王思文 李鵬飛 王從玉 鮑思潔 王 勇 管懷進(jìn)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是全球中老年人失明的主要原因[1]。隨著年齡增長,體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)和自噬過程的平衡被打破,氧化損傷被認(rèn)為是ARC的主要發(fā)病機(jī)制[2]。目前,針對氧化損傷尚未有特效藥物。褪黑素是一種吲哚衍生激素,對年齡相關(guān)性眼病可能具有治療作用[3]。低濃度褪黑素可部分緩解由H2O2誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞死亡[4];通過黃色濾光片調(diào)節(jié)眼內(nèi)褪黑激素濃度可防止晶狀體過早混濁[5]。通過H2O2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證褪黑素抗氧化能力的研究目前仍較少,褪黑素在氧化損傷過程中對LECs調(diào)控的潛在作用有待補(bǔ)充。因此,本實(shí)驗(yàn)利用H2O2構(gòu)建LECs氧化損傷模型,觀察褪黑素對LECs細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及自噬的影響,探究褪黑素對LECs抗氧化的作用機(jī)制,以期為ARC的防治研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和細(xì)胞培養(yǎng)板均購自Gibco公司(美國),Hanks平衡鹽溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)和TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司(中國);CCK8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所(日本);GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗均購自ABclonal公司(中國);蛋白印跡實(shí)驗(yàn)抗體P62、Beclin-1、LC3、Bax、Bcl-2抗體均購自Abcam公司(英國)。褪黑素購自MedChemExpress公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

快速取出凍存的SRA01/04細(xì)胞并置于37 ℃水浴鍋中解凍。離心10 min后棄上清,加入新培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)重懸,并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中。置于溫度37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),使用Hanks液清洗2次,采用400 μmol·L-1的H2O2處理細(xì)胞。H2O2是常見的內(nèi)源性產(chǎn)生活性氧的造模方法,其主要造成LECs氧化損傷,該造模方法適于本研究使用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將培養(yǎng)完成的細(xì)胞隨機(jī)分組:對照組(不做任何處理)、H2O2組(采用400 μmol·L-1的H2O2處理)、DMSO+H2O2組(采用400 μmol·L-1的H2O2和0.2 μmol·L-1的DSMO處理)、褪黑素+H2O2組(采用400 μmol·L-1的H2O2和50 μmol·L-1褪黑素處理)。分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測比較。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測

將SRA01/04細(xì)胞種在96孔板上,每孔10×103個(gè)細(xì)胞,放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組設(shè)置設(shè)置6個(gè)平行孔,棄培養(yǎng)基,重新向每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8溶液(該過程需要避光);繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,用酶標(biāo)儀檢測450 nm處樣品光密度(OD)值。按上述操作步驟重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。設(shè)僅含培養(yǎng)基和CCK8的空白組,細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

將SRA01/04細(xì)胞接種于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔板中,接種密度為每孔3×104個(gè)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到60%后,將按上述分組處理方式處理后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后取出培養(yǎng)板,PBS清洗3次后,采用40 g·L-1多聚甲醛室溫固定細(xì)胞1 h,1 g·L-1TritonX-100冰上通透細(xì)胞5 min。按說明書要求配置TUNEL檢測液,每孔加入50 μL TUNEL檢測液,37 ℃孵育1 h。加入DAPI,室溫避光孵育8 min。PBS清洗3次,每次5 min,然后取出細(xì)胞爬片,封片劑封片,熒光顯微鏡下檢測。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)

將各組細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出置于冰上,使用冰浴后的PBS清洗2次,每次5 min。吸去PBS后,按1：100比例加入蛋白酶抑制劑和放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)混合的蛋白裂解液100 μL,冰上裂解后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的1.5 mL EP管中,4℃搖床裂解30 min,離心后提取蛋白上清,BCA法測蛋白濃度。凝膠電泳(80 V轉(zhuǎn)150 V)分離蛋白后采用濕性轉(zhuǎn)膜法(250 mA,2 h)將靶蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上;5 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜2 h,加入對應(yīng)條帶位置的一抗(1：1 000),置于4 ℃冰箱搖床孵育過夜。次日,采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1：10 000)室溫孵育2 h,TBST漂洗3次,每次15 min,之后于暗室內(nèi)進(jìn)行曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參,采用ImageJ計(jì)算目的蛋白(P62、Beclin-1、LC3、Bax、Bcl-2)表達(dá)的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪制圖表。各組細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較采用單因素方差分析,兩樣本間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對H2O2 誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞的保護(hù)作用

為驗(yàn)證褪黑素對SRA01/04細(xì)胞的保護(hù)作用,采用CCK8測定法測定各組SRA01/04細(xì)胞的活力。與對照組相比,H2O2組細(xì)胞活力下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與DMSO+H2O2組相比,褪黑素+H2O2組細(xì)胞活力升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。H2O2組與DMSO+H2O2組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。褪黑素減輕了H2O2誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞氧化損傷,增加了細(xì)胞活力。

2.2 褪黑素減少H2O2誘導(dǎo)SRA01/04 細(xì)胞的凋亡

為驗(yàn)證褪黑素是否通過抗凋亡作用對抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2組細(xì)胞中Bax表達(dá)水平增加, Bcl-2表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。與DMSO+H2O2組相比,褪黑素+H2O2組細(xì)胞Bax表達(dá)水平降低, Bcl-2表達(dá)水平增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(圖2)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,褪黑素減少了H2O2誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡(圖3)。

A:各組SRA01/04細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況;B:各組SRA01/04細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖;C:各組SRA01/04細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖。##P<0.01;####P<0.000 1;***P<0.001;****P<0.000 1。圖2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組SRA01/04細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 TUNEL法檢測各組SRA01/04細(xì)胞凋亡圖

2.3 褪黑素激活SRA01/04細(xì)胞的自噬能力

為研究褪黑素對SRA01/04細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及自噬,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。與對照組相比,H2O2組細(xì)胞中LC3-I、LC3-II 及P62蛋白表達(dá)水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。對照組細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)水平與H2O2組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SRA01/04細(xì)胞在H2O2干預(yù)下自噬水平受到抑制。與DMSO+H2O2組相比,褪黑素+H2O2組細(xì)胞中LC3-I、LC3-II及Beclin-1蛋白表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.000 1)。DMSO+H2O2組細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)水平與褪黑素+H2O2組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。褪黑素增強(qiáng)了H2O2干預(yù)下SRA01/04細(xì)胞的自噬能力(圖4、圖5)。

圖4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組SRA01/04細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

A:各組SRA01/04細(xì)胞P62蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖;B:各組SRA01/04細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖;C:各組SRA01/04細(xì)胞LC3-I蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖;D:各組SRA01/04細(xì)胞LC3-II蛋白表達(dá)水平比較柱狀圖。***P<0.001;****P<0.000 1;####P<0.000 1;ns:差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組SRA01/04細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果比較

3 討論

ARC是晶狀體逐漸混濁的結(jié)果[6]。LECs是晶狀體中唯一的細(xì)胞類型,在維持晶狀體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和透明度方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。LECs細(xì)胞密度隨著年齡增長呈下降趨勢[8],在此過程中,氧化損傷加劇了LECs的丟失,一旦細(xì)胞丟失達(dá)到一定程度,就會引起ARC[9]。雖然ARC形成的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,但LECs的功能障礙,如氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬被認(rèn)為是ARC發(fā)生的核心因素[10-12]。因此,自噬和細(xì)胞凋亡相關(guān)研究被認(rèn)為是治療ARC的新靶點(diǎn)研究方向 。

褪黑素由松果體在生物鐘的控制下產(chǎn)生,也在眼球的視網(wǎng)膜、睫狀體和晶狀體等位置合成,并受視網(wǎng)膜光刺激調(diào)節(jié)[13-14]。褪黑素作為抗氧化劑,通過清除自由基和刺激抗氧化防御機(jī)制的活性發(fā)揮保護(hù)作用[14-15]。褪黑素在年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變中通過抗氧化應(yīng)激增加視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞的活力[16-17]。也有少量研究報(bào)道有關(guān)褪黑素對白內(nèi)障的影響[18-19]。Abe等[20]發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠抑制新生大鼠白內(nèi)障的發(fā)生,對ARC具有潛在的治療價(jià)值。Bai等[19]研究發(fā)現(xiàn),褪黑素通過PI3K/Akt信號通路對人LECs的氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用,提示褪黑素可能對白內(nèi)障具有一定治療作用。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的形式,能夠在胚胎發(fā)育期間和成熟期清除不需要及功能障礙的細(xì)胞,維持生物體內(nèi)組織平衡[21]。細(xì)胞凋亡途徑主要由Bcl-2蛋白家族成員調(diào)節(jié)。同時(shí)Bcl-2相關(guān)的X凋亡調(diào)節(jié)劑Bax在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡啟動中起關(guān)鍵作用[22]。研究發(fā)現(xiàn),褪黑素在神經(jīng)退行性疾病中通過抗凋亡機(jī)制保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[23-26]。本研究結(jié)果顯示,褪黑素可提高H2O2誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞的活力,減輕H2O2誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞的氧化損傷程度,同時(shí)增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá),從而抑制SRA01/04細(xì)胞的凋亡。

自噬是真核細(xì)胞中高度保守的自我降解過程,可將胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì),如蛋白質(zhì)和細(xì)胞器傳遞至溶酶體進(jìn)行清除,是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)壓力的核心[27-28]。自噬功能失調(diào)可能導(dǎo)致各種年齡相關(guān)疾病,包括ARC[29]。研究發(fā)現(xiàn),自噬程度隨年齡的增長而下降,自噬活性的升高可以延緩細(xì)胞衰老并延長小鼠的健康存活時(shí)間[30-31]。關(guān)于褪黑素的保護(hù)作用是通過自噬產(chǎn)生還是抗自噬實(shí)現(xiàn),目前學(xué)者存在不同意見。Guo等[32]研究發(fā)現(xiàn),褪黑素在缺血/再灌注損傷的小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞中通過促進(jìn)自噬作用從而保護(hù)細(xì)胞。相反地,Teng等[33]證明褪黑素在缺血/再灌注損傷的小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞中發(fā)揮抗自噬作用保護(hù)神經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),褪黑素通過增強(qiáng)自噬作用達(dá)到保護(hù)SRA01/04細(xì)胞的效果。微管相關(guān)蛋白質(zhì)LC3是經(jīng)典的自噬標(biāo)志物,LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是早期自噬活性的指標(biāo)[34]。因此,本研究分別評估了LC3-I和LC3-Ⅱ的表達(dá)。在SRA01/04細(xì)胞中,褪黑素使LC3-I與LC3-Ⅱ表達(dá)升高,表明自噬體形成增加。P62是一種間接介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的蛋白質(zhì),與自噬通量反向相關(guān)[35],它的積累被視為抑制自噬的標(biāo)志物,當(dāng)自噬被激活時(shí),其會減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,H2O2干預(yù)后,P62蛋白表達(dá)水平降低,但褪黑素干預(yù)后,P62蛋白表達(dá)水平并未升高。此外,Beclin-1在自噬小體形成中也起重要作用,被認(rèn)為是自噬小體激活的自噬標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中,Beclin-1蛋白表達(dá)水平在褪黑素干預(yù)后明顯增加。LC3-I和Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高表明褪黑素可能激活了SRA01/04細(xì)胞自噬的起始階段。LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高,但P62蛋白表達(dá)水平未升高,可能表明褪黑素也可以促進(jìn)自噬體的成熟,但對自噬降解階段影響并不顯著?？傊?本研究中褪黑素具體通過何種機(jī)制發(fā)揮了促自噬作用,仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié)論

褪黑素對LECs細(xì)胞具有保護(hù)作用;褪黑素可以提高H2O2誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞的存活率,減少細(xì)胞凋亡;褪黑素對LECs細(xì)胞的保護(hù)作用通過促進(jìn)細(xì)胞自噬完成。本研究結(jié)果有助于更好地研究褪黑素的臨床應(yīng)用價(jià)值,以及探索ARC治療的新靶點(diǎn)。