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        四類獸藥殘留檢測ELISA試劑盒的質(zhì)量評價

        2023-11-10 12:48:18李文輝于寒冰方芳倪香艷張晶晶魏紫嫣懷文輝趙瑩趙雅妮王樂宜孫志文
        畜牧與獸醫(yī) 2023年11期
        關(guān)鍵詞:準(zhǔn)確度獸藥交叉

        李文輝,于寒冰,方芳,倪香艷,張晶晶,魏紫嫣,懷文輝,趙瑩,趙雅妮,王樂宜,孫志文

        (北京農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,北京 102600)

        隨著經(jīng)濟(jì)社會的快速高質(zhì)量發(fā)展,食品安全問題已成為人民群眾最關(guān)注的問題之一。獸藥能預(yù)防和治療動物疾病,有目的地調(diào)節(jié)動物生理機(jī)能,提高生產(chǎn)效益,然而由于對獸藥的過度依賴、濫用或不正確使用等原因?qū)е聞游矬w內(nèi)獸藥殘留超標(biāo),一旦超過限量,會使畜禽和人體內(nèi)的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[1],不僅影響藥物治療,還會引發(fā)疾病,導(dǎo)致中毒,將威脅人類的身體健康[2]。常見的獸藥有磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氯霉素等抗生素。其中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類具有抗菌范圍廣泛、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)[3],主要被應(yīng)用在動物預(yù)防、治療細(xì)菌感染的疾病[4];氯霉素是一種酰胺醇類抗生素,抑制細(xì)菌生長的作用,被廣泛用于治療畜禽感染性疾病,對人體造血系統(tǒng)的毒性極大,容易引起再生障礙性貧血癥,可損害視力,引起急性中毒性表皮松懈癥[5]。為了控制這些藥物的使用,中國、歐盟等國家和組織對它們的最高殘留限量做出了規(guī)定,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[6]和GB 31650.1—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》[7]對獸藥在動物體內(nèi)的最大殘留限量和日允許量做出了規(guī)定,但仍存在違規(guī)使用的情況。

        目前藥物殘留檢測的方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-10],這些方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確定性定量檢測,但前處理過程復(fù)雜、成本較高,給基層企業(yè)和單位的帶來不便,不能滿足快速檢測需求。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2008年同時發(fā)布了《1025號公告8—2008 動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附法》等方法[11-14],這些方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低、操作簡便、用時短,適合于基層和現(xiàn)場檢測,但也存在準(zhǔn)確性差,易出現(xiàn)測定結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)[15]。目前我國獸藥殘留試劑盒采用備案管理制度,缺乏后期對產(chǎn)品的監(jiān)督,導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性差,達(dá)不到檢測要求;基層檢測實(shí)驗(yàn)室不掌握試劑盒評價方法,不能夠判斷產(chǎn)品質(zhì)量好壞,給檢測結(jié)果帶來不確定性因素[16]。為規(guī)避篩選方法的檢測風(fēng)險,本研究依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《獸藥管理?xiàng)l例》和《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑(盒)管理的通知》(農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號)制定的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17],對部分市售獸藥殘留試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評價,通過綜合評價獲得了4個品牌四類獸藥殘留試劑盒的質(zhì)量,希望為基層選擇獸藥殘留試劑盒提供技術(shù)參考,為支撐畜禽產(chǎn)品監(jiān)管和快檢產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展打下基礎(chǔ),保障北京市畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

        1 材料與方法

        1.1 試樣制備

        本研究中選用動物性產(chǎn)品基質(zhì)相對復(fù)雜同時國家標(biāo)準(zhǔn)殘留限量要求最嚴(yán)格的雞蛋樣品,雞蛋樣品6枚,來自北京正大公司,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測無本試驗(yàn)中的獸藥殘留,將樣品去殼,用均質(zhì)機(jī)勻漿,置于50 mL離心管中于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 試驗(yàn)設(shè)備

        電子分析天平(ME802E型,瑞士梅特勒公司);均質(zhì)器(AX2000A型,北京安信惠康科技有限公司);渦旋混合器 (MS3型,德國艾卡公司);氮吹儀(Organomation Associates型,美國Jnc公司);酶標(biāo)儀(Infinite F50裝載有450 nm濾光片,奧地利帝肯公司);高速冷凍離心機(jī)(CF16RN型,日本HITACHI公司);移液器(20~200 μL、100~1 000 μL、1~10 mL、50~300 μL,美國Eppendorf公司);量筒、燒杯、計時器等。

        1.3 試劑及耗材

        磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素殘留檢測試劑盒:通過北京市售官方渠道購買,1號和2號為進(jìn)口品牌試劑盒,購自美國的公司,3號和4號為國產(chǎn)品牌試劑盒,購自北京本地公司,甲醇(色譜級)和乙腈(色譜級)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。離心管(50、15、1.5或2 mL),超純水,槍頭(20~200 μL、100~1 000 μL、1~10 mL),吸水紙等。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

        磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(批號:46802,純度:99.6%),磺胺甲惡唑(批號:31737,純度:99.9%)購于Sigma公司;恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(批號:132847,純度:99.0%),達(dá)氟沙星(批號:127052,純度:94.0%),鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(批號:C17396150,純度:99.4%),鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號:C15820000,純度:98.5%),氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號:G129945,純度:99.2%)購于Dr. Ehrenstorfer公司。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        分別準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品定容,并配置成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,于-20 ℃冷凍保存;分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中,標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容到濃度為10 μg/mL,放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.6 評價方法和指標(biāo)

        本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部針對《獸藥管理?xiàng)l例》和《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑(盒)管理的通知》(農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號)制定的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]和 SN/T 2775—2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》[18]進(jìn)行設(shè)計,考慮到基層檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)的實(shí)際需求,本次研究選取標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度以及交叉反應(yīng)6個技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評價,同時綜合評價前處理時間、性價比等客觀因素。本研究按照說明書要求嚴(yán)格操作執(zhí)行。

        1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線評價

        標(biāo)準(zhǔn)曲線是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。定量方法是測定不同品牌不同藥物的5個標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,每個濃度測定5次,其均值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定值,按產(chǎn)品說明書的程序操作,以各類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度和濃度存在一定的關(guān)系,以算出相關(guān)系數(shù)R2值,以確定工作濃度范圍和半抑制濃度(IC50)范圍[17-18]。

        1.6.2 靈敏度評價

        靈敏度的評價包括檢測限和定量限測定,檢測限和定量限越低代表產(chǎn)品靈敏度越高。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]方法,檢測限為以20份空白樣品測定均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢測限測定方法;定量限為以20份空白樣品測定讀數(shù)的均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,計算平均值及回收率,通過檢測限和定量限數(shù)值評價靈敏度。

        1.6.3 準(zhǔn)確度和精密度評價

        以添加回收率表征定量檢測試劑盒的準(zhǔn)確度。對于有最高殘留限量的藥物,添加濃度為最大殘留限量(MRL)、1/2倍MRL和2倍MRL;對于禁用藥物,添加濃度為定量限和2倍定量限,每個添加濃度測定5個平行樣,并進(jìn)行3批試驗(yàn)(不同檢測日期,不同標(biāo)準(zhǔn)曲線,不同批次試劑盒)[13]。

        以添加回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差檢測試劑盒的精密度。針對每一種樣品n的m個測試組分在d天內(nèi)進(jìn)行r次重復(fù)測定,其中r×m應(yīng)不小于10;n至少為2;d至少為2。計算得到的重現(xiàn)性試驗(yàn)下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。批內(nèi)變異系數(shù):每批平行樣之間的變異系數(shù)≤25%,對于禁用藥物≤30%。批間變異系數(shù):所有樣品之間的變異系數(shù)值≤30%,對于禁用藥物≤40%[16]。

        磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類試劑盒的3個添加濃度為50、100及200 μg/kg,氯霉素試劑盒的3個添加濃度為0.05、0.1及0.2 μg/kg。

        1.6.4 交叉反應(yīng)評價

        交叉反應(yīng)是評價酶聯(lián)免疫試劑盒特異性的方式,交叉反應(yīng)一般以交叉反應(yīng)率作為評價指標(biāo),交叉反應(yīng)率一般是通過競爭抑制曲線來判斷的[17]。交叉反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度按照每個品牌每種藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度制備,每個濃度點(diǎn)做3個重復(fù)。不添加抑制物質(zhì)的對照孔的吸光度(OD)值為B0,添加了抑制物質(zhì)的孔的OD值為B,IC50為50%抑制濃度即B/B0=50%時所對應(yīng)的濃度,求出各自在IC50時的濃度,按下列公式計算交叉反應(yīng)率(S)。IC50的數(shù)值越小,說明抗體的特異性能越強(qiáng)。

        S=y/Z×100%。

        S:交叉反應(yīng)率,y:IC50時抗原濃度,Z:IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。

        1.7 其他因素評價

        本研究在由國家規(guī)定評價技術(shù)指標(biāo)的基礎(chǔ)上,同時考慮了應(yīng)用獸藥殘留試劑盒的人員關(guān)注的樣品處理過程、檢測時間、性價比等方面的因素,綜合評價試劑盒的質(zhì)量。樣品處理過程按簡單、一般、復(fù)雜3種分類,性價比以高、中、低3種分類,檢測時間以分鐘計算。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

        線性相關(guān)系數(shù)及平均IC50的結(jié)果見表1??梢钥闯?,在不同藥物各自的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)吸光度與藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈良好線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

        表1 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

        2.2 試劑盒的靈敏度評價

        檢測限是在給定的置信水平上,樣品中的目標(biāo)物能被可靠地與噪音背景區(qū)分的最低濃度或含量。檢測限越低代表目標(biāo)物能被檢出的最小濃度越低,試劑盒的性能越好。測定結(jié)果如表2所示,總體上看,1號和2號進(jìn)口試劑盒檢測限明顯低于3號和4號國產(chǎn)試劑盒,但整體上相差不大,符合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器國標(biāo)定量檢測方法的檢測限要求。不同品牌的試劑盒檢測限高低排序?yàn)椋夯前奉悾?<1<3<4;喹諾酮類:1<2<3<4;四環(huán)素類:2<1<3<4;氯霉素:1<2<3<4。

        表2 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的檢測限測定結(jié)果

        定量限是用來反映方法或產(chǎn)品的能夠準(zhǔn)確測定待測藥物濃度的最低濃度。測定結(jié)果如表3所示,綜合結(jié)果分析,所有品牌所有種類藥物回收率都大于60%,平均結(jié)果準(zhǔn)確度都符合測定要求,濃度范圍窄,定量限低,符合檢測需求。在保證回收率的前提下,不同品牌試劑盒定量限高低排序?yàn)椋夯前奉悾?<2<3<4;喹諾酮類:3<1<4<2;四環(huán)素類:4<3<1<2;氯霉素:2<3<1<4。

        2.3 試劑盒準(zhǔn)確度和精密度評價

        試劑盒準(zhǔn)確度用質(zhì)控樣品的回收率來評價,回收率范圍大于40%或符合相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求[17],根據(jù)試劑盒準(zhǔn)確度用質(zhì)控樣品的回收率來評價,其回收率應(yīng)在60%~120%[18-19]。質(zhì)控樣品檢測回收率平均值應(yīng)大于40%,由表 4可以看出,符合要求的有:磺胺類1、2、3號,喹諾酮類1、2、3號,四環(huán)素類是1、3號,氯霉素是1、2號。綜合判定結(jié)果:磺胺類和喹諾酮類回收率最好的是1號,2、3 號可以使用,4號品牌回收率過低;四環(huán)素類回收率最好的是1號,3號均可以使用,2、4號回收率低于40%,但MRL以上濃度范圍基本可以滿足回收率要求;氯霉素回收率最好的是1號,2號均可接受,3、4號回收率低于40%,不穩(wěn)定,試劑盒準(zhǔn)確度不好控制,從準(zhǔn)確度上看,1、2號準(zhǔn)確度明顯高于3、4號。

        試劑盒的精密度用變異系數(shù)來評價,批內(nèi)變異系數(shù)≤25%,批間變異系數(shù)≤30%[16]。由表4可知,試劑盒的添加樣品檢測精密度變異系數(shù),3號品牌的變異系數(shù)平均值最低,2號品牌最高,并且2號品牌在四類藥物檢測中批內(nèi)變異系數(shù)多數(shù)超過25%,批間變異系數(shù)也是多數(shù)超過30%,精密度不符合檢測需求,獸藥殘留試劑盒的精密度排序?yàn)?>1>4>2。

        表4 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果

        表5 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的交叉反應(yīng)結(jié)果

        表6 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的其他因素分析結(jié)果

        2.4 交叉反應(yīng)評價

        按1.6.4中陳述的方法測定四個品牌4類獸藥殘留試劑盒的IC50和交叉反應(yīng)率S,但目前的標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定IC50和S需要滿足的數(shù)值和范圍,但交叉反應(yīng)率越低特異性越強(qiáng),假陽性出現(xiàn)的概率越低。從磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類藥物看,1號的交叉反應(yīng)率低,特異性強(qiáng);從氯霉素藥物看,1、2號產(chǎn)品交叉反應(yīng)率高于3、4號,3、4號產(chǎn)品特異性更強(qiáng),所有產(chǎn)品按說明書使用均可滿足檢測需求。

        2.5 其他因素的評價

        對應(yīng)用人員選擇獸藥殘留檢測試劑盒的其他因素的討論分析,結(jié)果如下表 6,不同品牌獸藥殘留試劑盒各有優(yōu)缺點(diǎn),具體根據(jù)應(yīng)用單位的需求判斷更適合選擇的類別。

        3 討論

        3.1 質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)

        關(guān)于獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒評價的文獻(xiàn)參考不多[20-22],查到的文獻(xiàn)多采用SN/T 2775—2011[18]的方法,但該方法中評價的指標(biāo)與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》存在差異[17],所以本研究選取的技術(shù)指標(biāo)側(cè)重參考農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號文件《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]的方法操作。研究從獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒的技術(shù)指標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度和精確度、交叉反應(yīng))對市售主流試劑盒做出評價,從上述技術(shù)參數(shù)評價可以看出,針對標(biāo)準(zhǔn)曲線,在試劑盒說明書參考的濃度范圍的相關(guān)系數(shù)均符合要求,但評價標(biāo)準(zhǔn)中并未對具體每種藥物的濃度范圍做規(guī)定,因此應(yīng)完善評價標(biāo)準(zhǔn);針對于靈敏度,檢測限和定量限大部分范圍窄,差距不大;針對于準(zhǔn)確度和精密度,國產(chǎn)試劑盒在準(zhǔn)確度上質(zhì)量好一些,進(jìn)口產(chǎn)品的精密度的穩(wěn)定性差,各批次差距很大,可能與運(yùn)輸溫度和時間有關(guān)系,因此選擇獸藥殘留檢測酶聯(lián)免疫試劑盒時建議先進(jìn)行有效評價,慎重選擇試劑盒;針對交叉反應(yīng),試劑盒交叉反應(yīng)率都高于60%,特異性一般,質(zhì)量參差不齊,本次測試中進(jìn)口試劑盒明好于國產(chǎn)試劑盒,但目前沒有針對于交叉反應(yīng)結(jié)果評價的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn),期望有關(guān)部門盡快更新評價標(biāo)準(zhǔn)。

        3.2 其他因素

        獸藥殘留試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量評價結(jié)果判斷與檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)性較強(qiáng)[23],在操作過程中,樣品板的清洗力度控制是關(guān)鍵因素,力度小,樣品回流影響結(jié)果的判定,力度大,容易濺入別的樣品孔造成污染,特別是對弱陽性樣品的判斷,建議國家對快速檢測方法操作人員的采取定期培訓(xùn)學(xué)習(xí)和考核制度,以保證快檢結(jié)果的準(zhǔn)確性。前處理方法的簡便性、適用檢測獸藥種類的多樣性、性價比都成為目前選擇獸藥殘留試劑盒不可量化的因素,建議應(yīng)用人員根據(jù)實(shí)際情況客觀選擇,避免盲目追求高靈敏度。

        3.3 與儀器方法的比較

        本研究中磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類獸藥殘留試劑盒的前處理方法比較簡單,但氯霉素獸藥殘留試劑盒前處理過程需經(jīng)過提取、氮吹濃縮等步驟,這些操作相對其他快速檢測法仍相對繁瑣,在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行,需要額外配置大型儀器設(shè)備,占地空間大。鑒于此,有些廠家提供了可以同時進(jìn)行提取、濃縮、離心等步驟的可移動式全自動提取儀[24],但該儀器操作通量小,在實(shí)際現(xiàn)場應(yīng)用時存在諸多限制因素,在完成前處理時仍需借助實(shí)驗(yàn)室儀器,給實(shí)際推廣應(yīng)用帶來困難,因此在實(shí)際購買時應(yīng)考慮到客觀條件和實(shí)際應(yīng)用再進(jìn)行實(shí)際購買。

        儀器方法一般是包括萃取、凈化等前處理過程和樣品上機(jī)過程。對這四類藥物采用通用國家標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25-26]進(jìn)行確證試驗(yàn),該方法靈敏度高、特異性強(qiáng),可以定性和準(zhǔn)確定量,但前處理方法過于復(fù)雜,對回收率造成影響,不利于計算樣品實(shí)際濃度,因此要對前處理方法做合理優(yōu)化;試劑盒方法靈敏度更高,可以用作大量樣品的初篩,但免疫學(xué)方法容易出現(xiàn)假陽性和假陰性,對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響,所以要控制好試劑盒的質(zhì)量技術(shù)參數(shù)。

        4 結(jié)論

        本研究對北京市售常見4個品牌的四類獸藥殘留ELISA試劑盒的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行了全面評價,每類獸藥綜合評價了6個技術(shù)指標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度以及交叉反應(yīng)。從檢測結(jié)果來看,獸藥殘留ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.99,符合檢測要求;檢測限和定量限達(dá)到試劑盒說明書中所標(biāo)注的濃度,限值低,符合國家標(biāo)準(zhǔn)中儀器方法的靈敏度的要求;準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果存在差異,特異性不同。綜合所有指標(biāo),1號優(yōu)于2號;3號優(yōu)于4號?;鶎討?yīng)用單位可根據(jù)檢測要求選擇合適的獸藥殘留ELISA試劑盒,為獸藥殘留ELISA試劑盒的選擇提供參考。

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