程新潮 曹 瑾 楊 潔 呂旭東

角膜新生血管引起的角膜病變不僅是眼科最常見(jiàn)的致盲原因之一,而且是角膜移植術(shù)后患者視力喪失和免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素,角膜新生血管可由外傷、病原體感染、化學(xué)灼傷等因素誘導(dǎo),與角膜損傷后促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡被打破有關(guān)[1]。目前,盡管已有非甾體類抗炎藥物、光動(dòng)力療法、激光光凝等多種角膜新生血管治療方案,但治療效果仍十分有限,且具有一定副作用[2]。因此,積極探索角膜新生血管的發(fā)病機(jī)制并尋找抑制角膜新生血管生成的作用靶點(diǎn),對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的防治藥物具有重要意義。越來(lái)越多的研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)、微小RNA(miRNA)等非編碼RNA在角膜新生血管的生成中發(fā)揮重要作用,且其可通過(guò)靶向多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)眼部血管生成[3-4]。據(jù)報(bào)道,LncRNA核旁斑組裝轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)在角膜新生血管大鼠中表達(dá)上調(diào),可靶向miR-1246誘導(dǎo)核因子κB介導(dǎo)的炎癥因子分泌,從而促進(jìn)角膜新生血管進(jìn)展[5]。但LncRNA NEAT1在角膜新生血管中的作用機(jī)制仍未明確。生物信息學(xué)分析顯示,miR-505-3p與LncRNA NEAT1存在靶向結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)可能是miR-505-3p的下游靶基因之一。此外,角膜新生血管組織中miR-505-3p表達(dá)下調(diào),而VEGFA表達(dá)上調(diào),且miR-505-3p/VEGFA軸可在LncRNA TUG1的靶向作用下參與調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的血管生成[6]。然而,LncRNA NEAT1是否可通過(guò)調(diào)控miR-505-3p/VEGFA軸影響角膜新生血管進(jìn)展尚有待闡明?；诖?本研究構(gòu)建了堿燒傷大鼠角膜新生血管模型,旨在探討LncRNA NEAT1對(duì)堿燒傷后角膜新生血管的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠144只(均選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼),6～7周齡,體重(210±20)g,購(gòu)自北京北方艾特生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2020-0005],在溫度(24±1)℃、相對(duì)濕度(55±5)%、12 h/12 h光暗循環(huán)以及自由攝食和飲水的條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠進(jìn)行裂隙燈檢查排除眼部病變。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》中相關(guān)要求,并經(jīng)咸寧市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):202201-073)。

1.1.2 細(xì)胞

大鼠角膜上皮細(xì)胞購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁融合后消化并傳代,取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑及儀器

短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾LncRNA NEAT1(sh-NEAT1)及其陰性對(duì)照(sh-NC)、miR-505-3p拮抗劑(miR-505-3p antagomir)及其陰性對(duì)照(antagomir-NC)、野生型LncRNA NEAT1/VEGFA(WT-NEAT1/WT-VEGFA)和突變型LncRNA NEAT1/VEGFA(MUT-NEAT1/MUT-VEGFA)報(bào)告質(zhì)粒、miR-505-3p模擬物(miR-505-3p mimic)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)中所用引物均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗大鼠VEGFA、CD31、β-actin及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。裂隙燈顯微鏡及攝像系統(tǒng)購(gòu)自卡爾蔡司(中國(guó))有限公司;qRT-PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司;生物顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 堿燒傷大鼠模型構(gòu)建及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后眼部滴加左氧氟沙星滴眼液預(yù)防感染,24 h后隨機(jī)選取24只大鼠作為對(duì)照組,其余大鼠右眼構(gòu)建角膜堿燒傷模型[7-8],具體方法為:20 g·L-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼3次進(jìn)行眼部麻醉,直徑3 mm的圓形濾紙片于1 mol·L-1NaOH溶液中浸泡10 s,隨后將濾紙片貼敷于大鼠右眼角膜中央40 s,之后使用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊2 min,若角膜中央出現(xiàn)灰白色斑且虹膜紋理模糊,則表明造模成功。對(duì)照組大鼠除用生理鹽水代替NaOH溶液外,其余操作同造模大鼠。造模成功的120只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、sh-NC組、sh-NEAT1組、sh-NEAT1+antagomir-NC組和sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組,每組24只。其中,sh-NC組、sh-NEAT1組大鼠玻璃體內(nèi)注射4 μL sh-NC或sh-NEAT1;sh-NEAT1+antagomir-NC組、sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠玻璃體內(nèi)同時(shí)注射sh-NEAT1與antagomir-NC或miR-505-3p antagomir,共4 μL;對(duì)照組、模型組大鼠玻璃體內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠角膜新生血管的定量分析

于堿燒傷后3 d、5 d、7 d使用裂隙燈顯微鏡觀察大鼠角膜新生血管情況,并記錄自角膜緣長(zhǎng)出的新生血管長(zhǎng)度(以連續(xù)彎曲度最小時(shí),朝向角膜中央生長(zhǎng)的最長(zhǎng)血管的垂直長(zhǎng)度為準(zhǔn))及數(shù)量。根據(jù)公式S=C/12×π×[r2-(r-l)2](其中,S為角膜新生血管面積,C為新生血管侵及角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù),r為角膜半徑,l為新生血管長(zhǎng)度)計(jì)算角膜新生血管面積。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)大鼠角膜中LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA mRNA表達(dá)

堿燒傷后7 d,每組隨機(jī)取6只大鼠采用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死,摘取右眼角膜,Trizol試劑提取角膜中總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后以cDNA為模板配制qRT-PCR反應(yīng)體系,在qRT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列:LncRNA NEAT1上游引物為5’-TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG-3’,下游引物為5’-TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC-3’;miR-505-3p上游引物為5’-CTACGTGGGTCACCCCCTC-3’,下游引物為5’-CCAAAGGAGACCTCGTAGT-3’;VEGFA上游引物為5’-GGGAGCAGAAAGCCCATGAA-3’,下游引物為5’-GCTGGCTTTGGTGAGGTTTG-3’;β-actin上游引物為5’-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3’,下游引物為5’-GTCATCCATGGCGAACTGGTG-3’;U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.4 HE染色觀察大鼠角膜病理學(xué)改變

堿燒傷后7 d,每組隨機(jī)取6只大鼠采用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死,摘取右眼角膜,40 g·L-1多聚甲醛固定24 h后制備常規(guī)石蠟切片(厚度為4 μm),切片經(jīng)二甲苯脫蠟,遞減濃度梯度乙醇水化后蘇木素染色10 min、伊紅染色30 s,遞增濃度梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片,于顯微鏡下觀察各組大鼠角膜病理學(xué)改變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠角膜中CD31表達(dá)

堿燒傷后7 d,每組隨機(jī)取6只大鼠采用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死,摘取右眼角膜,40 g·L-1多聚甲醛固定24 h后制備常規(guī)石蠟切片(厚度為4 μm),切片脫蠟至水后采用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原,正常血清封閉后添加一抗(CD31稀釋度為1：50;陰性對(duì)照使用PBS代替一抗)4 ℃孵育過(guò)夜,生物素標(biāo)記二抗37 ℃孵育2 h,DAB顯色、蘇木素復(fù)染,于顯微鏡下觀察并拍照。Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性染色的積分光密度(IOD),計(jì)算平均IOD(MIOD),MIOD=IOD/選擇面積,MIOD值越大表示CD31蛋白表達(dá)量越高。

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白表達(dá)

堿燒傷后7 d,每組剩余的6只大鼠采用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死,摘取右眼角膜,使用RIPA裂解液提取角膜總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度后SDS-PAGE凝膠電泳分離等量變性蛋白,并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,50 g·L-1BSA室溫封閉1 h后,在一抗(VEGFA稀釋度為1：500;CD31稀釋度為1：1 000;β-actin稀釋度為1：2 000)中4 ℃孵育過(guò)夜,次日充分洗滌后在二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG,稀釋度為1：50 000)中室溫孵育1.5 h,ECL顯色,Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析各蛋白條帶灰度,計(jì)算VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA間靶向關(guān)系

Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)miR-505-3p與LncRNA NEAT1、VEGFA的潛在結(jié)合位點(diǎn),并將LncRNA NEAT1、VEGFA與miR-505-3p結(jié)合的序列片段進(jìn)行突變,構(gòu)建WT-NEAT1、WT-VEGFA和MUT-NEAT1、MUT-VEGFA熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。大鼠角膜上皮細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中,培養(yǎng)至70%融合時(shí),采用Lipofectamine 3000將WT-NEAT1、WT-VEGFA和MUT-NEAT1、MUT-VEGFA熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-505-3p mimic(miR-505-3p mimic組)、miR-NC(miR-NC組)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(每種處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔),轉(zhuǎn)染48 h后參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積比較

堿燒傷后3 d、5 d、7 d,對(duì)照組大鼠無(wú)角膜新生血管。堿燒傷后3 d、5 d、7 d,與對(duì)照組比較,模型組大鼠角膜新生血管面積均增加(均為P<0.05);與sh-NC組比較,sh-NEAT1組大鼠堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積均減少(均為P<0.05);與sh-NEAT1+antagomir-NC組比較,sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積均增加(均為P<0.05);模型組與sh-NC組、sh-NEAT1組與sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積比較 (n=6)

2.2 各組大鼠角膜中LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

堿燒傷后7 d,與對(duì)照組比較,模型組大鼠角膜中LncRNA NEAT1、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高,miR-505-3p相對(duì)表達(dá)水平降低(均為P<0.05);與sh-NC組比較,sh-NEAT1組大鼠角膜中LncRNA NEAT1、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低,miR-505-3p相對(duì)表達(dá)水平升高(均為P<0.05);與sh-NEAT1+antagomir-NC組比較,sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠角膜中VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,miR-505-3p相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);模型組與sh-NC組、sh-NEAT1組與sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠角膜中LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表2)。

表2 各組大鼠角膜中LncRNA NEAT1、miR-505-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 (n=6)

2.3 各組大鼠角膜病理學(xué)改變

堿燒傷后7 d,對(duì)照組大鼠角膜結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞無(wú)破壞;模型組大鼠角膜組織結(jié)構(gòu)紊亂,可見(jiàn)中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),上皮細(xì)胞缺損;sh-NC組大鼠角膜組織病理學(xué)改變與模型組相似;與sh-NC組比較,sh-NEAT1組大鼠角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞缺損等病理學(xué)損傷均有所改善;sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠角膜組織病理學(xué)改變與sh-NEAT1組相似;與sh-NEAT1+antagomir-NC組比較,sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠角膜組織病理學(xué)損傷加重(圖1)。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:sh-NC組;D:sh-NEAT1組;E:sh-NEAT1+antagomir-NC組;F:sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組。圖1 HE染色示各組大鼠角膜病理學(xué)改變

2.4 各組大鼠角膜中CD31表達(dá)情況比較

對(duì)照組大鼠角膜組織中CD31呈陰性表達(dá)(MIOD 為0)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平(MIOD為0.89±0.08)升高(P<0.05);與sh-NC組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平(MIOD為0.88±0.07)比較,sh-NEAT1組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平(MIOD為0.54±0.06)降低(P<0.05);與sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平(MIOD為0.55±0.05)比較,sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平(MIOD為 0.81±0.07)升高(P<0.05);模型組與sh-NC組、sh-NEAT1組與sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠角膜中CD31表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖2)。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:sh-NC組;D:sh-NEAT1組;E:sh-NEAT1+antagomir-NC組;F:sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組。圖2 免疫組織化學(xué)染色示各組大鼠角膜CD31表達(dá)情況

2.5 各組大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高(均為P<0.05);與sh-NC組比較,sh-NEAT1組大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低(均為P<0.05);與sh-NEAT1+antagomir-NC組比較,sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高(均為P<0.05);模型組與sh-NC組、sh-NEAT1組與sh-NEAT1+antagomir-NC組大鼠角膜中VEGFA、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖3、表3)。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:sh-NC組;D:sh-NEAT1組;E:sh-NEAT1+antagomir-NC組;F:sh-NEAT1+miR-505-3p antagomir組。圖3 Western blot檢測(cè)示各組大鼠角膜VEGFA、CD31蛋白表達(dá)情況

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示,miR-505-3p與LncRNA NEAT1、VEGFA均存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。

圖4 miR-505-3p與LncRNA NEAT1、VEGFA的靶向結(jié)合位點(diǎn)

與miR-NC組比較,miR-505-3p mimic組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-NEAT1、WT-VEGFA的大鼠角膜上皮細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性均降低(均為P<0.05),而共轉(zhuǎn)染MUT-NEAT1、MUT-VEGFA的大鼠角膜上皮細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表4)。

表4 各組大鼠角膜上皮細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較 (n=6)

3 討論

目前,角膜新生血管仍是一種嚴(yán)重威脅視力的疾病,可導(dǎo)致角膜水腫、持續(xù)性炎癥和視力喪失,故探尋抑制血管生成因子合成與分泌的分子途徑至關(guān)重要[9]。有研究表明,LncRNA除參與惡性腫瘤等疾病的血管生成外,與角膜新生血管中血管生成亦密切相關(guān),例如,LncRNA Meg3在堿燒傷模型小鼠和VEGF誘導(dǎo)的HUVECs中過(guò)表達(dá),而抑制LncRNA Meg3表達(dá)可降低角膜損傷程度及血管生成標(biāo)志物VEGFA和CD31表達(dá),同時(shí)減少VEGF誘導(dǎo)的HUVECs中血管生成[10];LncRNA SNHG1敲低通過(guò)調(diào)控miR-195-5p/VEGF-A抑制角膜血管生成[3];LncRNA H19通過(guò)抑制miR-29c并上調(diào)VEGFA來(lái)增強(qiáng)角膜新生血管進(jìn)展[11]。因此,靶向調(diào)節(jié)LncRNA可能是治療角膜新生血管的一種途徑。

多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,LncRNA NEAT1是一種促進(jìn)血管生成的LncRNA,可通過(guò)靶向miR-495-3p在燒傷敗血癥發(fā)生過(guò)程中調(diào)節(jié)血管生成[12],通過(guò)miR-125a-5p/VEGF途徑促進(jìn)肝癌血管生成[13]。本研究中,堿燒傷大鼠角膜中LncRNA NEAT1表達(dá)水平、新生血管面積、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31蛋白表達(dá)水平均顯著升高,提示LncRNA NEAT1參與堿燒傷大鼠角膜新生血管的生成,這與Bai等[5]報(bào)道的LncRNA NEAT1可促進(jìn)炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)角膜新生血管形成相一致;且堿燒傷大鼠角膜組織存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞缺損等病理學(xué)損傷,而注射sh-NEAT1干擾堿燒傷大鼠角膜中LncRNA NEAT1表達(dá)后,角膜中LncRNA NEAT1表達(dá)水平降低的同時(shí),角膜新生血管面積和CD31蛋白表達(dá)水平亦顯著降低,角膜組織病理學(xué)損傷有所改善,提示干擾 LncRNA NEAT1可能抑制堿燒傷大鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和角膜新生血管生成。

眾所周知,促血管生成因子和抑制血管生成因子的失衡是角膜新生血管形成的一個(gè)最主要因素,角膜新生血管發(fā)生時(shí)VEGF表達(dá)上調(diào),而應(yīng)用VEGF拮抗劑也是目前防治角膜新生血管中血管生成的策略之一[14]。miRNA在角膜新生血管形成中的作用亦日益受到重視,且多個(gè)miRNA分子與VEGF密切相關(guān)[15-16]。VEGF家族成員VEGFA已被報(bào)道在角膜新生血管形成有關(guān)的LncRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中作為mRNA扮演著關(guān)鍵角色[3,6,10-11]。miR-505-3p是一種研究較多的腫瘤抑制因子,可作為L(zhǎng)ncRNA的作用靶點(diǎn)參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展[17-18]。本研究結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,模型組大鼠角膜中miR-505-3p相對(duì)表達(dá)水平降低,VEGFA mRNA和蛋白表達(dá)升高,表明miR-505-3p、VEGFA均參與堿燒傷大鼠角膜新生血管生成,提示miR-505-3p下調(diào)、VEGFA上調(diào)可促進(jìn)角膜新生血管生成。此外,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證顯示,大鼠角膜上皮細(xì)胞中miR-505-3p與LncRNA NEAT1、VEGFA均存在靶向關(guān)系;而干擾LncRNA NEAT1可上調(diào)堿燒傷大鼠角膜中miR-505-3p表達(dá)水平,并下調(diào)VEGFA mRNA和蛋白表達(dá)水平,提示干擾 LncRNA NEAT1抑制堿燒傷大鼠角膜新生血管生成的機(jī)制可能與靶向上調(diào)miR-505-3p并下調(diào)VEGFA表達(dá)有關(guān)。已有研究證實(shí),VEGFA mRNA是miR-505-3p的下游靶點(diǎn),LncRNA TUG1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-505-3p減輕對(duì)VEGFA mRNA的抑制,從而促進(jìn)VEGFA的表達(dá)和血管生成[6]。本研究進(jìn)一步在干擾LncRNA NEAT1表達(dá)基礎(chǔ)上抑制miR-505-3p表達(dá)發(fā)現(xiàn),抑制miR-505-3p表達(dá)可減弱干擾LncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)堿燒傷大鼠角膜新生血管面積和VEGFA、CD31表達(dá)水平的抑制作用,并加重角膜組織病理學(xué)損傷。該結(jié)果更加充分地表明LncRNA NEAT1可能通過(guò)調(diào)控miR-505-3p/VEGFA軸促進(jìn)堿燒傷大鼠角膜新生血管生成。

4 結(jié)論

干擾LncRNA NEAT1可能通過(guò)靶向上調(diào)miR-505-3p并下調(diào)VEGFA表達(dá),抑制堿燒傷大鼠角膜新生血管生成,靶向抑制LncRNA NEAT1可能是角膜新生血管的一個(gè)潛在治療方法。本研究為角膜新生血管的發(fā)病機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)選擇提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),但本研究?jī)H通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步探索,仍有待通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA NEAT1/miR-505-3p/VEGFA在角膜新生血管中的作用機(jī)制。