邢 巖 張麗梅 趙圓圓 侯思遠 金 鋒

碘酸鈉(NaIO3)是一種氧化劑,可特異性損傷視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞,繼而引起視網(wǎng)膜光感受器受損。研究表明,NaIO3所引起的視網(wǎng)膜退行性改變與干性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的病理表現(xiàn)類似[1-2]。NaIO3引起的視網(wǎng)膜損傷在許多哺乳動物,如羊、兔、大鼠和小鼠等都得到了驗證。用鼠建立模型,具有良好的可復制性,應(yīng)用最為廣泛[1]。用 20～50 mg·kg-1NaIO3給予大鼠或小鼠尾靜脈注射,可引起實驗個體視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的不可逆性損傷,且損傷具有時間依賴性[1-3]。

NaIO3誘導RPE細胞損傷涉及多個機制,包括細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、壞死/凋亡信號激活、炎癥反應(yīng)等[4];該過程中視網(wǎng)膜退行性改變的具體機制目前并未完全清楚。本研究采用NaIO3誘導產(chǎn)生大鼠干性AMD病變模型,采用蛋白質(zhì)組學對大鼠視網(wǎng)膜組織進行分析,探討NaIO3誘導大鼠視網(wǎng)膜退行性改變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

取雄性SD大鼠20只(中國食品藥品檢定研究所提供),體重180～200 g,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所SPF級動物實驗室內(nèi)。隨機分為對照組和模型組,每組10只。本研究動物處理遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.1.2 試劑與儀器

NaIO3(上海麥克林生化科技有限公司),HE染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),總蛋白定量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),4-羥乙基哌嗪乙磺酸、 碘乙酰胺(美國Sigma公司),蛋白酶抑制劑 PMSF(瑞士Roche公司),肽段濃度測定試劑盒(美國Thermo公司)。D430小動物視覺電生理檢測儀(美國Diagnosys公司),Orbitrap Fusion Tribrid 質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,給予模型組大鼠30 mg·kg-1NaIO3尾靜脈注射,對照組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水,繼續(xù)飼養(yǎng)21 d。第22天,各組大鼠稱重,檢測視網(wǎng)膜電圖(ERG),之后過量麻醉處死大鼠,取眼球。實驗過程中無大鼠意外死亡。

1.2.2 ERG檢測

實驗前1天各組大鼠提前進行12 h暗適應(yīng)。檢測時用復方托吡卡胺滴眼液雙眼散瞳20 min,采用鹽酸氯胺酮(100 mg·kg-1)和氨酸賽拉嗪(15 mg·kg-1)混合麻醉劑進行肌注全身麻醉。使用動物保溫裝置,采用大鼠專用環(huán)形角膜電極,標準閃光刺激誘發(fā)視網(wǎng)膜綜合電位[5]。根據(jù)國際臨床視覺電生理協(xié)會制定的國際標準檢查項目,進行ERG檢測,包括以下五項,分別為暗適應(yīng)0.01ERG、暗適應(yīng)3.0ERG、暗適應(yīng)3.0振蕩電位以及明適應(yīng)3.0ERG和明適應(yīng)3.0閃爍光反應(yīng)b波振幅。以上操作過程均在暗室紅光下進行。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織病理學觀察

采用氯胺酮過量麻醉法處死大鼠,完整摘除眼球。每組取4只大鼠左側(cè)眼球,采用4 g·L-1多聚甲醛固定 24 h,梯度酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,沿平行眼軸方向進行切片,切片厚 4 μm,脫蠟、HE 染色、脫水、透明并封片。

1.2.4 視網(wǎng)膜組織SOD、CAT活性和MDA含量檢測

每組隨機選出8只大鼠右眼眼球,在冰盤上剝離出視網(wǎng)膜,冰浴勻漿2 500 r·min-1離心15 min,取上清液,根據(jù)試劑盒說明書檢測SOD、CAT活性和MDA含量。

1.2.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

每組隨機取3份大鼠左側(cè)視網(wǎng)膜組織,進行非標定量蛋白組分析[6]。使用裝有在線Easy-nLC1200納米HPLC系統(tǒng)(Thermo)的Orbitrap Fusion Tribrid液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析樣品,注入的樣品在反相nano-HPLC C18柱上分離,流速為600 nL·min-1,電噴霧電壓為2.2 kV。通過DDA MS/MS采集模式分析樣品。在m/z 250-1800的范圍內(nèi)進行Orbitrap全掃描。每個掃描中前20個最強的離子被自動選擇進行Orbitrap二級MS HCD碎裂,且碎裂能力為32%。其他的質(zhì)譜條件是:AGC目標為3×106離子用于全掃描,2×105離子用于MS/MS掃描;全掃描的最大注射時間為35 ms,MS/MS掃描的最大注射時間為80 ms,并采用動態(tài)排除18 s。采用PEAKS搜索引擎進行搜庫分析。通過 DAVID 在線分析軟件(https://david.ncifcrf.gov)進行差異表達蛋白質(zhì)的基因本體論(GO)和京都基因百科全書(KEGG)富集分析。篩選FC (fold change)>2且P<0.05作為差異蛋白。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,兩組間指標比較采用成組設(shè)計t檢驗。檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠ERG檢測結(jié)果

ERG檢測結(jié)果顯示,模型組大鼠暗適應(yīng) 0.01ERG、暗適應(yīng)3.0ERG、暗適應(yīng)3.0振蕩電位以及明適應(yīng)3.0ERG和明適應(yīng)3.0閃爍光反應(yīng)b波振幅分別比對照組降低79.98%、81.64%、76.08%、61.68%、57.25%,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(表1)。這表明 NaIO3可引起顯著而廣泛的視網(wǎng)膜病變,造成視網(wǎng)膜功能下降。

表1 兩組大鼠ERG檢測結(jié)果

2.2 兩組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰,層次分明,胞核排列整齊;模型組大鼠視網(wǎng)膜組織的改變體現(xiàn)在視網(wǎng)膜全層。與對照組相比,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織細胞層數(shù)減少,尤其是外核層、內(nèi)核層結(jié)構(gòu)紊亂,呈現(xiàn)明顯的波浪形變化(圖1)。ERG 檢測結(jié)果和HE染色結(jié)果均提示,30 mg·kg-1NaIO3尾靜脈注射誘導的大鼠干性AMD病變模型造模成功。

INL示內(nèi)核層,ONL示外核層。圖1 兩組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 兩組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT活性和MDA含量

與對照組相比,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD和CAT活性分別下降12.51%和14.08%,MDA含量增加57.96%,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。這表明NaIO3可引起視網(wǎng)膜抗氧化酶活性下降,過氧化產(chǎn)物增加(表2)。

表2 兩組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT活性和MDA含量

2.4 視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果

火山圖結(jié)果顯示,模型組與對照組相比,FC>2的蛋白質(zhì)有285個。進一步統(tǒng)計分析,P<0.05的差異蛋白有98個。和對照組相比,模型組上調(diào)蛋白有80個,下調(diào)蛋白有18個。P<0.01的上調(diào)蛋白主要有Stat3、Cd81、Adgrl2、Hspa2、Mfn2等,下調(diào)蛋白主要有Opn1mw、Rom1、Rho、Rgs9、Gnat3等(圖2)。

火山圖中顯示模型組和對照組之間98個差異蛋白的表達情況。紅色表示該蛋白在模型組相較于對照組表達上調(diào),藍色表示下調(diào),灰色表示該蛋白表達在兩組間無顯著性差異。圖2 模型組和對照組差異蛋白表達情況

KEGG分析結(jié)果顯示,差異蛋白主要富集于光轉(zhuǎn)導(phototransduction)、蛋白酶體(proteasome)、JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、細胞內(nèi)吞(endocytosis)、補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)(complement and coagulation cascades)等通路(圖3)。

縱坐標為差異蛋白作用通路的富集結(jié)果,橫坐標代表比例,圓圈大小代表該通路富集到的差異蛋白數(shù)。顏色從紅到藍代表P值從小到大的變化。圖3 模型組和對照組差異蛋白KEGG分析結(jié)果

采用GO分析進一步探究這些差異蛋白所參與的作用,結(jié)果顯示,模型組較對照組上調(diào)的80個蛋白,所參與的生物學過程在調(diào)控基因表達(positive regulation of gene expression)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、衰老(aging)以及對白細胞介素(IL)-6的細胞反應(yīng)(cellular response to interleukin-6)等方面具有顯著性。18個下調(diào)蛋白參與的生物學過程非常集中,主要表現(xiàn)在視覺感知(visual perception)、對光刺激的反應(yīng)(response to light stimulus)、光轉(zhuǎn)導(phototransduction),這些蛋白主要位于光受體外層、光受體內(nèi)層等部位,分子功能主要體現(xiàn)在光受體活性(photoreceptor activity)方面(圖4)。

縱坐標為差異蛋白所參與的生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)的富集結(jié)果,橫坐標代表比例,圓圈大小代表該條目富集到的差異蛋白數(shù)。顏色從紅到藍代表P值從小到大的變化。圖4 模型組和對照組差異蛋白GO分析結(jié)果

3 討論

本研究通過對SD大鼠給予一次性30 mg·kg-1NaIO3尾靜脈注射,成功誘導產(chǎn)生大鼠干性AMD病變模型。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激損傷是NaIO3誘導的視網(wǎng)膜色素變性的機制之一,SOD 和CAT 在視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng)中起著重要的作用[7-8]。本研究證實了NaIO3可引起視網(wǎng)膜抗氧化能力顯著下降。模型組視網(wǎng)膜抗氧化酶SOD和CAT活性均較對照組顯著下降,過氧化中間產(chǎn)物MDA水平顯著升高。

本研究兩組間表達有顯著差異的視網(wǎng)膜蛋白可能與該模型成功建立密切相關(guān),因此我們采用蛋白質(zhì)組學對其進行分析。結(jié)果表明,下調(diào)蛋白主要有Opn1mw、Rom1、Rho,集中在光轉(zhuǎn)導、視覺感知、對光刺激的反應(yīng)等生物學功能和通路上。有研究發(fā)現(xiàn),20 mg·kg-1NaIO3可引起小鼠光轉(zhuǎn)導基因的快速表達下調(diào),如Rho、Opn1mw和Pde6b;這些基因與光受體細胞功能密切相關(guān),引起光受體細胞死亡,這種變化可以導致NaIO3造模小鼠出現(xiàn)早期ERG反應(yīng)[9-10]。因此,光轉(zhuǎn)導通路異常可能與干性AMD的病理機制相關(guān)。已有研究提出,非編碼RNA在調(diào)節(jié)光轉(zhuǎn)導、視覺感知中發(fā)揮重要作用,可作為視網(wǎng)膜退行性改變的RNA療法[11],這也從另一個角度印證了光轉(zhuǎn)導通路與干性AMD的相關(guān)性。

研究認為,NaIO3可促進視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)[12]。本研究通過對差異蛋白的GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),NaIO3誘導的視網(wǎng)膜損傷與炎癥和免疫有著直接的關(guān)系。差異蛋白上調(diào)了IL-6介導的炎癥反應(yīng),主要通過JAK-STAT通路、內(nèi)吞作用、補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)通路、抗原提呈等介導。我們發(fā)現(xiàn),STAT3在模型組大鼠視網(wǎng)膜表達顯著上調(diào),而STAT3是調(diào)控JAK2/STAT3通路下游基因的主要蛋白,可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡以及免疫反應(yīng),參與啟動凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的表達[13]。干性AMD是與衰老相關(guān)的退行性疾病。JAK-STAT信號通路在衰老細胞中高度激活,IL-6等細胞外因子可通過作用于JAK受體進而活化STAT蛋白,進一步調(diào)節(jié)衰老相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[14]。Duncan等[15]對ARPE-19細胞研究顯示,JAK-STAT激活,可上調(diào)視網(wǎng)膜促炎因子TLR3的表達,他們認為抑制JAK-STAT通路可能有助于治療干性AMD。對膳食多酚眼保護作用的研究也證實了這一點,槲皮素和花青素-3-葡萄糖苷能夠通過IL-6/JAK2/STAT3抗炎通路保護RPE細胞[16]。因此本研究認為,視網(wǎng)膜炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生,JAK-STAT通路激活與干性AMD發(fā)病存在密切關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究采用30 mg·kg-1NaIO3尾靜脈注射,成功誘導大鼠干性AMD病變模型,其機制可能為NaIO3造成視網(wǎng)膜特異性氧化應(yīng)激,激活JAK-STAT和補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)通路,引發(fā)炎癥與免疫過程,同時抑制光轉(zhuǎn)導通路,由此導致視網(wǎng)膜發(fā)生病變反應(yīng)。因此降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平,抑制JAK-STAT通路,調(diào)節(jié)光轉(zhuǎn)導通路基因表達,可作為今后治療干性AMD新的思路。

致謝感謝國家蛋白質(zhì)科學中心的賈辰熙研究員和中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院的梁麗娜研究員給予本課題的支持和指導。