王楚文，李玉林，石盼盼，左蕾，閆生輝，王云龍，*

(1. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2. 河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命健康學(xué)院，河南 鄭州 450000)

非洲豬瘟對(duì)豬的致病性以病程短、高熱和出血性病變?yōu)橹饕卣?，具有極強(qiáng)的傳染性和較高的病死率。自2018年傳入我國(guó)以來(lái)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)沉重打擊，是重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疾病[1]。針對(duì)該疾病目前已開(kāi)展多種疫苗研究，其中，亞單位疫苗具有比傳統(tǒng)疫苗安全性高、可操作性強(qiáng)、能夠規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，成為非瘟疫苗研制的主要方向之一[2]。然而，優(yōu)選的抗原片段因缺乏致病成分，難以激活天然免疫，因此需要使用佐劑協(xié)同疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)烈、持久的免疫反應(yīng)[3]。靈芝多糖是靈芝中含量最豐富的成分之一，具有多種生物活性，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，以及T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的活化，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖并產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗體[4]。因此，可利用靈芝多糖提高疫苗免疫效果。本研究采用納米技術(shù)制備靈芝多糖納米乳佐劑并對(duì)其進(jìn)行初步應(yīng)用和品質(zhì)評(píng)價(jià)，旨在開(kāi)發(fā)一種安全有效的佐劑提高疫苗質(zhì)量，并為研發(fā)安全、高效且易于使用的疫苗佐劑提供參考和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

非洲豬瘟病毒重組抗原P72溶液由河南省生物技術(shù)研究中心提供；醫(yī)用白油52號(hào)購(gòu)自美國(guó)埃克森美孚化工商務(wù)有限公司；Span-80、Tween-80、PEG-400購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；靈芝多糖購(gòu)自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG購(gòu)自賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司。剪切乳化機(jī)購(gòu)自弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；馬爾文激光粒度儀購(gòu)自英國(guó)馬爾文公司；超聲細(xì)胞破碎儀(超聲探頭16#)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平購(gòu)自?shī)W豪斯儀器有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀儀器有限公司。

1.2 組方篩選

1.2.1 納米乳組分的確定

綜合考慮組分原料的安全性等因素，選擇進(jìn)口醫(yī)用白油Marcol-52為制備納米乳的油相，常用的非離子表面活性劑Span-80、Tween-80為制備納米乳的表面活性劑，PEG-400為助表面活性劑。

1.2.2 表面活性劑復(fù)配比例篩選

采用復(fù)合表面活性劑，以進(jìn)口醫(yī)用白油Marcol-52為油相，PEG-400為助表面活性劑，固定Km=2∶1，繪制偽三元相圖，篩選出Span-80、Tween-80最佳復(fù)配比例。

1.2.3 Km值篩選

將表面活性劑與助表面活性劑按照質(zhì)量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合均勻，繪制偽三元相圖，篩選出最佳Km值。

1.2.4 水滴定法繪制偽三元相圖[5]

將油相與復(fù)配后的表面活性劑按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1準(zhǔn)確稱量并置于平底玻璃燒杯中。在室溫條件下，邊攪拌邊緩慢滴加水相至溶液澄清，然后根據(jù)最終加入的水相質(zhì)量，計(jì)算乳液體系各組分在臨界點(diǎn)的質(zhì)量百分比，使用Origin 2021軟件繪制納米乳相應(yīng)的偽三元相圖。

1.2.5 水包油型靈芝多糖納米乳組方確定及制備

選取偽三元相圖納米乳區(qū)的中央附近點(diǎn)作為納米乳處方。從“1.2.3”篩選的偽三元相圖中央選取5個(gè)點(diǎn)作為乳液候選配方，檢測(cè)各組乳液體系粒徑、聚合物分散指數(shù)(PDI)、黏度和離心穩(wěn)定性。

1.3 乳化方法篩選

1.3.1 免疫制劑制備

將ASFV-P72抗原溶液與佐劑ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG混合，按照說(shuō)明書制備疫苗候選物備用。

將200 g靈芝多糖溶于抗原緩沖液中配制20%的靈芝多糖溶液，與ASFV-P72抗原原液混合制備含1%、2%、4%、8%、10%靈芝多糖的抗原溶液，分別與“1.2.5”中制備的GLP-NE佐劑混合，用于乳化方法探究。

1.3.2 不同乳化方法GLP-P72疫苗候選物的制備

將稀釋后的非洲豬瘟病毒P72抗原溶液分別在剪切攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為300、500、1 000、1 500、2 000 r/min及超聲功率為100、200、300、400、500 W(超聲/停止時(shí)間為3 s/3 s)條件下緩緩加入到GLP-NE佐劑中至完全乳化。

1.3.3 不同乳化時(shí)間GLP-P72疫苗候選物的制備

將稀釋后的非洲豬瘟病毒P72抗原溶液在步驟1.3.2篩選的乳化設(shè)備參數(shù)條件下緩緩加入到GLP-NE佐劑中乳化，分別在不同時(shí)間取樣檢測(cè)。

1.3.4 離心穩(wěn)定性

吸取樣品10 mL裝入15 mL透明離心管中，放入離心機(jī)中，10 000 r/min，(4±2)℃、(23±2)℃離心20 min，觀察免疫制劑是否出現(xiàn)分層、破乳、渾濁及沉淀析出等現(xiàn)象。

1.3.5 貯藏穩(wěn)定性

吸取樣品10 mL密封于西林瓶中，分別貯藏于(4±2)℃、(37±2)℃條件下，每隔7 d觀察免疫制劑是否出現(xiàn)分層、破乳、渾濁及沉淀析出等現(xiàn)象。

1.4 GLP-P72納米乳疫苗候選物檢驗(yàn)

1.4.1 GLP-P72納米乳疫苗候選物結(jié)構(gòu)鑒定

使用紅色油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍(lán)色水溶性染料亞甲基蘭在納米乳中擴(kuò)散快慢來(lái)判斷，如果藍(lán)色的擴(kuò)散速度大于紅色，則納米乳為水包油(O/W)型，反之為油包水(W/O)型。

1.4.2 GLP-P72納米乳疫苗候選物微觀形態(tài)及粒徑分布

取GLP-P72納米乳蒸餾水稀釋100倍，透射電鏡下觀察納米乳的微觀形態(tài)；使用激光粒度儀檢測(cè)納米乳液滴粒徑分布，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)顯示出粒徑分布圖。

1.4.3 黏度檢測(cè)

納米乳取樣后用口徑1.2 mm的1 mL吸管吸取油乳劑1 mL，室溫下以垂直自然流出0.4 mL所需時(shí)間表示油乳劑的黏度。

1.4.4 組織病理學(xué)檢查

為了進(jìn)一步研究GLP-NE佐劑的生物安全性，通過(guò)HE染色對(duì)小鼠的重要器官(心、肝、脾、肺、腎)進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4.5 動(dòng)物免疫及檢測(cè)

將制備免疫制劑以肌肉注射方式免疫6～8周的雌性昆明鼠，空白組為100 μL PBS，每組5只，每只每次注射100 μL(抗原含量50 μg)，免疫2次間隔14 d，分別在初次免疫后第0、7、14、21、28、35、42、49天尾靜脈取血，間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)分析及圖形繪制

使用Graphpad Prism 8.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和曲線圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 組方篩選

2.1.1 表面活性劑復(fù)配比例篩選

由圖1可知，固定Km為2∶1，Tween-80與Span-80質(zhì)量比為3∶1所制備的納米乳液乳區(qū)面積最大。

a. Tween-80∶Span-80=2∶1；b. Tween-80∶Span-80=3∶1；c. Tween-80∶Span-80=4∶1；d. Tween-80∶Span-80=5∶1。

2.1.2 Km值篩選

由圖2可知，微乳區(qū)大小順序?yàn)椋篕m(2∶1)>Km(3∶1)>Km(1∶1)>Km(1∶2)>Km(1∶3)，因此，確定Km值為2∶1。

2.1.3 組方確定

從形成納米乳區(qū)域最大的Km=2∶1(Tween-80∶Span-80=3∶1)的偽三元相圖(圖2b)中央選取5個(gè)點(diǎn)(NE1～NE5)的各組分比例作為乳液候選配方(表1)，檢測(cè)各組納米乳液的混合表面活性劑(Smix)含量、油相(O)含量、水相(W)含量、粒徑、PDI值、黏度和離心穩(wěn)定性。根據(jù)最佳黏度、粒徑、PDI值和離心穩(wěn)定性最終確定靈芝多糖納米乳的組方：混合表面活性劑(Tween-80、Span-80、PEG-400質(zhì)量比3∶1∶2)32%、油(Marcol-52)12%、水相(PBS)53%～55%、靈芝多糖1%～3%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

a. Km=3∶1；b. Km=2∶1；c. Km=1∶1；d. Km=1∶2；e. Km=1∶3。

表1 各組乳液配方參數(shù)

2.2 GLP-NE佐劑乳化方法探究

2.2.1 不同乳化方法對(duì)乳液粒徑和PDI值的影響

完全乳化后的納米乳在不同乳化方法下的參數(shù)變化，如圖3。納米乳液粒徑在1 500 r/min以內(nèi)隨著剪切攪拌轉(zhuǎn)數(shù)(圖3a)的增加而降低，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)達(dá)到1 500 r/min時(shí)PDI值最低，此時(shí)乳液粒徑為(173.3±0.33)nm。超聲功率(圖3b)在400 W時(shí)納米乳粒徑為(75.86±0.85)nm，PDI值為0.392；功率在300 W時(shí)PDI值為0.282，粒徑(96.21±0.54)nm。因此，以均一程度為判定標(biāo)準(zhǔn)，分別確定該佐劑在2種乳化方法下的最佳剪切轉(zhuǎn)速和超聲功率為1 500 r/min和300 W。

a. 不同剪切攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)樣品參數(shù)的影響(內(nèi)插圖為不同攪拌轉(zhuǎn)速下乳液粒徑大小)；b. 不同超聲功率對(duì)樣品參數(shù)的影響(內(nèi)插圖為不同超聲功率下乳液粒徑大小)。

2.2.2 不同乳化時(shí)間對(duì)乳液粒徑、黏度和PDI值的影響

2種乳化方法下不同乳化時(shí)間的納米粒徑、黏度及PDI值見(jiàn)圖4。剪切攪拌乳化20 min時(shí)粒徑和PDI值在達(dá)到最低，分別為(169.4±0.28)nm和0.251后趨于穩(wěn)定(圖4a)。超聲乳化30 min時(shí)粒徑和PDI值均達(dá)到最低分別為(96.11±0.46)nm和0.274(圖4b)。超聲乳化法較剪切攪拌乳化法降低疫苗粒徑更為顯著，但還需要結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證乳液參數(shù)的可靠性。

2.2.3 不同乳化方法對(duì)納米乳離心穩(wěn)定性的影響

分別以1 500 r/min、20 min和300 W、30 min制備的樣品在低溫、常溫條件下4 000 r/min離心20 min后均未出現(xiàn)破乳分層現(xiàn)象，見(jiàn)表2。剪切組疫苗在2種離心試驗(yàn)后的黏度、粒徑和PDI參數(shù)數(shù)值均變化不大，超聲組疫苗常溫離心后參數(shù)變化波動(dòng)，剪切攪拌法制備的納米乳穩(wěn)定性在離心試驗(yàn)中優(yōu)于超聲乳化法。

表2 不同乳化方法疫苗離心穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.4 不同乳化方法對(duì)納米乳貯藏穩(wěn)定性的影響

不同方法制備的納米乳貯藏穩(wěn)定性如圖5所示。在(4±2)℃環(huán)境下靜置時(shí)，剪切組粒徑、PDI無(wú)顯著變化；超聲組在第42天檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，且粒徑、PDI值在儲(chǔ)存期間變化顯著。在(37±2)℃環(huán)境下靜置時(shí)，剪切組在第14天后出現(xiàn)分層，而超聲組在7 d后出現(xiàn)分層現(xiàn)象。在離心和靜置試驗(yàn)中，剪切乳化法制備納米乳穩(wěn)定性優(yōu)于超聲組。因此，結(jié)合納米乳液均一度、離心穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，確定GLP-NE佐劑乳化方法為1 500 r/min剪切攪拌20 min。

a. (4±2)℃條件下靜置對(duì)2組樣品參數(shù)的影響；b. (37±2)℃條件下靜置對(duì)2組樣品參數(shù)的影響。

2.2.5 不同佐劑疫苗樣品穩(wěn)定性比較

以剪切攪拌方法制備的不同濃度GLP-P72納米乳液與ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG穩(wěn)定性比較觀察免疫制劑樣品分層情況，見(jiàn)表3。從表中可知，在各組穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果中，空白NE佐劑穩(wěn)定性與ISA61 VG佐劑相當(dāng)，可在(4±2)℃環(huán)境下貯藏42 d以上。

表3 不同油乳佐劑疫苗樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3 GLP-P72納米乳疫苗候選物檢驗(yàn)

2.3.1 GLP-P72納米乳疫苗候選物物理性狀檢驗(yàn)

如圖6所示，藍(lán)色染料(亞甲基藍(lán))在乳液中擴(kuò)散程度高于紅色染料(蘇丹紅)，說(shuō)明該佐劑為水包油(O/W)型佐劑(圖6a)。經(jīng)檢測(cè)后GLP-P72納米乳液滴粒徑為(167.4±0.1)nm，PDI值為0.253(圖6b)。GLP-P72納米乳液滴呈球形，大小較為均勻(圖6c)。0.4 mL的GLP-P72納米乳流出時(shí)間為4.2 s，黏度為4.2 s/0.4 mL。

a.納米乳結(jié)構(gòu)鑒別；b. 納米乳微觀形態(tài)；c. 納米乳液粒徑分布。

2.3.2 組織病理學(xué)檢查

通過(guò)HE染色對(duì)小鼠的重要器官(心、肝、脾、肺、腎)進(jìn)行病理學(xué)觀察，結(jié)果如圖7所示，各組組織器官中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

2.3.3 動(dòng)物免疫及檢測(cè)

由于ISA201 VG和ISA15 VG佐劑制備的候選疫苗在14 d內(nèi)破乳分層，因此這2種佐劑不滿足兩次免疫使用條件。經(jīng)免疫后，小鼠產(chǎn)生IgG特異性抗體的水平如圖8所示，靈芝多糖濃度為1%～3%的GLP-NE佐劑組小鼠血清的P72特異性IgG抗體效價(jià)在第35天達(dá)到頂峰，抗體效價(jià)約為1∶128 000，顯著高于ISA61 VG佐劑組和無(wú)佐劑組。

ns表示P> 0.05；***P<0.001。

3 討論

疫苗佐劑研發(fā)過(guò)程中，多數(shù)研究者以油乳液為載體，引入不同活性成分提高佐劑效應(yīng)，從而增強(qiáng)疫苗的免疫效果[6]。本研究選用Marcol-52，利用表面活性劑(Tween-80和Span-80)與助表面活性劑(PEG-400)復(fù)配制備納米乳液，該方法可最大限度地降低界面張力，增加界面膜的流動(dòng)性和柔韌性，阻止油滴的聚集，有利于形成粒徑和PDI值更小、界面膜更穩(wěn)定的納米乳[7]。為深入研究納米乳液參數(shù)與穩(wěn)定性之間的關(guān)系，本研究還探究了超聲乳化法和剪切攪拌乳化法對(duì)納米乳液穩(wěn)定性的影響，超聲乳化法對(duì)降低納米乳中分散相尺寸的效果較剪切攪拌乳化法更為顯著，這是由于超聲對(duì)分散相的直接作用力大于剪切攪拌。然而，超聲乳化的作用力均勻程度低于剪切攪拌[9]，使得分散相液滴均一程度低于后者，導(dǎo)致穩(wěn)定性差，其參數(shù)變化表現(xiàn)為PDI值隨著超聲時(shí)間先下降后上升。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，GLP-NE組小鼠的抗原特異性IgG滴度顯著高于NE組，說(shuō)明GLPs具有較強(qiáng)的體液免疫佐劑活性。Liu等[8]使用大豆磷脂、吐溫-80和膽固醇將靈芝多糖包封于脂質(zhì)體載體中，從而增強(qiáng)藥物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性的刺激作用，與本研究結(jié)果相符，說(shuō)明靈芝多糖可作為免疫調(diào)節(jié)劑引入納米乳載體中制備復(fù)合型佐劑。本研究采用納米乳佐劑作為載體，以靈芝多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，制備了水包油型靈芝多糖納米乳佐劑，具有較好的穩(wěn)定性和免疫效果，后續(xù)還需采用其他病毒抗原進(jìn)一步驗(yàn)證佐劑效果，為研發(fā)安全、高效且易于使用的疫苗佐劑提供數(shù)據(jù)支撐。