何芝鳳，李芳芳，胡傳活*，趙歡歡，趙文婧，黃明光

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，廣西 南寧 530004；3. 廣西畜禽品種改良站，廣西 南寧 530001；4. 廣西畜牧站，廣西 南寧 530022)

在高溫環(huán)境中，由于豬皮下脂肪厚，散熱能力差，極易出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，進而降低豬的生產(chǎn)和繁殖性能，這給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)，同時也造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。其中一個很重要原因是高溫通過降低精子活力影響公豬的生育力，從而間接影響母豬的胚胎存活率[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可引起豬睪丸細胞活性氧升高，細胞水腫，線粒體嚴(yán)重變性[3]。

高溫高濕環(huán)境下，仔豬體溫41 ℃會出現(xiàn)中暑現(xiàn)象，40 ℃高溫環(huán)境對公豬睪丸細胞造成氧化損傷并通過上調(diào)半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)促進睪丸間質(zhì)細胞的凋亡[4-5]。睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生的睪酮對雄性生育能力十分重要，可直接作用于其他體細胞從而間接影響生殖細胞并促進精子的發(fā)生[6]。

茶多酚(tea polyphenol，TP)是多羥基酚類化合物，具有較強的抗氧化性，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可將其分為4類，即兒茶素類、黃酮類、花青素類和酚酸類[7]。研究發(fā)現(xiàn)，TP作為綠色飼料添加劑在豬生產(chǎn)中能夠改善繁殖性能，可保護卵母細胞免受氧化應(yīng)激損傷和增強母豬免疫機能以及提高母豬血清中孕酮濃度[8]。在公豬生產(chǎn)繁殖上發(fā)現(xiàn)TP的抗氧化功能有助于精液保存[9-10]。而對于睪丸間質(zhì)細胞，體外研究發(fā)現(xiàn)TP抑制大鼠睪酮的分泌[11]；也有學(xué)者通過體內(nèi)體外試驗發(fā)現(xiàn)TP具有促進大鼠睪酮產(chǎn)生的作用[12]，但對于高溫條件下，TP對豬睪丸間質(zhì)細胞損傷的保護作用及功能影響，目前尚無研究報道。因此，為了提高規(guī)模養(yǎng)殖條件下公豬新鮮精液的質(zhì)量，在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗采用41 ℃對仔豬睪丸間質(zhì)細胞進行熱處理模型構(gòu)建，探究TP在高溫條件下對公豬睪丸間質(zhì)細胞損傷的影響，為TP在公豬生產(chǎn)繁殖上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

睪丸選自廣西大學(xué)動物醫(yī)院附近豬場2～3周齡三元雜交仔豬。TP(上海源葉，高純98%)；CCK8和TRIzol(蘇州新賽美生物科技有限公司)；熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司)，Caspase-3、熱休克蛋白70(Hsp70)、細胞色素C(Cytc)和睪酮 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司)；活性氧(ROS)檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；膠原酶Ⅳ(北京索萊寶科技有限公司)；PBS、DMEM-F12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(以色列BI公司)。

酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)；細胞培養(yǎng)箱和熒光顯微鏡(Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量PCR儀(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 睪丸間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)

參考卿利娟等[13]的方法分離培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細胞。將閹割的仔豬睪丸在2 h內(nèi)運回實驗室，用無菌器具剝離出睪丸間質(zhì)組織，并將其剪碎至1 mm3左右的小塊，加入適量膠原酶Ⅳ消化液(1 mg膠原酶Ⅳ+1 mL DMEM/F12細胞培養(yǎng)基)在37 ℃下消化20 min。再加入等體積的完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+5%馬血清+1%青/鏈霉素+84% DMEM/F12細胞培養(yǎng)基)終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入適量完全培養(yǎng)基，用200目篩網(wǎng)過濾，獲得的細胞懸液離心去上清液，并用PBS清洗2遍。向細胞沉淀中加入適量完全培養(yǎng)基吹打混勻，以1×106個細胞/mL的細胞密度接種于六孔板中，小心放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組及處理

將細胞設(shè)置為空白(Blank，置于37 ℃培養(yǎng)箱)組，熱(Heat，置于41 ℃培養(yǎng)箱熱處理6 h)處理組，熱+TP(Heat+TP，待細胞密度在80%左右，先加入TP預(yù)孵24 h，再置于41 ℃培養(yǎng)箱熱處理6 h)處理組。TP濃度篩選：依次向96孔板中加入TP稀釋液，濃度分別為0.5、1、3、6、9、27、81和243 μg·mL-1。

1.2.3 細胞存活率的檢測

將處理后的每組細胞按照CCK8說明書的方法，棄掉原上清液，按照CCK8∶DMEM/F12=1∶9，每孔100 μL配制液加入，置于培養(yǎng)箱中2 h，然后在酶標(biāo)儀波長為450 nm下測定各孔的吸光度。

1.2.4 ROS水平的檢測

參照說明書的方法，按熒光探針DCFH-DA∶細胞培養(yǎng)基DMEM/F12=1∶1 000配制熒光探針DCFH-DA稀釋液，加入適量該探針稀釋液于不同分組中，37 ℃避光孵育20 min，然后用細胞培養(yǎng)基DMEM/F12洗滌3次，置于熒光顯微鏡下并設(shè)置同樣曝光條件拍照記錄，隨后用ImageJ軟件對圖片進行熒光分析。

1.2.5 Bcl-2、Bax、Hsp70、Caspase-3、Cytc mRNA表達量的測定

向處理過的細胞中加入TRIzol提取RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將Gapdh作為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR法檢測Hsp70和凋亡相關(guān)基因Cytc、Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA表達水平。具體反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，并用2-ΔΔCt法進行組間計算，引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.2.6 Caspase-3、Hsp70、Cytc和睪酮濃度的測定

取處理后的各組細胞及上清液，參照ELISA試劑盒說明書的要求處理，測定Caspase-3、Hsp70、Cytc和睪酮濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗重復(fù)3次，用SPSS 23軟件進行單因素方差分析，并用軟件Prism 6.01作圖，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 TP對細胞存活率的影響

由圖1可知，熱處理組細胞存活率極顯著低于空白組(P<0.01)，表明高溫?zé)崽幚硪鹭i睪丸間質(zhì)細胞活性抑制，且通過不同濃度的TP預(yù)處理，與熱處理組相比，發(fā)現(xiàn)濃度為1 μg/mL的TP對細胞保護性最好，極顯著地提高了細胞存活率(P<0.01)。

ns表示P>0.05，##與**表示P<0.01。下同。

2.2 TP對Hsp70濃度的影響

由圖2可以看出，與空白組相比，熱處理組細胞內(nèi)Hsp70濃度極顯著升高(P<0.01)；與熱處理組相比，1 μg/mL TP熱處理組內(nèi)Hsp70濃度顯著降低(P<0.01)。

圖2 TP對Hsp70濃度的影響

2.3 TP細胞ROS水平的影響

從圖3可以看出，熱處理組ROS熒光水平極顯著高于空白組(P<0.01)，1 μg/mL TP熱處理組的ROS水平極顯著低于熱處理組(P<0.01)，說明TP具有一定的清除熱處理后豬睪丸間質(zhì)細胞ROS的能力。

2.4 TP對Bax、Bcl-2、Cytc及Caspase-3的mRNA表達水平的影響

從圖4可以看出，與空白組相比，熱處理能夠極顯著降低抗凋亡基因Bcl-2相對表達量(圖4A)，明顯提高凋亡基因Bax相對表達量(圖4B)與Bax/Bcl-2相對比值(圖4C)，升高了Cytc的相對表達量(圖4D)，并最終極顯著提高凋亡執(zhí)行基因Caspase-3相對表達量(圖4E)。與熱處理組相比，1 μg/mL TP熱處理組能夠極顯著降低凋亡基因Bax、Cytc和Caspase-3的相對表達水平(P<0.01)，而抗凋亡基因Bcl-2相對表達量則被顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.5 TP對Cytc和Caspase-3濃度的影響

從圖5可以看出，與空白組相比，熱處理組細胞Cytc和Caspase-3濃度極顯著升高(P<0.01)；與熱處理組相比，1 μg/mL TP熱處理組細胞Cytc和Caspase-3濃度極顯著降低(P<0.01)。

圖5 TP對細胞凋亡相關(guān)蛋白濃度的影響

2.6 TP對睪酮濃度的影響

從圖6可以看出，與空白組相比，熱處理組細胞睪酮分泌量明顯降低；與熱處理組相比，1 μg/mL TP熱處理組內(nèi)細胞睪酮分泌量極顯著升高(P<0.01)。

圖6 TP對睪酮濃度的影響

3 討論

高溫對所有的組織都有影響，但睪丸對溫度更加敏感，環(huán)境溫度高于陰囊正常范圍極易使熱敏感的生殖細胞死亡，并且會破壞細胞的功能，因此高溫極易引起睪丸熱應(yīng)激從而導(dǎo)致雄性不育[14]。Hsp70是機體為抵御熱應(yīng)激而激活的必需因子，研究發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸熱應(yīng)激后不久Hsp70表達上調(diào)[15]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，高溫?zé)崽幚砗?，Hsp70濃度極顯著升高，而加入TP的細胞Hsp70濃度下降明顯，這可能是由于睪丸間質(zhì)細胞在該溫度下受到了熱刺激，從而激活了Hsp70 表達抵御壓力，而茶多酚的處理可能增強了細胞的耐受力，因而Hsp70表達下調(diào)。

熱誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生損傷細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并引起細胞毒性作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS是熱應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)[17]。ROS在細胞內(nèi)積累一定數(shù)量，會激活細胞線粒體凋亡通路，使Cytc釋放，通過激活Caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。Bcl-2蛋白家族也參與線粒體凋亡途徑，抗凋亡因子Bcl-2能與促凋亡因子Bax結(jié)合抑制細胞凋亡，并且Bax/Bcl-2比率變化是決定細胞是否存活的關(guān)鍵因素[19]。有研究表明，熱應(yīng)激通過下調(diào)Bcl-2蛋白，上調(diào)Bax和Bax/Bcl-2蛋白表達比例以及上調(diào)Caspase-3誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細胞凋亡[20]。有學(xué)者證實，TP富含酚羥基，且含有相同的主要結(jié)構(gòu)α-苯基苯丙吡喃，能與有害自由基反應(yīng)生成具有一定穩(wěn)定性的含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的自由基來減少ROS生成量[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，TP能降低實驗性精索靜脈曲張致大鼠睪丸生精細胞凋亡和草甘膦致小鼠睪丸支持細胞的凋亡[22-23]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，與熱處理組相比，高熱處理睪丸間質(zhì)細胞中加入1 μg/mL TP能夠顯著提高細胞存活率，降低ROS水平，升高Bcl-2的mRNA表達水平，降低Cytc和Caspase-3的mRNA表達水平和蛋白濃度，降低Bax的mRNA表達水平和Bax/Bcl-2相對比值，這說明TP可通過清除細胞產(chǎn)生的過量ROS從而增強抗凋亡基因Bcl-2的表達，以及抑制凋亡相關(guān)基因Cytc、Bax和Caspase-3的過表達，從而提高細胞的存活率，因此TP對高熱下豬睪丸間質(zhì)細胞起到一定的凋亡保護作用。

此外，有研究報道，陰囊高溫損害了大鼠睪丸間質(zhì)細胞，降低了睪酮合成[24]。TP對雄性生殖有益處已有研究證實。TP中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)能緩解重金屬鉛對大鼠睪丸的毒性，提高睪酮水平[25]。本試驗與以上結(jié)果一致，高溫?zé)崽幚斫档土瞬G酮的分泌，加入TP預(yù)處理后對于高溫下睪丸間質(zhì)細胞能夠明顯升高睪酮分泌量，這可能與TP對凋亡途徑的抑制作用進而提高了細胞存活率使得分泌睪酮的睪丸間質(zhì)細胞增多有關(guān)，以上表明TP有一定雄性生殖保護作用。

4 小結(jié)

TP對高溫下豬睪丸間質(zhì)細胞具有保護作用，主要通過減少ROS的產(chǎn)生，降低細胞的凋亡，并能夠一定程度上恢復(fù)細胞的睪酮分泌功能，且TP濃度在1 μg·mL-1效果最好，這為高溫天氣下TP預(yù)防種公豬睪丸熱應(yīng)激提供參考依據(jù)。