張秀婷，吳香菊，齊靜，叢曉燕，李均同，陳大全，姜寧朋，杜以軍*

(1. 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東省科技服務(wù)發(fā)展推進(jìn)中心，山東 濟(jì)南 250101)

三基序蛋白(tripartite motif，TRIM)家族也被稱為RBCC家族，該家族因具有3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域RING、B-box和超螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil)而得名[1]。病毒感染后激活的第一道防線是先天性免疫應(yīng)答系統(tǒng)。在此階段，干擾素(interferon，IFN)信號(hào)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。TRIM蛋白具有廣泛的調(diào)節(jié)先天性免疫及病毒感染功能，目前已發(fā)現(xiàn)80多種TRIM蛋白[3]。TRIM56能夠激活TLR3介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路[4]。TRIM56可抑制幾種正鏈RNA病毒的增殖，包括I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)[5]，豬瘟病毒(CSFV)[6]和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)[7]等黃病毒科的病毒以及人類冠狀病毒(HCoV-OC43)[8]等。TRIM56的抗病毒活性取決于其E3連接酶的活性及其C末端區(qū)域的完整性[7]。

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)可導(dǎo)致母豬繁殖障礙及仔豬嚴(yán)重呼吸道疾病，具體表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬呼吸障礙[9-11]，已成為全球養(yǎng)豬業(yè)中最嚴(yán)重的傳染病之一[12]。其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，屬于套式病毒目動(dòng)脈病毒科，是一種單股正鏈RNA病毒[13]。目前，防治PRRS的常用方法是接種疫苗，市場(chǎng)上常用的PRRS疫苗主要有減毒活疫苗(modified live vaccine，MLV)和滅活疫苗(inactivated vaccine，IV)[14]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可通過人工設(shè)計(jì)的向?qū)NA(guide RNA，gRNA)指導(dǎo)Cas9蛋白(Cas核酸酶)對(duì)目的基因靶向位點(diǎn)進(jìn)行特異性識(shí)別、結(jié)合和切割，然后通過細(xì)胞的非同源末端連接(NHEJ)或同源末端重組(HR)修復(fù)機(jī)制來完成對(duì)基因組的敲除與敲入[15]。此技術(shù)可在基因組的一個(gè)特定區(qū)域的2邊各引入一對(duì)向?qū)NA，將基因的敲除做到可控的特定長(zhǎng)度。本研究利用雙向?qū)RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了1株豬TRIM56敲除的PAM-KNU細(xì)胞系，與野生型細(xì)胞系相比，該敲除細(xì)胞系中PRRSV R98疫苗株增殖顯著增強(qiáng)，為豬TRIM56抗病毒機(jī)制研究及PRRS疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及毒株

永生化的豬肺泡巨噬細(xì)胞系PAM-KNU[16]由韓國(guó)慶北大學(xué)Lee博士惠贈(zèng)；CRISPR/Cas9敲除載體質(zhì)粒Px459M、EZ-Guide-XH、MARC-145細(xì)胞、PRRSV R98毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

硝酸纖維素膜(NC)購(gòu)自Pall公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、RNA-easy Isolation Reagent試劑、反轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper)試劑盒、HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)、180 kDa Prestained Protein Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；2 × RealStar Green Fast Mixture購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；青鏈霉素混合液、嘌呤霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BbsⅠ、XhoⅠ及T4 DNA Ligase購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Opti-MEM、高糖型DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶 0.25% Trypsin-EDTA和滅活胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；Sparkjade ECL super極超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、苯基甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購(gòu)自Abways公司；TRIM56抗體購(gòu)自Abcam公司；PRRSV N蛋白抗體SDOW-17購(gòu)自Rural Technologies；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 豬TRIM56向?qū)NA引物的設(shè)計(jì)及合成

通過CRISPR向?qū)NA在線設(shè)計(jì)工具(http://www.addgene.org/CRISPR/)，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫公布的豬TRIM56(GenBank登錄號(hào)：KJ881160)基因組序列的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了2對(duì)特定的向?qū)NA引物，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 豬TRIM56向?qū)NA引物

1.4 敲除質(zhì)粒Px459M-sTRIM56-KO的構(gòu)建及鑒定

將上述合成的兩對(duì)向?qū)NA的上、下游引物磷酸化及退火，形成黏性末端雙鏈；用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶酶切Px459M載體及EZ-Guide-XH載體并膠回收，通過T4 DNA Ligase分別將兩對(duì)向?qū)NA與Px459M載體、EZ-Guide-XH載體連接，并用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑菌至含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，Px459M插入sgRNA5質(zhì)粒用sgRNA5的前向引物和CAG-R引物擴(kuò)增；EZ-Guide-XH插入sgRNA7質(zhì)粒用sgRNA7的前向引物和M13F引物擴(kuò)增。鑒定為陽性的質(zhì)粒送至北京擎科生物技術(shù)有限公司分別用CAG-R和M13F測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為Px459M-sgRNA5、EZ-Guide-XH-sgRNA7。

質(zhì)粒Px459M-sgRNA5、EZ-Guide-XH-sgRNA7分別用HindⅢ/XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，得到載體片段Px459M-sTRIM56-KO-5和基因片段sTRIM56-KO-7，將載體片段和基因片段連接后轉(zhuǎn)化，接著提取質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定為陽性質(zhì)粒的送至北京擎科生物技術(shù)有限公司用CAG-R進(jìn)行測(cè)序，DNAstar軟件分析插入的片段序列。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為Px459M-sTRIM56-KO。CAG-R、M13F引物序列見表2。

表2 PCR引物

1.5 sTRIM56基因敲除PAM-KNU細(xì)胞系的構(gòu)建

PAM-KNU細(xì)胞在含5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)[16]。將PAM-KNU細(xì)胞接種于12孔板，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，按照下列嘌呤霉素濃度進(jìn)行耐受性測(cè)試：0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 μg/mL。篩選到第3天時(shí)，引起細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度作為PAM-KNU細(xì)胞敲除細(xì)胞系篩選的最佳藥物作用濃度。

將PAM-KNU細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將Px459M-sTRIM56-KO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PAM-KNU細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照。在轉(zhuǎn)染24 h后，加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，篩選3 d后，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染敲除質(zhì)粒的細(xì)胞孔存活的細(xì)胞換不加嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用有限稀釋法稀釋細(xì)胞，按照每孔1～2個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，觀察每孔單克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)生長(zhǎng)情況將96孔板中的細(xì)胞擴(kuò)大至48孔板中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿后將48孔板中的細(xì)胞擴(kuò)大至24孔板培養(yǎng)，過程中，取部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 sTRIM56 KO-PAM-KNU細(xì)胞系的鑒定

將從48孔板中取出的細(xì)胞和作為對(duì)照的PAMKNU細(xì)胞通過RNA-easy Isolation Reagent試劑提取總RNA并設(shè)為模板，利用擴(kuò)增豬TRIM56基因序列的引物sTRIM56-F和sTRIM56-R(見表2)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體步驟參照HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)說明書，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，理論上篩選到的sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞電泳條帶在1 100 bp左右，而對(duì)照PAM-KNU細(xì)胞的電泳條帶在2 268 bp，將條帶大小在1 100 bp左右的進(jìn)行膠回收并送去測(cè)序。

將敲除細(xì)胞和作為對(duì)照的PAM-KNU細(xì)胞在12孔板中接種48 h，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞蛋白裂解液，并補(bǔ)充PMSF(1∶100)冰上裂解10 min，用槍頭刮下細(xì)胞，然后4 ℃ 11 000 r/min離心10 min沉淀細(xì)胞，取上清液加入4 × Loading buffer，沸水浴煮15 min。將制得的樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳后，采用濕法轉(zhuǎn)印100 V、70 min將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；然后用稀釋的TRIM56抗體和β-actin抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min。用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行曝光檢測(cè)。

1.7 PRRSV R98疫苗株在sTRIM56-KO-PAM-KNU中的增殖

將PAM-KNU細(xì)胞和sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞分別鋪12孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，均以MOI=0.1感染PRRSV R98毒株1 h，然后去除病毒接種物，并為感染的細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基。分別于24、36及48 h，收集細(xì)胞上清用于PRRSV病毒拷貝數(shù)及TCID50檢測(cè)，收集細(xì)胞用于PRRSV的N蛋白檢測(cè)。

用RNA-easy Isolation Reagent試劑從細(xì)胞上清液中提取總RNA，并用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+ gDNA wiper)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，如前所述[17]進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV拷貝數(shù)，每組平行重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)品PRRSV-N質(zhì)粒連續(xù)稀釋10倍用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR的引物PRRSV-N-F/PRRSV-N-R見表2，通過對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的Ct值，獲得每個(gè)樣品中的PRRSV拷貝數(shù)。

MARC-145細(xì)胞在含10% FBS和1%青鏈霉素混合液的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將MARC-145細(xì)胞接種于96孔板，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為90%時(shí)，將上述2種細(xì)胞上清樣品均以10-1～10-10倍比稀釋，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，添加到鋪好的MARC-145細(xì)胞96孔板中，持續(xù)觀察3 d統(tǒng)計(jì)細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

按照1.6中的Western blot方法，處理細(xì)胞樣品并用PRRSV N蛋白抗體及β-actin抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，使用軟件ImageJ分析蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

比較數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism8.01軟件采用方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。并通過單向重復(fù)測(cè)量方差分析和最小顯著性差異(LSD)確定差異。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Px459M-sTRIM56-KO重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將Px459M載體和EZ-Guide-XH載體分別用BbsⅠ酶切，將向?qū)NA磷酸化、退火形成片段，兩者連接后的質(zhì)粒Px459M-sgRNA5、EZ-Guide-XH-sgRNA7 PCR鑒定結(jié)果見圖1。經(jīng)中間載體EZ-Guide-XH，2對(duì)向?qū)NA均克隆至Px459M載體形成Px459M-sTRIM56-KO，HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定見圖2，得到預(yù)期大小的片段。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)敲除質(zhì)粒Px459M-sTRIM56-KO構(gòu)建成功。

M. DL2000 DNA Marker，1～2. Px459M-sgRNA5的PCR擴(kuò)增結(jié)果；3～4. EZ-Guide-XH-sgRNA7的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

M. DL10000 DNA Marker；1～2. Px459M-sTRIM56-KO質(zhì)粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切結(jié)果。

2.2 sTRIM56 KO-PAM-KNU敲除細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定

將構(gòu)建成功的敲除質(zhì)粒Px459M-sTRIM56-KO轉(zhuǎn)染至PAM-KNU細(xì)胞，并以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染24 h后，以篩選到的PAM-KNU細(xì)胞最佳嘌呤霉素作用濃度3 μg/mL，進(jìn)行嘌呤霉素篩選，3 d后，對(duì)照細(xì)胞全部死亡，有限稀釋法挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。陽性克隆與對(duì)照細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3A所示，野生型PAM-KNU細(xì)胞的sTRIM56擴(kuò)增條帶約2 268 bp，而陽性克隆的sTRIM56條帶約1 076 bp。兩者RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)如圖3B所示，敲除細(xì)胞的sTRIM56基因CDS區(qū)929～2 120位共1 192個(gè)核苷酸被敲除，表明敲除細(xì)胞系構(gòu)建成功，命名為sTRIM56-KO-PAM-KNU。

Western blot檢測(cè)PAM-KNU和sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中sTRIM56蛋白的表達(dá)情況。如圖3C所示，PAM-KNU細(xì)胞中檢測(cè)到sTRIM56蛋白表達(dá)，sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中未檢測(cè)到sTRIM56蛋白表達(dá)。

A. sTRIM56-KO-PAM-KNU和PAM-KNU細(xì)胞sTRIM56基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；B. sTRIM56-KO-PAM-KNU與PAM-KNU細(xì)胞sTRIM56基因RT-PCR產(chǎn)物序列比對(duì)結(jié)果；C. Western blot檢測(cè)sTRIM56-KO-PAM-KNU與PAM-KNU細(xì)胞中sTRIM56蛋白表達(dá)情況。

2.3 PRRSV R98株在sTRIM56-KO-PAM-KNU敲除細(xì)胞系中的增殖

絕對(duì)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在病毒感染24、36及48 h，sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98株病毒拷貝數(shù)均顯著高于PAM-KNU細(xì)胞(圖4A)。TCID50結(jié)果顯示，在病毒感染24、36及48 h，sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98株病毒滴度均顯著高于PAM-KNU細(xì)胞的PRRSV R98株病毒滴度(P<0.05)(圖4B)。Western blot結(jié)果顯示，在病毒感染24、36及48 h，sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV的N蛋白表達(dá)量明顯均高于PAM-KNU細(xì)胞PRRSV的N蛋白表達(dá)量(P<0.05)(圖4C、4D)。上述結(jié)果表明，在sTRIM56-KO-PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98株病毒增殖能力更強(qiáng)，更適用于疫苗株的增殖。

A. 絕對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)sTRIM56-KO-PAM-KNU與PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98毒株的病毒拷貝數(shù)；B. TCID50檢測(cè)sTRIM56-KO-PAM-KNU與PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98毒株的病毒滴度；C. Western blot檢測(cè)sTRIM56-KO-PAM-KNU(泳道2，4，6)與PAM-KNU(泳道1，3，5)細(xì)胞中PRRSV R98毒株N蛋白表達(dá)情況；D. sTRIM56-KO-PAM-KNU與PAM-KNU細(xì)胞中PRRSV R98毒株N蛋白的相對(duì)表達(dá)量。*表示P<0.05。

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFNs和TALENs技術(shù)之后出現(xiàn)的第3代新型基因編輯技術(shù)，由Cas9核酸酶和特異性的向?qū)NA構(gòu)成，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因位點(diǎn)敲除、敲入及定點(diǎn)突變等多種基因編輯，廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物基因編輯方面的研究，并且已成功構(gòu)建多種基因修飾的動(dòng)物模型[19-21]。本研究采用CRISPR/Cas9雙向?qū)NA基因編輯技術(shù)，在sTRIM56基因組的外顯子區(qū)域2邊各引入一對(duì)向?qū)NA，這2對(duì)向?qū)NA對(duì)于sTRIM56基因的兩個(gè)外顯子區(qū)域同時(shí)發(fā)生編輯，以敲除sTRIM56基因的特定區(qū)域。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染、用嘌呤霉素篩選細(xì)胞、有限稀釋法稀釋細(xì)胞等一系列的操作和方法進(jìn)行了摸索，總結(jié)了有效的實(shí)驗(yàn)操作流程，提高了敲除細(xì)胞系的建立效率，利用該技術(shù)成功構(gòu)建了敲除sTRIM56基因的細(xì)胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU。

多個(gè)TRIM家族成員在固有免疫應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮重要作用[22]，受Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的誘導(dǎo)，對(duì)病原體的入侵發(fā)揮作用。Zhao等[23]發(fā)現(xiàn)TRIM26抑制PRRSV感染后豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)中病毒的復(fù)制，TRIM26通過C端PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域結(jié)合PRRSV N蛋白，抗病毒活性取決于RING結(jié)構(gòu)域和PRY/SPRY部分。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)TRIM56靶向甲型和乙型流感病毒(IAV和IBV)RNA的合成，抑制病毒的復(fù)制，且TRIM56 C末端的63個(gè)殘基中含有全長(zhǎng)蛋白抗病毒功能的最小決定因素。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM56能顯著激活仙臺(tái)病毒(SeV)誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β，TRIM56的抗病毒活性取決于其E3泛素連接酶活性及其C端區(qū)域的完整性。由此可見，E3泛素連接酶TRIM56在病毒感染細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究構(gòu)建的敲除sTRIM56基因的PAM-KNU細(xì)胞系為探究sTRIM56在PRRSV增殖過程中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

由PRRSV引起的豬繁殖與呼吸綜合征是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的傳染病之一。目前尚無針對(duì)PRRS有效的治療手段，因此對(duì)于PRRS的疫苗免疫預(yù)防就顯得尤為重要。采用弱毒活疫苗免疫接種是我國(guó)控制PRRS的主要手段，免疫效果好、但在生產(chǎn)工藝等方面亟待改善和提高[25]。與野生型PAM-KNU細(xì)胞系相比，本研究構(gòu)建的敲除sTRIM56基因的PAM-KNU細(xì)胞系增殖PRRSV疫苗株R98滴度更高，為PRRSV疫苗研發(fā)提供了技術(shù)支撐。