白楊 劉雪嬌 熊涵之 周贇璠 陳旭 楊文勝

（北京化工大學(xué)，化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

一氧化氮（NO）作為信號(hào)分子參與人體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散進(jìn)程具有密不可分的關(guān)系[1]，因此，原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的NO 對(duì)揭示致病機(jī)理和開(kāi)發(fā)治療藥物具有非常重要的意義。細(xì)胞釋放的NO 具有半衰期短、濃度低和反應(yīng)活性高等特點(diǎn)，研究者已開(kāi)發(fā)多種分析手段[2-5]用于檢測(cè)生物體系中的NO，其中，電化學(xué)法因具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、分析響應(yīng)快以及易于實(shí)現(xiàn)在體監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的活性小分子[6-7]。目前，對(duì)細(xì)胞釋放NO 的監(jiān)測(cè)研究主要是基于細(xì)胞在溶液中懸浮[8]或者基于二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[9]。三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)能更大程度地模擬體內(nèi)微環(huán)境，更真實(shí)地呈現(xiàn)細(xì)胞的狀態(tài)和功能[10]?；?D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)發(fā)的NO 電化學(xué)檢測(cè)近年來(lái)開(kāi)始出現(xiàn)，Qin 等[11]將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于表面固定了多肽-金納米管的3D 多孔聚二甲基硅氧烷支架上，并實(shí)現(xiàn)了拉伸刺激下對(duì)3D 培養(yǎng)軟骨細(xì)胞釋放NO 的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。Hu 等[12]基于蠶繭衍生的分層多孔碳纖維網(wǎng)絡(luò)，設(shè)計(jì)了一種結(jié)合3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的NO 電化學(xué)傳感器。

在生物體內(nèi)，細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)的微環(huán)境，即細(xì)胞在黏附和生長(zhǎng)過(guò)程中，由于形態(tài)或體積的改變，會(huì)對(duì)其所在的微環(huán)境施加局部應(yīng)力，促使周?chē)|(zhì)發(fā)生局部變形和重塑[13]。目前，已報(bào)道的用于開(kāi)發(fā)電化學(xué)傳感器的3D 細(xì)胞培養(yǎng)支架還不能夠較好地模擬細(xì)胞微環(huán)境的動(dòng)態(tài)特性，而基于動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵（包括硼酸酯鍵[14]、酰腙鍵[15]和亞胺鍵[16]等）能夠?qū)崿F(xiàn)水凝膠的可逆斷裂和重組，進(jìn)而模擬細(xì)胞所處的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，適應(yīng)細(xì)胞所施加的局部應(yīng)力，不影響也不限制細(xì)胞在3D 微環(huán)境中的形態(tài)改變[17]。

本研究以氧化海藻酸鈉（OSA）與酰肼聚乙二醇（PEG-DH）通過(guò)縮合反應(yīng)生成酰腙鍵，制得能夠可逆斷裂和重建的動(dòng)態(tài)OSA/PEG-DH 水凝膠網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞所處動(dòng)態(tài)3D 微環(huán)境的模擬。OSA/PEG-DH動(dòng)態(tài)共價(jià)交聯(lián)水凝膠為3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，以MnTMPyP 為電化學(xué)傳感元件，制備OSA/MnTMPyP/PEG-DH水凝膠，基于此構(gòu)建的電化學(xué)傳感器可以原位監(jiān)測(cè)3D 培養(yǎng)的三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞釋放的NO（圖1）。此傳感器在檢測(cè)NO 時(shí)具有較寬的響應(yīng)范圍和較低的檢出限，其傳感界面受損后10 min 即可自愈合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)NO 電流響應(yīng)的及時(shí)恢復(fù)。

圖1 構(gòu)建的電化學(xué)傳感器用于監(jiān)測(cè)3D 培養(yǎng)OSA/MnTMPyP/PEG-DH 動(dòng)態(tài)共價(jià)交聯(lián)水凝膠中的MDAMB-231 細(xì)胞釋放NO 的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the electrochemical sensor for monitoring NO released by MDA-MB-231 cells 3D cultured in OSA/MnTMPyP/PEG-DH dynamic covalently crosslinking hydrogel

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MCR 301 流變儀（奧地利安東帕公司）；SUPRA55 型掃描電子顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）；TSC SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡儀器有限公司）；CHI660E 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；Nano-ZS 粒度儀（英國(guó)Malvern 公司）；UVmini-1240 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。采用三電極體系：未修飾或修飾的GCE（直徑3 mm）為工作電極，鉑絲作為輔助電極，Ag/AgCl 電極為參比電極。

海藻酸鈉（Sodium alginate，SA，上海阿拉丁試劑有限公司）；酰肼聚乙二醇（2000 Da，96%，上海芃碩生物公司）；高碘酸鈉（NaIO4，北京百靈威試劑公司）；Mn（Ⅲ）內(nèi)消旋四（N-甲基-4-吡啶基）卟啉五氯化物（MnTMPyP，85%，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；亞硝酸鈉（NaNO2，99%，上海麥克林生化科技有限公司）；其它試劑均為分析純。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）采用NaH2PO4?2H2O 和Na2HPO4·12H2O 配制;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OSA及OSA/MnTMPyP/PEG-DH水凝膠的制備

將10 g SA 分散在50 mL 無(wú)水乙醇中，5.4 g NaIO4溶于50 mL 去離子水中，將二者混合，避光攪拌6 h后，通過(guò)加入與NaIO4等物質(zhì)的量的乙二醇終止反應(yīng)。攪拌1 h 后，加入20 g NaCl。加入200 mL 無(wú)水乙醇，抽濾，再用去離子水溶解沉淀，重復(fù)此操作步驟4 次，將制得的產(chǎn)物在40 ℃下真空干燥，得到OSA 固體。通過(guò)鹽酸羥胺滴定法測(cè)量OSA 的醛基含量[18]，測(cè)得制備的OSA 的氧化度約為50%。

取適量OSA 置于0.1 mol/L PBS（pH=7.4）中，超聲溶解，得到40 mg/mL OSA 溶液，采用相同方法制得80 mg/mL PEG-DH 溶液。將MnTMPyP 用去離子水溶解后，加入到OSA 溶液中超聲10 min，得到OSA/MnTMPyP 溶液。將等體積的PEG-DH 溶液與OSA/MnTMPyP 溶液超聲混合，靜置約1.5 h 后，得到OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠，MnTMPyP 在水凝膠中的濃度為0.5 mg/mL。將等體積的OSA 溶液和PEG-DH 溶液超聲混合，得到OSA/PEG-DH 水凝膠。

1.2.2 OSA/MnTMPyP/PEG-DH水凝膠修飾GCE的制備

GCE 依次用1、0.3 和0.05 μm 粒徑的Al2O3粉末進(jìn)行拋光打磨，分別用去離子水、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗3 次，將其置于氮?dú)鈿夥障赂稍铮S后用UV 照射對(duì)GCE 進(jìn)行消毒殺菌。將6 μL OSA/MnTMPyP/PEG-DH 溶液滴加于GCE 表面上，待其成膠，得到OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE。采用相同方法制備OSA/PEG-DHHG/GCE。

1.2.3 NO標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法制備飽和NO 溶液。在整套裝置中持續(xù)通入N240 min 后，進(jìn)行NO 的制備。在4 mol/L NaNO2溶液中逐滴緩慢地加入2 mol/L H2SO4溶液，通過(guò)歧化反應(yīng)生成NO 和NO2氣體，用4 mol/L NaOH 溶液對(duì)副產(chǎn)物NO2氣體進(jìn)行吸收，最后用PBS 收集制備純化后的NO 氣體，室溫下，飽和NO 溶液的濃度為1.8 mmol/L，在4 ℃可避光保存3 h，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 3D細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231 細(xì)胞購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司，采用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的L-15 培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，100%空氣）培養(yǎng)。在PEG-DH 溶液中加入MDA-MB-231 細(xì)胞懸液后，得到含有細(xì)胞的80 mg/mL PEG 溶液，將OSA/MnTMPyP 溶液與含有細(xì)胞的PEG-DH 溶液等體積混合，取6 μL 混合溶液（6.7×105cells/mL）滴涂在GCE 上，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使其在GCE 表面原位成膠，將其置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行3D 細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。

1.2.5 電化學(xué)測(cè)試及原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的NO

在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中添加不同濃度的NO，采用循環(huán)伏安（CV）和計(jì)時(shí)電流（i-t）法檢測(cè)修飾電極的電流響應(yīng)。采用i-t法檢測(cè)OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠中3D 培養(yǎng)的MDA-MB-231 細(xì)胞釋放的NO，待電流信號(hào)穩(wěn)定后，將佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）加入到電解液中，刺激MDA-MB-231細(xì)胞釋放NO。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

如圖2A 所示，將PEG-DH 溶液與OSA 溶液進(jìn)行等體積混合，在生理pH 值和室溫條件下制得OSA/PEG-DH 水凝膠，制備反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1。采用紅外光譜（FTIR）對(duì)制得的OSA 以及OSA/PEG-DH 水凝膠進(jìn)行表征。如圖2B 所示。相較于曲線a，曲線b 在1735 cm–1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，歸屬于OSA 的醛羰基對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，在2860 cm–1處出現(xiàn)的吸收峰是另一個(gè)醛基特征峰（CO—H振動(dòng)吸收峰），這表明成功制備了OSA[20]。曲線c 在3430 cm–1出現(xiàn)的寬吸收峰可歸屬于酰腙鍵上N—H的伸縮振動(dòng)峰，曲線c 中不含有曲線b 的兩處醛基特征峰，進(jìn)一步說(shuō)明OSA 參與反應(yīng)，生成了OSA/PEG-DH水凝膠，醛基消失，表明OSA/PEG-DH 水凝膠被成功制備；曲線c 在1624 cm–1處出現(xiàn)的吸收峰可能既包含了C=N 的吸收峰，又包含了C=O 的吸收峰。

圖2 （A）OSA/PEG-DH 水凝膠的制備過(guò)程照片；（B）海藻酸鈉（SA，a）、OSA（b）和OSA/PEG-DH 水凝膠（c）的傅里葉變換紅外光譜表征；（C）OSA/PEG-DH 水凝膠的自愈合過(guò)程照片；（D）采用應(yīng)變掃描法測(cè)定OSA/PEG-DH 水凝膠的流變性能；（E）采用重復(fù)動(dòng)態(tài)應(yīng)變階躍測(cè)試測(cè)定OSA/PEG-DH 水凝膠的自愈合特性Fig.2 (A) Preparation of OSA/PEG-DH hydrogel;(B) Fourier transform infrared spectroscopy characterization of(a)sodium alginate(SA),(b)OSA and(c)OSA/PEG-DH hydrogel;(C)Photographs of the self-healing process of OSA/PEG-DH hydrogel;(D) Detection of rheological properties of OSA/MnTMPyP/PEG-DH hydrogel using a strain sweep and (E) Detection of self-healing properties of the OSA/MnTMPyP/PEG-DH hydrogel using repeated dynamic strain step tests

如圖2C 所示，通過(guò)目視觀察OSA/PEG-DH 水凝膠的自愈合過(guò)程。為了進(jìn)一步表征OSA/PEG-DH 水凝膠的自愈合能力，先對(duì)OSA/PEG-DH 水凝膠進(jìn)行固定頻率為1 rad/s 的應(yīng)變掃描測(cè)試。如圖2D 所示，當(dāng)應(yīng)變?yōu)?00%時(shí)，曲線出現(xiàn)交叉，表明在應(yīng)變?yōu)?00%時(shí)，水凝膠網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始被完全破壞，并轉(zhuǎn)化為溶膠態(tài)，即發(fā)生了溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變[21]；當(dāng)施加的應(yīng)變超過(guò)100%時(shí)，G′′（損耗模量）>G′（儲(chǔ)能模量），表明凝膠已轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z。根據(jù)圖2D 的測(cè)試結(jié)果，設(shè)置小應(yīng)變?yōu)?%、大應(yīng)變?yōu)?00%，進(jìn)行固定頻率為1 rad/s 的重復(fù)動(dòng)態(tài)應(yīng)變階躍測(cè)試。如圖2E 所示，當(dāng)應(yīng)變?yōu)?%時(shí)，G′>G′′，水凝膠呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)；當(dāng)應(yīng)變?cè)黾拥?00%時(shí)，G′

OSA 的Zeta 電位為–54.4 mV，說(shuō)明OSA 處于負(fù)電位的狀態(tài)，這可歸因于OSA 鏈中存在部分解離的羧酸基團(tuán)，即—COO–；MnTMPyP 的Zeta 電位為4.8 mV，說(shuō)明其處于正電位狀態(tài)（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S2A）。因此，MnTMPyP 與OSA 通過(guò)靜電作用實(shí)現(xiàn)了非共價(jià)復(fù)合。在OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（電子版文后支持信息圖S2B）中，MnTMPyP 溶液的光譜出現(xiàn)強(qiáng)Soret 帶（462.3 nm）和弱Q 帶（562.5 nm）[22]，OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的Soret 帶和Q 帶分別在463.1 和564.4 nm 處。OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠與MnTMPyP 溶液的紫外-可見(jiàn)吸收峰的位置幾乎完全重合，說(shuō)明錳卟啉被成功復(fù)合在水凝膠中；與游離基卟啉相關(guān)的Soret 帶未發(fā)生藍(lán)移，說(shuō)明復(fù)合水凝膠中MnTMPyP 的構(gòu)型沒(méi)有發(fā)生改變[23]。將OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠冷凍干燥48 h 后，采用SEM 對(duì)其斷截面進(jìn)行形貌表征（電子版文后支持信息圖S2C）。OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠呈現(xiàn)3D 網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)，其孔徑在50～100 μm 之間，而細(xì)胞直徑通常在10～20 μm 之間，表明這種3D 網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)能夠從空間上很好地容納細(xì)胞，并包容細(xì)胞在3D 空間內(nèi)進(jìn)行有利的生長(zhǎng)黏附、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和廢物代謝。采用能量色散（EDS）對(duì)OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠進(jìn)行了元素分析（電子版文后支持信息圖S2D），Mn（MnTMPyP 的特征元素）的EDS 元素分布圖像表明，MnTMPyP 在OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠中均勻分布。為了證明MnTMPyP 能夠在水凝膠中穩(wěn)定固定，對(duì)修飾OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的GCE進(jìn)行了CV 測(cè)試（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S3）。記錄了OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 在0.1 mol/L PBS 溶液（pH 7.0）中掃描1 圈（曲線a）和100 圈（曲線b）的循環(huán)伏安響應(yīng)，可以觀察到CV 曲線幾乎沒(méi)有明顯變化，表明MnTMPyP 能夠被穩(wěn)定固定在OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠中。

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)表征及其對(duì)NO的電化學(xué)響應(yīng)

測(cè)定了不同修飾電極在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的CV 響應(yīng)（圖3A）。在–0.5～0.3 V 的電化學(xué)窗口下，MnTMPyP/GCE（曲線a）在–0.217 和–0.067 V 處出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，根據(jù)公式E0=（Epa+Epc）/2，計(jì)算MnTMPyP 的形式氧化還原電位為–0.142 V。OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 也表現(xiàn)出一對(duì)相似的氧化-還原峰，但其氧化-還原峰峰差比MnTMPyP/GCE 的氧化-還原峰峰差大34 mV，說(shuō)明OSA/PEG-DH水凝膠對(duì)MnTMPyP 和GCE 之間的直接電子轉(zhuǎn)移存在影響。在OSA/PEG-DHHG/GCE 上僅檢測(cè)到了充電電流，這表明OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 在CV 圖中的氧化-還原峰來(lái)源于MnTMPyP 的活性中心，即Mn（Ⅲ）/Mn（Ⅱ）的還原和氧化[24]。

圖3 （A）MnTMPyP/GCE（a）、OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE（b）、OSA/PEG-DHHG/GCE（c）和GCE（d）在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的循環(huán)伏安（CV）圖，掃速為0.1 V/s；（B）OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE（a、b）和OSA/PEG-DHHG/GCE（c、d）在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中加入30 μmol/L NO 前（a、c）后（b、d）的CV 圖，掃速為0.1 V/sFig.3 (A) Cyclic voltammetry (CV) characterization of (a) MnTMPyP/GCE,(b) OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE,(c)OSA/PEG-DHHG/GCE and(d)GCE in 0.1 mol/L PBS(pH 7.0),scan rate is 0.1 V/s;(B)CVs of OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE(a,b)and OSA/PEG-DHHG/GCE(c,d)in the absence(a,c)and presence(b,d)of 30 μmol/L NO in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0),scan rate is 0.1 V/s

采用CV 法分析了NO 在不同修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)。如圖3B 所示，未加入NO 時(shí)，OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 表現(xiàn)出典型的電容性行為（曲線a）；加入30 μmol/L NO 后，OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 在0.90 V 處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的催化氧化峰（曲線b）。OSA/PEG-DHHG/GCE 對(duì)NO 無(wú)電化學(xué)響應(yīng)（曲線d）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 對(duì)NO 的催化氧化活性主要來(lái)自MnTMPyP。

2.3 傳感器對(duì)NO的傳感性能研究

通過(guò)i-t法（應(yīng)用電位為0.9 V）評(píng)估OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 對(duì)NO 的電化學(xué)傳感性能。如圖4A 所示，NO 的濃度在0.036～126 μmol/L 范圍內(nèi)，電流響應(yīng)隨NO 濃度增加而增大，線性回歸方程為y（μA）=0.073x（μmol/L）+0.121（R2=0.996）（圖4B），檢測(cè)NO 的靈敏度為1.03 μA·L/（μmol·cm2），檢出限為17 nmol/L（S/N=3）。

圖4 （A）傳感器在含有NO 的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)圖（工作電位為0.90 V）；（B）NO 電流響應(yīng)與其濃度的線性關(guān)系曲線；（C）傳感器在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中加入36 μmol/L NO前（a）后（b）的差分脈沖伏安（DPV）圖，修飾電極表面受到機(jī)械損傷后（c）和分別經(jīng)過(guò)5 min（d）以及10 min（e）自愈合后檢測(cè)36 μmol/L NO 的DPV 曲線；（D）圖C 中峰電流和峰電位的變化曲線Fig.4 (A)Amperometric response of the sensor at 0.9 V in PBS(pH=7.0)containing different concentrations of NO;(B) Linear relationship between the current response of NO and logarithm of NO concentration;(C)Differential pulse voltammetry(DPV)diagram of the sensor in 0.1 mol/L PBS(pH 7.0)before(a)and after(b)addition of 36 μmol/L NO,the electrochemical response of the modified electrodes to 36 μmol/L NO after mechanical damage(c),and self-healing for 5 min(d)and 10 min(e);(D)The corresponding curve of changes in peak current and peak potential in Fig.4C

通過(guò)差分脈沖伏安法（DPV）表征OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 在檢測(cè)NO 時(shí)的自愈合性能。如圖4C 所示，傳感器對(duì)36 μmol/L NO 具有良好的電流響應(yīng)（曲線b）。采用鋒利的刀片割劃水凝膠傳感器表面后，立即對(duì)損傷后的傳感器進(jìn)行DPV 測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其對(duì)36 μmol/L NO 的電流響應(yīng)下降約22.4%（曲線c），與傳感界面損傷之前相比，峰電位正移0.04 V（圖4D）。將表面損傷后的傳感器放置在室溫下，不進(jìn)行任何的外部干預(yù)，使其自愈合，5 min 后，傳感器對(duì)36 μmol/L NO 的電流響應(yīng)恢復(fù)到受損前的85.9%（曲線d）；自愈合10 min 后，電流響應(yīng)恢復(fù)到受損前的98.1%（曲線e），此時(shí)峰電位回到損傷前的位置。上述結(jié)果表明，傳感器的傳感界面在遭受損傷后能夠在短時(shí)間內(nèi)快速恢復(fù)其對(duì)NO 的傳感能力。

通過(guò)i-t法（應(yīng)用電位為0.9 V）考察了OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 的選擇性。18 μmol/L 干擾物質(zhì)（Glu、Lys、H2O2、Cl–、CA、AA、NO3–及NO2–）的電流響應(yīng)均小于18 μmol/L NO 電流響應(yīng)的8.0%（電子版文后支持信息圖S4A），說(shuō)明傳感器對(duì)NO 有很好的選擇性。OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE在4 ℃下保存72 h 后，傳感器的電流響應(yīng)仍然保持在初始電流響應(yīng)值的97.4%，表明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S4B）。在相同條件下制備的5 根OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE對(duì)9 μmol/L NO 的電流響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.6%，表明電極的制備重現(xiàn)性良好。采用同一根OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE 對(duì)9 μmol/L NO 進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，5 次檢測(cè)結(jié)果的RSD 為2.0%，表明此傳感器具有優(yōu)良的檢測(cè)重現(xiàn)性。

2.4 原位監(jiān)測(cè)3D培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞釋放的NO

采用OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠模擬細(xì)胞所處的動(dòng)態(tài)3D 微環(huán)境，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）能觀察到水凝膠內(nèi)的細(xì)胞簇分布在不同高度，其整體呈現(xiàn)3D 的分布狀態(tài)[25-26]（圖5A）。通過(guò)CCK-8 法評(píng)估OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的體外細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)3D 培養(yǎng)于水凝膠中的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞存活率均大于92%（電子版文后支持信息圖S5），證明此水凝膠具有良好的生物相容性。

圖5 （A）MDA-MB-231 細(xì)胞在水凝膠中的激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）圖像；（B）OSA/MnTMPyP/PEG-DH/cell HG/GCE（a）和OSA/MnTMPyP/PEG-DHHG/GCE（b）以及切割后的含有細(xì)胞的傳感器（c）在PBS（pH=7.0）中經(jīng)佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）刺激得到的計(jì)時(shí)電流圖Fig.5 (A) Laser scanning confocal microscope (LSCM) image of MDA-MB-231 cells in hydrogel;(B) Amperometric responses of OSA/MnTMPyP/PEG-DH/cell HG/GCE (a),OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE(b) and the sensor containing cells after cutting in PBS (c) under stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)

通過(guò)檢測(cè)MDA-MB-231 細(xì)胞釋放的NO 考察所制備電化學(xué)傳感器的實(shí)時(shí)檢測(cè)性能。在1 mL PBS（pH=7.0）中，OSA/MnTMPyP/PEG-DH/cell HG/GCE 經(jīng)PMA（1 μg/mL）刺激后產(chǎn)生的電流響應(yīng)為434.4 nA（圖5B 中曲線a），而不含細(xì)胞的傳感器無(wú)任何電流響應(yīng)，表明電流響應(yīng)不是加入PMA 引起的，而是細(xì)胞經(jīng)藥物刺激后釋放NO 導(dǎo)致的。為了考察在實(shí)際監(jiān)測(cè)3D 培養(yǎng)細(xì)胞釋放NO 過(guò)程中傳感器的自愈合性能，將相同條件下制備的OSA/MnTMPyP/PEG-DH/MDA-MB-231cell HG/GCE 的表面進(jìn)行切割后，置于PBS中進(jìn)行i-t測(cè)試，600 s 后注射PMA（1 μg/mL），電流響應(yīng)為421.7 nA（圖5B 中曲線c），為未經(jīng)切割處理的電極所得電流響應(yīng)的97.1%，表明傳感界面基本愈合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此傳感器能夠?qū)κ軗p界面進(jìn)行自修復(fù)從而實(shí)現(xiàn)NO 電流響應(yīng)的快速恢復(fù)。基于動(dòng)態(tài)共價(jià)交聯(lián)水凝膠所構(gòu)建的電化學(xué)傳感器不僅能夠模擬細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，而且傳感界面因具有優(yōu)異的自愈合性，能夠修復(fù)外界潛在的機(jī)械損傷。

3 結(jié)論

本研究制備了OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠，基于此構(gòu)建了電化學(xué)傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了原位監(jiān)測(cè)3D培養(yǎng)的MDA-MB-231 細(xì)胞釋放的NO。OSA/PEG-DH 水凝膠通過(guò)動(dòng)態(tài)酰腙鍵實(shí)現(xiàn)可逆的斷裂和重組，模擬細(xì)胞所處的動(dòng)態(tài)微環(huán)鏡。MnTMPyP 作為傳感器的敏感元件，通過(guò)對(duì)NO 的電催化氧化實(shí)現(xiàn)了對(duì)NO 濃度的定量分析。傳感器對(duì)NO 的檢測(cè)靈敏度為1.03 μA·L/（μmol·cm2），檢出限為17 nmol/L（S/N=3），損傷后的傳感界面對(duì)NO 的電流響應(yīng)能及時(shí)恢復(fù)。本研究為模擬細(xì)胞動(dòng)態(tài)微環(huán)境以及監(jiān)測(cè)細(xì)胞行為等研究奠定了基礎(chǔ)。

支持信息

Supporting Information

圖S1 OSA/PEG-DH 水凝膠的制備機(jī)制Fig.S1 Schematic diagram of the gelation mechanism of OSA/PEG-DH hydrogel

圖S2 （A）OSA 和MnTMPyP 的Zeta 電位表征；（B）（a）MnTMPyP 水溶液和（b）含MnTMPyP 水凝膠的紫外吸收光譜；（C）OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的SEM 和（D）元素分布圖Fig.S2 (A) Zeta potentials of OSA and MnTMPyP;(B) UV-visible absorbance spectrums of (a) MnTMPyP in Milli-Q water and (b) OSA/MnTMPyP/PEG-DH hydrogel;(C) SEM image and (D) corresponding EDS mappings of OSA/MnTMPyP/PEG-DH hydrogel

圖S3 OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE 中在 0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的 CV 曲線（a）及連續(xù)掃描100 個(gè)循環(huán)之后的CV 曲線（b），掃速為0.1 V/sFig.S3 CVs obtained at the OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0) before (a) and after (b)continuous scanned for 100 cycles,scan rate of 0.1 V/s

圖S4 （A）OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE 的選擇性實(shí)驗(yàn)：在 0.1mol/L PBS（pH 7.0）中，修飾電極對(duì)18 μmol/L 的NO 和其他18 μmol/L 干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)；（B）OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE 的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.S4 (A) Interference test of OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE: the current response upon 18 μmol/L NO and 18 μmol/L different interferents in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0);(B) Storage stability of OSA/MnTMPyP/PEG-DH HG/GCE

圖S5 OSA/MnTMPyP/PEG-DH 水凝膠的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)Fig.S5 Cytotoxicity test of OSA/MnTMPyP/PEG-DH hydrogel

表S1 不同電化學(xué)傳感器檢測(cè)細(xì)胞釋放NO 的性能比較Table S1 Comparison of selected electrochemical sensors for NO detection released from cells.

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