離心5 min，經(jīng)C18和Florisils 凈化后，氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。

水樣前處理 準(zhǔn)確量取5 mL 水樣，加入20 mL 乙腈，振蕩5 min，加入3.0 g NaCl，渦旋2 min，離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。

1.3.6 方法驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取氯氟醚菌唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0101 g，用乙腈配制成1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)母液，梯度稀釋成0.2～1000 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。根據(jù)1.3.5 節(jié)的方法制備空白基質(zhì)樣品，分別使用0.2～1000 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.4 節(jié)的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定。繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)斜率比評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[14]。

在空白樣品中添加4 個(gè)濃度水平（2、10、100 和1000 μg/kg）的氯氟醚菌唑?qū)τ丑w標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度設(shè)5 個(gè)重復(fù)。按照1.3.5 節(jié)的方法提取凈化后進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，計(jì)算回收率，評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確度和精密度，并分別考察方法的日間精密度和日內(nèi)精密度[14]。

1.3.7 氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定

斑馬魚(yú)樣品按照1.3.5 節(jié)的方法前處理后，采用液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定[15-16]。

液相色譜條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈混合溶液，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，5%乙腈；6～20 min，5%～30%乙腈；21～30 min，30%～95%乙腈；31～35 min，95%乙腈；36～38 min，95%～5%乙腈；36～38 min，5%乙腈。

高分辨質(zhì)譜條件 采用ESI+掃描模式，掃描范圍為m/z50～1000；毛細(xì)管電壓為5.5 kV；離子源溫度為550 ℃；霧化氣流量為650 L/h；錐孔電壓為30 V；碰撞能量為40 eV；霧簾氣壓為35 psi（1 psi=6.895 kPa）。利用PeakView 1.2 軟件根據(jù)精確分子質(zhì)量信息及二級(jí)質(zhì)譜圖等特征信息對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品中的氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

農(nóng)藥化學(xué)品的生物富集能力通常通過(guò)生物富集系數(shù)（BCF）進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)農(nóng)藥化學(xué)品在生物體與環(huán)境中達(dá)到平衡時(shí)，兩者濃度之比即為穩(wěn)態(tài)生物富集因子（BCFss），計(jì)算公式見(jiàn)式（1）：

其中，Cf為達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)斑馬魚(yú)體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的濃度（mg/kg），Cw為達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)水中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的濃度（mg/L）。

在代謝清除階段，根據(jù)斑馬魚(yú)體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的殘留濃度隨時(shí)間的變化關(guān)系擬合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（式（2）），代謝半衰期（T1/2）通過(guò)式（3）計(jì)算：

其中，Ct為取樣時(shí)間點(diǎn)為t時(shí)樣品中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的質(zhì)量濃度（mg/kg），C0為氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的初始質(zhì)量濃度（mg/kg），k為代謝速率常數(shù)。

采用對(duì)映體分?jǐn)?shù)（Enantiomeric fraction，EF，式（4））[17]作為評(píng)價(jià)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w選擇性降解行為的指標(biāo)。

其中，CR和CS分別為樣品中R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑的濃度（mg/kg）。EF 值為某一對(duì)映體含量占消旋體含量的比值，取值范圍為0～1，通常用小數(shù)表示。EF=0.5 時(shí)，表示生物體內(nèi)兩對(duì)映體含量相同；EF 偏離0.5 時(shí)，表明該手性農(nóng)藥發(fā)生了對(duì)映體選擇性降解行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS分析方法評(píng)價(jià)

在1.3.4 節(jié)的UPLC-MS/MS 條件下，氯氟醚唑?qū)τ丑w在IG-3 手性柱上的流出順序?yàn)镽-（-）-氯氟醚菌唑和S-（+）-氯氟醚菌唑。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的分離色譜圖Fig.1 Chromatogram of enantioseparation of mefentrifluconazole

斑馬魚(yú)空白樣品中，氯氟醚菌唑?qū)τ丑w出峰時(shí)間處均無(wú)干擾峰。氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在溶劑和各基質(zhì)中的線性回歸方程和基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表1。在0.2～1000 μg/L 濃度范圍內(nèi)，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2>0.9932），LOQ 為2 μg/kg。分析結(jié)果表明，基質(zhì)斜率與溶劑斜率之比在0.8～1.2 之間，說(shuō)明氯氟醚菌唑的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)。

表1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定斑馬魚(yú)中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的線方程、基質(zhì)效應(yīng)及靈敏度Table 1 Linearity,matrix effects and sensitivity for determination of mefentrifluconazole enantiomers in zebrafish by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

在2、10、100 和1000 μg/kg 添加水平下，平均回收率為75.0%～106.1%，RSDs 為0.6%～8.2%（電子版文后支持信息表S1）。本方法滿足氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水和斑馬魚(yú)體內(nèi)的檢測(cè)要求。

2.2 氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的對(duì)映體選擇性毒性

氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的96 h 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，氯氟醚菌唑外消旋體及其對(duì)映體對(duì)斑馬魚(yú)的毒性順序?yàn)镾-氯氟醚菌唑（LC50=1.68 mg/L）>Rac-氯氟醚菌唑（LC50=2.42 mg/L）>R-氯氟醚菌唑（LC50=3.33 mg/L），S-氯氟醚菌唑的毒性分別是R-氯氟醚菌唑和Rac-氯氟醚菌唑的2.0 倍和1.4 倍。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 31270.7—2014[10]中農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類毒性的等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，氯氟醚菌唑外消旋體及其對(duì)映體對(duì)斑馬魚(yú)為中等毒性。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[9，18]的研究結(jié)果一致，氯氟醚菌唑?qū)ν寥郎锍嘧訍?ài)勝蚓和水生生物斑馬魚(yú)均表現(xiàn)為S-氯氟醚菌唑比R-對(duì)映體具有更高的毒性。

表2 氯氟醚菌唑及其對(duì)映體對(duì)斑馬魚(yú)的96 h急性毒性Table 2 Acute toxicity of mefentrifluconazole and its enantiomers to zebrafish in 96 h

2.3 氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)的對(duì)映體選擇性生物富集和代謝

如圖2 所示，兩種暴露濃度下的斑馬魚(yú)體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w含量變化趨勢(shì)相同。在暴露期間，水體中氯氟醚菌唑濃度基本保持穩(wěn)定，而斑馬魚(yú)樣品中兩對(duì)映體濃度在暴露開(kāi)始3 d 內(nèi)迅速積累到最大值后再降低，然后緩慢上升并趨于穩(wěn)定。

圖2 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在斑馬魚(yú)體內(nèi)的對(duì)映體選擇性生物富集和代謝及其對(duì)映體分?jǐn)?shù)（EF）值變化:（A）氯氟醚菌唑暴露濃度為20 μg/L 時(shí)，對(duì)映體的選擇性生物富集和代謝;（B）氯氟醚菌唑暴露濃度為200 μg/L 時(shí)，對(duì)映體的選擇性生物富集和代謝;氯氟醚菌唑暴露濃度分別為（C）20 μg/L 和（D）200 μg/L時(shí)，EF 值的變化圖Fig.2 Enantioselective bioaccumulation and elimination of mefentrifluconazole and enantiomeric fraction(EF)values in zebrafish:(A)Enantioselective bioconcentration and metabolism of mefentrifluconazole at an exposure concentration of 20 μg/L;(B) Enantioselective bioconcentration and metabolism of mefentrifluconazole at an exposure concentration of 200 μg/L;Changes in EF values when exposure concentrations of mefentrifluconazole are (C) 20 μg/L and (D) 200 μg/L,respectively

在同一濃度處理組，斑馬魚(yú)體內(nèi)R-氯氟醚菌唑濃度始終高于S-氯氟醚菌唑，顯著性分析結(jié)果表明，氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)存在顯著的對(duì)映體選擇性吸收現(xiàn)象，表現(xiàn)為R-氯氟醚菌唑優(yōu)先被富集（p<0.05）。結(jié)合圖2C 和圖2D 中的富集階段，在兩種處理濃度下EF 值始終大于0.5，并且在高濃度處理組中EF 值偏離0.5 的程度更高，表明R-氯氟醚菌唑在高濃度暴露下具有更強(qiáng)的選擇性富集能力。進(jìn)一步計(jì)算得到表3 中兩對(duì)映體在低濃度處理下的BCFss分別為1.02 和0.62，在高濃度處理下的BCFss分別為8.38 和3.41，R-氯氟醚菌唑的BCFss分別為S-氯氟醚菌唑的1.64 和2.46 倍，并且較高的暴露濃度可能導(dǎo)致生物富集程度增加。

表3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和穩(wěn)態(tài)生物富集因子（BCFss）值Table 3 Kinetic parameters and bioconcentration factors in the steady state (BCFss) values of mefentrifluconazole enantiomers

在清除階段，斑馬魚(yú)體中的R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑在2 d 內(nèi)迅速被機(jī)體代謝，濃度隨時(shí)間的變化關(guān)系可通過(guò)一級(jí)毒力學(xué)方程擬合，相關(guān)參數(shù)及半衰期列于表3。結(jié)果表明，低濃度處理時(shí)斑馬魚(yú)體內(nèi)兩對(duì)映體之間存在顯著的代謝速率差異（p<0.05），R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑半衰期分別為0.83和1.19 d，表現(xiàn)為斑馬魚(yú)對(duì)R-氯氟醚菌唑具有更大的清除速率常數(shù)和較短的半衰期，其EF 值逐漸變?。▓D2C）。但是，高濃度處理組中兩對(duì)映體在清除階段半衰期均為0.44 d，不存在對(duì)映體選擇性代謝行為。

雖然富集階段的變化規(guī)律不完全符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，但與文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的其它化合物（如戊唑醇[19]、氟環(huán)唑[20]等）在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集規(guī)律相似。文獻(xiàn)[19，21]的研究結(jié)果表明，戊唑醇和己唑醇在成年斑馬魚(yú)中均顯示出顯著的對(duì)映選擇性生物富集行為。戊唑醇和己唑醇對(duì)映體之間表現(xiàn)為R-體優(yōu)先被富集，在代謝清除階段表現(xiàn)出S-體優(yōu)先被代謝。此外，Zhang 等[22]從對(duì)映體水平研究了經(jīng)不同濃度藥劑暴露的成年斑馬魚(yú)生物體對(duì)丙硫菌唑及其代謝物的對(duì)映體選擇性吸收和代謝行為。結(jié)果表明，不同濃度暴露下，對(duì)映體之間均表現(xiàn)為S-體優(yōu)先被富集而代謝階段無(wú)對(duì)映體選擇性。推測(cè)手性農(nóng)藥化合物在斑馬魚(yú)體內(nèi)富集階段的含量變化受富集行為和代謝行為共同作用。

2.4 氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝途徑

采用LC-Q-TOF-MS/MS 分別對(duì)氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定分析，氯氟醚菌唑及其代謝物的提取離子色譜圖和特征碎片離子比對(duì)結(jié)果見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1，相關(guān)代謝物的分子式及特征性質(zhì)譜信息見(jiàn)電子版文后支持信息表S2。

母體氯氟醚菌唑出峰時(shí)間為10.33 min，m/z398.0877，二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生的m/z70.0425 特征碎片離子（電子版文后支持信息圖S1A）為三唑氮環(huán)的離子。在斑馬魚(yú)樣品中，共鑒定出8 種氯氟醚菌唑的代謝產(chǎn)物，其中包括3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物。

代謝物1#（m/z288.0955）在5.80 min 處出峰，此化合物由母體化合物苯環(huán)上C—O 鍵斷裂產(chǎn)生，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖碎片離子m/z199.0585 與此結(jié)構(gòu)中斷開(kāi)C—C 鍵和C—F 鍵后的結(jié)構(gòu)質(zhì)荷比一致，推斷代謝物1#為M003（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1B）。代謝物2#（m/z414.0826）在9.09 min 處出峰（電子版文后支持信息表S2），此化合物由母體化合物含Cl 苯環(huán)的鄰、間位羥基化形成代謝物M016 或M017（電子版文后支持信息圖S1C），也可以由母體化合物甲基羥基化反應(yīng)形成代謝物M039（電子版文后支持信息圖S1D），還可以由母體化合物三唑氮環(huán)的羥基化反應(yīng)形成M086（電子版文后支持信息圖S1E）。代謝物3#（m/z414.0934）在9.16 min 處出峰，此化合物由母體化合物甲基羥基化反應(yīng)形成代謝物M039 后進(jìn)一步在含Cl 苯環(huán)的鄰、間位引入羥基形成，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖碎片離子m/z70.0427 和295.1744 與此結(jié)構(gòu)中斷鍵后的結(jié)構(gòu)質(zhì)荷比一致，推斷代謝物3#為M074（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1F）。

結(jié)合物1#（m/z368.0525）在4.88 min 處出峰，此化合物由母體代謝生成代謝物M003 后，在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級(jí)質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z288.0969，因此推斷結(jié)合物1#為M071（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1G、S1H）。結(jié)合物2#（m/z460.0786）在6.94 min 處出峰，此化合物由母體經(jīng)脫氯羥基化后，酚羥基在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級(jí)質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z380.1225，推斷結(jié)合物2#為M092（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1I）。類似地，結(jié)合物3#（m/z494.0395）在7.49 min 處出峰，結(jié)合物4#（m/z510.0343）在7.88 min 處出峰，兩種化合物均由母體經(jīng)羥基化后，繼而在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級(jí)質(zhì)譜中脫硫酸基分別形成特征碎片離子m/z414.0855 和m/z430.0814，因此推斷結(jié)合物3#為M072/M060（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1J 和圖S1K）、結(jié)合物4#為M057/M090（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1L 和圖S1M）。結(jié)合物5#（m/z590.1143）在7.21 min 處出峰，此化合物由母體代發(fā)生羥基化反應(yīng)后，在葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合生成葡萄糖醛酸絡(luò)合物，二級(jí)質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z414.0852，因此推斷結(jié)合物5#為M035/M045（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1N）。

本研究初步鑒定獲得3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物，首次在斑馬魚(yú)體內(nèi)鑒定出了羥基化代謝物M074 和葡萄糖醛酸絡(luò)合物M035、M045 以及硫酸酯化合物M057、M071。代謝物M003 被報(bào)道為氯氟醚菌唑在地表水和沉積物中的主要代謝產(chǎn)物，而M016/M017 被報(bào)道為大鼠體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物[7]，并鑒定出主要Ⅱ相代謝物M072 為硫酸酯化合物[7]。根據(jù)質(zhì)譜分析獲得的代謝產(chǎn)物信息，進(jìn)一步推測(cè)了氯氟醚菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)可能的代謝途徑（圖3）。結(jié)果表明，氯氟醚菌唑的羥基化作用為主要的Ⅰ相代謝途徑，進(jìn)而在磺基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成水溶性更強(qiáng)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物而排出體外。

圖3 氯氟醚菌唑在動(dòng)物代謝中的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑。圖中虛線箭頭標(biāo)注的產(chǎn)物為推斷的可能產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，但實(shí)際樣品中未檢測(cè)到Fig.3 Phase Ⅰand phase Ⅱmetabolic pathways of mefentrifluconazole in animals.The products labeled with dashed arrows in the figure are inferred possible intermediates that are not detected in the actual samples

3 結(jié)論

本研究探究了氯氟醚菌唑?qū)λ唏R魚(yú)的對(duì)映選擇性毒性及富集代謝行為。氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚(yú)為中等毒性，在斑馬魚(yú)體內(nèi)屬于低富集農(nóng)藥，R-氯氟醚菌唑優(yōu)先被富集；初步鑒定獲得3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物，其中，羥基化代謝物M074 和葡萄糖醛酸絡(luò)合物M035、M045 以及硫酸酯化合物M057、M071 為首次鑒定。羥基化作用為其主要的Ⅰ相代謝途徑，進(jìn)而在磺基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成水溶性更強(qiáng)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物而排出體外。本研究可為氯氟醚菌唑?qū)λh(huán)境中的生物安全及人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考依據(jù)，但推測(cè)的代謝產(chǎn)物需要進(jìn)一步驗(yàn)證，代謝物的毒性有待進(jìn)一步了解。

支持信息

Supporting Information

圖S1 氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.S1 MS2 spectra of mefentrifluconazole and its metabolites in animals

表S2 氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息Table S2 Information of mass spectrometric data for mefentrifluconazole and its metabolites