王應璇 羅 鑫 羅泓楊 劉太祥

甲狀腺相關(guān)眼病(TAO)是眼眶病中最常見的疾病之一,在成年人中的發(fā)病率約為20%。這種疾病不僅影響患者的外觀容貌,而且由于突眼、復視、角膜暴露、視神經(jīng)受壓導致視力損害甚至失明,從而嚴重影響患者的工作和生活,給患者帶來極大的痛苦[1-2]。目前TAO患者眼外肌肥大的原因仍然未知,膠原蛋白的代謝異?？赡芘c此有關(guān)。熱休克蛋白47(HSP47)是一種原膠原蛋白/膠原蛋白特異性分子伴侶蛋白,是合成、分泌成熟穩(wěn)定膠原不可或缺的分子伴侶,它幾乎可以在所有合成膠原的細胞中表達[3-5]。HSP47是調(diào)節(jié)組織中膠原含量變化的關(guān)鍵因素,其過表達導致了膠原異常累積使得組織纖維化。臨床上,一些疾病導致器官纖維化的直接原因就是HSP47的異常表達[6-8]。我們課題組前期實驗[9]已證明,TAO患者眼球球后脂肪組織中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原蛋白和HSP47的表達高于普通患者,纖維化程度也更高。因此,我們擬進一步探索Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原蛋白和HSP47在TAO 患者眼外肌中表達的特點,以及其是否在TAO患者眼外肌纖維化病理過程中發(fā)揮著作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象和標本采集

1.1.1 患者特征

2019年5月至2019年9月,遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科與中山大學眼科中心合作,經(jīng)過雙方同意后收集當時就診于中山大學眼科中心的靜止期 TAO患者4例右眼眼外肌為TAO組(n=4),患者均明確診斷為 TAO 且服用過激素治療,但不能改善患者眼部癥狀,需行眼眶減壓手術(shù)解除眼部癥狀,緩解眼部不適,分別標記為A、B、C、D。由于倫理原因,正常人眼外肌組織無法獲取。因此,同期選擇在遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科行斜視矯正手術(shù)的共同性外斜視患者4例右眼眼外肌為對照組(n=4),其中明確排除了TAO和Graves病,分別標記為a、b、c、d。

1.1.2 采集眼外肌組織

通過手術(shù)切除并收集患者眼外肌樣本,用液氮快速冷凍后儲存在-80 ℃的冰箱中。冷凍后的組織用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)及Western blot檢測。其余的組織被固定在40 g·L-1多聚甲醛中進行Masson染色和HE染色。

本研究流程符合《赫爾辛基宣言》原則,經(jīng)遵義醫(yī)科大學倫理委員會審核批準[倫理審查編號:(2018)1-143號]。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 Masson染色觀察兩組眼外肌中膠原纖維及肌纖維

使用分級乙醇對兩組眼外肌均進行脫水處理,然后將其嵌入石蠟中。石蠟凝固后,將標本按4 μm的厚度切片,并在干燥箱中干燥。石蠟切片脫蠟后用重鉻酸鉀、磺化鐵、地衣紅、磷鉬酸和苯胺藍染色。用冰醋酸和無水乙醇對染色的切片進行分化。最后,切片用無水乙醇和二甲苯處理,然后,用中性樹膠密封對樣品進行拍照并通過光鏡進行分析。

1.3 HE染色觀察兩組眼外肌及細胞的形態(tài)

使用分級乙醇對兩組眼外肌進行脫水處理,然后將其嵌入石蠟中。石蠟凝固后,將標本按4 μm的厚度切片,并在干燥箱中干燥。石蠟切片脫蠟后用蘇木精染色細胞核、伊紅染色細胞質(zhì)。切片用無水乙醇和二甲苯處理,然后用中性膠密封對樣品進行拍照并通過光鏡進行分析。

1.4 Western blot檢測兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表達

在清洗和機械切割眼外肌后,使用RIPA裂解緩沖液提取組織樣品的總蛋白。在40 V的電壓下進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)4～5 h,當溴酚藍用完時停止,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到電泳槽中。與一抗在4 ℃下孵育過夜,然后清洗膜,用二抗在室溫下孵育1.5 h。用化學發(fā)光法檢測蛋白條帶后,用ImageJ軟件測量蛋白的灰度值,對蛋白條帶進行灰度值分析,分別以GAPDH為內(nèi)參,計算兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的相對表達量。

1.5 qRT-PCR檢測兩組眼外肌中膠原蛋白 (Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ 型)和HSP47的mRNA 表達

利用Trizol試劑對兩組眼外肌樣本總RNA進行充分裂解,提出總RNA。經(jīng)純度鑒定和純度測定后取出。兩步法RT-PCR法反應合成cDNA(30 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min,85 ℃ 10 min)。按說明書進行qPCR(20 μL體系:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 32 s,共40個循環(huán))。每個樣本重復3次,采用 2-ΔΔCt法計算,取3次的平均值為兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 29.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用Pearson相關(guān)分析兩組眼外肌中HSP47與膠原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)的相關(guān)性。檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組眼外肌中膠原纖維及肌纖維

經(jīng)Masson染色的組織切片顯示,TAO組與對照組中均顯示大量膠原纖維,但對照組眼外肌形態(tài)模糊,膠原纖維分布較散亂;而TAO組眼外肌形態(tài)較清晰,膠原纖維排列較密集(圖1)。

黑色箭頭所指呈藍色的纖維為膠原纖維,綠色箭頭所指呈紅色的纖維為肌纖維。圖1 對照組 (A)與 TAO 組(B)眼外肌的Masson 染色結(jié)果(×400)

2.2 兩組眼外肌及細胞的形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示,對照組眼外肌形態(tài)不清,肌細胞少見,排列紊亂無規(guī)則;TAO組眼外肌結(jié)構(gòu)尚存在,形態(tài)較清晰,肌纖維數(shù)量高于對照組,分布較為集中,排列比較規(guī)則,橫截面積大小不一(圖2)。

黑色箭頭所指呈紅色且大小不一的橢圓形組織為眼外肌肌纖維的橫截面。圖2 對照組 (A)與TAO組 (B)眼外肌的HE染色結(jié)果(×100)

2.3 兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表達

Western blot檢測結(jié)果顯示,兩組眼外肌均有膠原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表達。但對照組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的相對表達量均高于 TAO 組(均為P<0.05)。進一步行Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),兩組眼外肌中HSP47與膠原蛋白Ⅰ型(r=0.864,P<0.01)、膠原蛋白Ⅲ型(r=0.903,P<0.01)、膠原蛋白Ⅴ型(r=0.896,P<0.01)的蛋白表達均呈正相關(guān)(圖3)。

注:與對照組比較,*P<0.05。圖3 TAO組與對照組眼外肌中膠原蛋白和HSP47表達

2.4 兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,TAO組與對照組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 TAO組與對照組眼外肌中膠原蛋白和HSP47的mRNA相對表達量

3 討論

TAO是一種常見的自身免疫性疾病。約85%的患者在其病程的18個月內(nèi)就會出現(xiàn)眼部體征和癥狀[10]。TAO病變進程中,主要有眼眶成纖維細胞增生,細胞外基質(zhì)堆積,脂肪細胞的分化、增生等導致了眶周組織水腫、眼外肌肥大、眼眶軟組織容積擴大等[11-12]。眼眶成纖維細胞是TAO病理過程中的關(guān)鍵效應細胞[13-14],對炎癥細胞因子異常敏感,其活化是導致TAO眼眶組織增生、纖維化的主要原因[15-18]。

纖維化的過程往往與細胞外基質(zhì)異常堆積密切相關(guān)。減少細胞外基質(zhì)的積累可能會緩解TAO患者的眼部不適感與臨床癥狀,但細胞外基質(zhì)異常積累的機制目前尚不清楚。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分,其代謝異常可能導致細胞外基質(zhì)的積累,有學者已經(jīng)在纖維化的肺組織中發(fā)現(xiàn)大量的膠原蛋白和細胞外基質(zhì)沉積[19]。HSP47是特異性分子伴侶蛋白,不僅可以在所有合成膠原的細胞中表達,還具有獨特的底物特異性,能識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膠原蛋白Gly-x-y序列中的Pro-Arg-Gly序列,尤其是精氨酸,它與新合成的前膠原結(jié)合,維持膠原蛋白三螺旋的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[20]。Naitoh等[21]報道,瘢痕組織中除了Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白mRNA較正常組織高20倍外,HSP47在mRNA和蛋白水平也分別高了8倍和16倍。細胞外膠原含量亦減少。本研究結(jié)果顯示,兩組眼外肌中不僅有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原和HSP47的mRNA和蛋白表達,且HSP47的蛋白表達與Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原的蛋白表達呈正相關(guān)。結(jié)合Masoon染色和HE染色結(jié)果,蛋白表達相對量較高的一組纖維化程度也較嚴重,提示了組織的纖維化程度與HSP47以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原的蛋白表達相一致。因此,我們推測TAO患者的眼外肌纖維化可能與HSP47的過表達及膠原的異常堆積有關(guān)。

已有大量相關(guān)文獻報道,在光鏡或是病理切片下觀察到的正常眼外肌的肌纖維均勻分布,且大小、形態(tài)清晰正常,走行一致,排列整齊規(guī)則,間質(zhì)成分較少,未見增生的纖維組織[22-24];而在部分共同性斜視眼外肌病理切片中則僅可見成熟的纖維膠原組織或結(jié)締組織,未見或極少肌纖維可見,組織排列紊亂,膠原明顯增多[25],本研究的Masoon染色和HE染色結(jié)果一致,對照組的眼外肌組織形態(tài)不清,肌細胞少見,排列紊亂無規(guī)則。而TAO組的結(jié)果則與胡依博等[26]研究結(jié)果相似:表現(xiàn)為眼外肌的肌腹肥大,肌纖維橫斷面肥大,大小不均勻,不規(guī)則樣改變,而部分肌纖維邊界不清。本研究中Masoon染色結(jié)果顯示,兩組眼外肌所表現(xiàn)出的纖維化程度差異同Western blot中所示HSP47以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原蛋白相對表達量的差異相對一致,即組織的纖維化程度同其內(nèi)HSP47以及蛋白的相對表達量差異情況相一致,蛋白表達相對較高的一組纖維化程度也較嚴重。有報道稱HSP47在壓力性刺激下的表達會隨著壓力的增高而增加[27],而正是由于眶周組織的不斷增生導致了TAO患者眶壓增加。那么隨著TAO病程的進展,HSP47是否會也隨著眶壓升高而表達增加目前仍需要進一步的研究。

對于本研究中出現(xiàn)qRT-PCR檢測與Western blot以及Masoon染色結(jié)果不一致,我們推測這可能是由于以下原因所導致:(1)基因表達可分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平,即mRNA水平和蛋白水平。(2)轉(zhuǎn)錄后存在加工,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯、翻譯后加工以及修飾好幾個層面。所以轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全一致,且這種調(diào)節(jié)在不同蛋白質(zhì)之間存在差異。(3)mRNA與蛋白質(zhì)的半衰期不同,mRNA極易降解,在組織內(nèi)存在時間較短,而翻譯成蛋白質(zhì)后性質(zhì)較穩(wěn)定[28]。 除以上三點外還可能與患者在術(shù)前進行過激素處理有關(guān),研究顯示,在大劑量的甲基強的松龍的作用下,膠原及IL-1、IL-2、IL-4等炎癥因子的表達會下降,而HSP47的mRNA 相對表達量也會隨之下降[29-33],而HSP47表達下降可能進一步導致膠原蛋白的mRNA下降;但在短期內(nèi)并未影響蛋白的表達。最終導致qRT-PCR實驗結(jié)果與Western blot以及Masoon染色結(jié)果不一致。

4 結(jié)論

HSP47可在TAO患者眼外肌中表達;對照組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的表達高于TAO組,纖維化程度也更高;兩組眼外肌中的HSP47與兩組眼外肌中膠原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)蛋白表達均呈正相關(guān),所以眼外肌的纖維化可能與HSP47表達有關(guān)。但由于受倫理所限沒有采用正常人眼外肌作為對照組,所以還需要進一步通過選擇更佳的對照組進行全面的驗證。