李文輝，于寒冰，方芳，倪香艷，張晶晶，魏紫嫣，懷文輝，趙瑩，趙雅妮，王樂宜，孫志文

(北京農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，北京 102600)

隨著經(jīng)濟(jì)社會的快速高質(zhì)量發(fā)展，食品安全問題已成為人民群眾最關(guān)注的問題之一。獸藥能預(yù)防和治療動物疾病，有目的地調(diào)節(jié)動物生理機(jī)能，提高生產(chǎn)效益，然而由于對獸藥的過度依賴、濫用或不正確使用等原因?qū)е聞游矬w內(nèi)獸藥殘留超標(biāo)，一旦超過限量，會使畜禽和人體內(nèi)的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[1]，不僅影響藥物治療，還會引發(fā)疾病，導(dǎo)致中毒，將威脅人類的身體健康[2]。常見的獸藥有磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氯霉素等抗生素。其中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類具有抗菌范圍廣泛、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)[3]，主要被應(yīng)用在動物預(yù)防、治療細(xì)菌感染的疾病[4]；氯霉素是一種酰胺醇類抗生素，抑制細(xì)菌生長的作用，被廣泛用于治療畜禽感染性疾病，對人體造血系統(tǒng)的毒性極大，容易引起再生障礙性貧血癥，可損害視力，引起急性中毒性表皮松懈癥[5]。為了控制這些藥物的使用，中國、歐盟等國家和組織對它們的最高殘留限量做出了規(guī)定，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[6]和GB 31650.1—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》[7]對獸藥在動物體內(nèi)的最大殘留限量和日允許量做出了規(guī)定，但仍存在違規(guī)使用的情況。

目前藥物殘留檢測的方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-10]，這些方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確定性定量檢測，但前處理過程復(fù)雜、成本較高，給基層企業(yè)和單位的帶來不便，不能滿足快速檢測需求。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2008年同時發(fā)布了《1025號公告8—2008 動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附法》等方法[11-14]，這些方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低、操作簡便、用時短，適合于基層和現(xiàn)場檢測，但也存在準(zhǔn)確性差，易出現(xiàn)測定結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)[15]。目前我國獸藥殘留試劑盒采用備案管理制度，缺乏后期對產(chǎn)品的監(jiān)督，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性差，達(dá)不到檢測要求；基層檢測實(shí)驗(yàn)室不掌握試劑盒評價方法，不能夠判斷產(chǎn)品質(zhì)量好壞，給檢測結(jié)果帶來不確定性因素[16]。為規(guī)避篩選方法的檢測風(fēng)險，本研究依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《獸藥管理?xiàng)l例》和《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑(盒)管理的通知》(農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號)制定的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]，對部分市售獸藥殘留試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評價，通過綜合評價獲得了4個品牌四類獸藥殘留試劑盒的質(zhì)量，希望為基層選擇獸藥殘留試劑盒提供技術(shù)參考，為支撐畜禽產(chǎn)品監(jiān)管和快檢產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展打下基礎(chǔ)，保障北京市畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 試樣制備

本研究中選用動物性產(chǎn)品基質(zhì)相對復(fù)雜同時國家標(biāo)準(zhǔn)殘留限量要求最嚴(yán)格的雞蛋樣品，雞蛋樣品6枚，來自北京正大公司，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測無本試驗(yàn)中的獸藥殘留，將樣品去殼，用均質(zhì)機(jī)勻漿，置于50 mL離心管中于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

電子分析天平(ME802E型，瑞士梅特勒公司)；均質(zhì)器(AX2000A型，北京安信惠康科技有限公司)；渦旋混合器 (MS3型，德國艾卡公司)；氮吹儀(Organomation Associates型，美國Jnc公司)；酶標(biāo)儀(Infinite F50裝載有450 nm濾光片，奧地利帝肯公司)；高速冷凍離心機(jī)(CF16RN型，日本HITACHI公司)；移液器(20～200 μL、100～1 000 μL、1～10 mL、50～300 μL，美國Eppendorf公司)；量筒、燒杯、計時器等。

1.3 試劑及耗材

磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素殘留檢測試劑盒：通過北京市售官方渠道購買，1號和2號為進(jìn)口品牌試劑盒，購自美國的公司，3號和4號為國產(chǎn)品牌試劑盒，購自北京本地公司，甲醇(色譜級)和乙腈(色譜級)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。離心管(50、15、1.5或2 mL)，超純水，槍頭(20～200 μL、100～1 000 μL、1～10 mL)，吸水紙等。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(批號:46802,純度:99.6%),磺胺甲惡唑(批號：31737，純度：99.9%)購于Sigma公司；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(批號：132847，純度：99.0%)，達(dá)氟沙星(批號：127052，純度：94.0%)，鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：C17396150，純度：99.4%)，鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：C15820000，純度：98.5%)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：G129945，純度：99.2%)購于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品定容，并配置成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于-20 ℃冷凍保存；分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容到濃度為10 μg/mL，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 評價方法和指標(biāo)

本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部針對《獸藥管理?xiàng)l例》和《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑(盒)管理的通知》(農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號)制定的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]和 SN/T 2775—2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》[18]進(jìn)行設(shè)計，考慮到基層檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)的實(shí)際需求，本次研究選取標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度以及交叉反應(yīng)6個技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評價，同時綜合評價前處理時間、性價比等客觀因素。本研究按照說明書要求嚴(yán)格操作執(zhí)行。

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線評價

標(biāo)準(zhǔn)曲線是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。定量方法是測定不同品牌不同藥物的5個標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，每個濃度測定5次，其均值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定值，按產(chǎn)品說明書的程序操作，以各類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度和濃度存在一定的關(guān)系，以算出相關(guān)系數(shù)R2值，以確定工作濃度范圍和半抑制濃度(IC50)范圍[17-18]。

1.6.2 靈敏度評價

靈敏度的評價包括檢測限和定量限測定，檢測限和定量限越低代表產(chǎn)品靈敏度越高。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]方法，檢測限為以20份空白樣品測定均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢測限測定方法；定量限為以20份空白樣品測定讀數(shù)的均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算平均值及回收率，通過檢測限和定量限數(shù)值評價靈敏度。

1.6.3 準(zhǔn)確度和精密度評價

以添加回收率表征定量檢測試劑盒的準(zhǔn)確度。對于有最高殘留限量的藥物，添加濃度為最大殘留限量(MRL)、1/2倍MRL和2倍MRL；對于禁用藥物，添加濃度為定量限和2倍定量限，每個添加濃度測定5個平行樣，并進(jìn)行3批試驗(yàn)(不同檢測日期，不同標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同批次試劑盒)[13]。

以添加回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差檢測試劑盒的精密度。針對每一種樣品n的m個測試組分在d天內(nèi)進(jìn)行r次重復(fù)測定，其中r×m應(yīng)不小于10；n至少為2；d至少為2。計算得到的重現(xiàn)性試驗(yàn)下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。批內(nèi)變異系數(shù)：每批平行樣之間的變異系數(shù)≤25%，對于禁用藥物≤30%。批間變異系數(shù)：所有樣品之間的變異系數(shù)值≤30%，對于禁用藥物≤40%[16]。

磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類試劑盒的3個添加濃度為50、100及200 μg/kg，氯霉素試劑盒的3個添加濃度為0.05、0.1及0.2 μg/kg。

1.6.4 交叉反應(yīng)評價

交叉反應(yīng)是評價酶聯(lián)免疫試劑盒特異性的方式，交叉反應(yīng)一般以交叉反應(yīng)率作為評價指標(biāo)，交叉反應(yīng)率一般是通過競爭抑制曲線來判斷的[17]。交叉反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度按照每個品牌每種藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度制備，每個濃度點(diǎn)做3個重復(fù)。不添加抑制物質(zhì)的對照孔的吸光度(OD)值為B0，添加了抑制物質(zhì)的孔的OD值為B，IC50為50%抑制濃度即B/B0=50%時所對應(yīng)的濃度，求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率(S)。IC50的數(shù)值越小，說明抗體的特異性能越強(qiáng)。

S=y/Z×100%。

S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。

1.7 其他因素評價

本研究在由國家規(guī)定評價技術(shù)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，同時考慮了應(yīng)用獸藥殘留試劑盒的人員關(guān)注的樣品處理過程、檢測時間、性價比等方面的因素，綜合評價試劑盒的質(zhì)量。樣品處理過程按簡單、一般、復(fù)雜3種分類，性價比以高、中、低3種分類，檢測時間以分鐘計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

線性相關(guān)系數(shù)及平均IC50的結(jié)果見表1?？梢钥闯?，在不同藥物各自的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)吸光度與藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表1 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 試劑盒的靈敏度評價

檢測限是在給定的置信水平上，樣品中的目標(biāo)物能被可靠地與噪音背景區(qū)分的最低濃度或含量。檢測限越低代表目標(biāo)物能被檢出的最小濃度越低，試劑盒的性能越好。測定結(jié)果如表2所示，總體上看，1號和2號進(jìn)口試劑盒檢測限明顯低于3號和4號國產(chǎn)試劑盒，但整體上相差不大，符合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器國標(biāo)定量檢測方法的檢測限要求。不同品牌的試劑盒檢測限高低排序?yàn)椋夯前奉悾?<1<3<4；喹諾酮類：1<2<3<4；四環(huán)素類：2<1<3<4；氯霉素：1<2<3<4。

表2 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的檢測限測定結(jié)果

定量限是用來反映方法或產(chǎn)品的能夠準(zhǔn)確測定待測藥物濃度的最低濃度。測定結(jié)果如表3所示，綜合結(jié)果分析，所有品牌所有種類藥物回收率都大于60%，平均結(jié)果準(zhǔn)確度都符合測定要求，濃度范圍窄，定量限低，符合檢測需求。在保證回收率的前提下，不同品牌試劑盒定量限高低排序?yàn)椋夯前奉悾?<2<3<4；喹諾酮類：3<1<4<2；四環(huán)素類：4<3<1<2；氯霉素：2<3<1<4。

2.3 試劑盒準(zhǔn)確度和精密度評價

試劑盒準(zhǔn)確度用質(zhì)控樣品的回收率來評價，回收率范圍大于40%或符合相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求[17]，根據(jù)試劑盒準(zhǔn)確度用質(zhì)控樣品的回收率來評價，其回收率應(yīng)在60%～120%[18-19]。質(zhì)控樣品檢測回收率平均值應(yīng)大于40%，由表 4可以看出，符合要求的有：磺胺類1、2、3號，喹諾酮類1、2、3號，四環(huán)素類是1、3號，氯霉素是1、2號。綜合判定結(jié)果：磺胺類和喹諾酮類回收率最好的是1號，2、3 號可以使用，4號品牌回收率過低；四環(huán)素類回收率最好的是1號，3號均可以使用，2、4號回收率低于40%，但MRL以上濃度范圍基本可以滿足回收率要求；氯霉素回收率最好的是1號，2號均可接受，3、4號回收率低于40%，不穩(wěn)定，試劑盒準(zhǔn)確度不好控制，從準(zhǔn)確度上看，1、2號準(zhǔn)確度明顯高于3、4號。

試劑盒的精密度用變異系數(shù)來評價，批內(nèi)變異系數(shù)≤25%，批間變異系數(shù)≤30%[16]。由表4可知，試劑盒的添加樣品檢測精密度變異系數(shù)，3號品牌的變異系數(shù)平均值最低，2號品牌最高，并且2號品牌在四類藥物檢測中批內(nèi)變異系數(shù)多數(shù)超過25%，批間變異系數(shù)也是多數(shù)超過30%，精密度不符合檢測需求，獸藥殘留試劑盒的精密度排序?yàn)?>1>4>2。

表4 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的交叉反應(yīng)結(jié)果

表6 不同品牌四類獸藥殘留試劑盒的其他因素分析結(jié)果

2.4 交叉反應(yīng)評價

按1.6.4中陳述的方法測定四個品牌4類獸藥殘留試劑盒的IC50和交叉反應(yīng)率S，但目前的標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定IC50和S需要滿足的數(shù)值和范圍，但交叉反應(yīng)率越低特異性越強(qiáng)，假陽性出現(xiàn)的概率越低。從磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類藥物看，1號的交叉反應(yīng)率低，特異性強(qiáng)；從氯霉素藥物看，1、2號產(chǎn)品交叉反應(yīng)率高于3、4號，3、4號產(chǎn)品特異性更強(qiáng)，所有產(chǎn)品按說明書使用均可滿足檢測需求。

2.5 其他因素的評價

對應(yīng)用人員選擇獸藥殘留檢測試劑盒的其他因素的討論分析，結(jié)果如下表 6，不同品牌獸藥殘留試劑盒各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體根據(jù)應(yīng)用單位的需求判斷更適合選擇的類別。

3 討論

3.1 質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)

關(guān)于獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒評價的文獻(xiàn)參考不多[20-22]，查到的文獻(xiàn)多采用SN/T 2775—2011[18]的方法，但該方法中評價的指標(biāo)與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》存在差異[17]，所以本研究選取的技術(shù)指標(biāo)側(cè)重參考農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號文件《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》[17]的方法操作。研究從獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒的技術(shù)指標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度和精確度、交叉反應(yīng))對市售主流試劑盒做出評價，從上述技術(shù)參數(shù)評價可以看出，針對標(biāo)準(zhǔn)曲線，在試劑盒說明書參考的濃度范圍的相關(guān)系數(shù)均符合要求，但評價標(biāo)準(zhǔn)中并未對具體每種藥物的濃度范圍做規(guī)定，因此應(yīng)完善評價標(biāo)準(zhǔn)；針對于靈敏度，檢測限和定量限大部分范圍窄，差距不大；針對于準(zhǔn)確度和精密度，國產(chǎn)試劑盒在準(zhǔn)確度上質(zhì)量好一些，進(jìn)口產(chǎn)品的精密度的穩(wěn)定性差，各批次差距很大，可能與運(yùn)輸溫度和時間有關(guān)系，因此選擇獸藥殘留檢測酶聯(lián)免疫試劑盒時建議先進(jìn)行有效評價，慎重選擇試劑盒；針對交叉反應(yīng)，試劑盒交叉反應(yīng)率都高于60%，特異性一般，質(zhì)量參差不齊，本次測試中進(jìn)口試劑盒明好于國產(chǎn)試劑盒，但目前沒有針對于交叉反應(yīng)結(jié)果評價的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，期望有關(guān)部門盡快更新評價標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 其他因素

獸藥殘留試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量評價結(jié)果判斷與檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)性較強(qiáng)[23]，在操作過程中，樣品板的清洗力度控制是關(guān)鍵因素，力度小，樣品回流影響結(jié)果的判定，力度大，容易濺入別的樣品孔造成污染，特別是對弱陽性樣品的判斷，建議國家對快速檢測方法操作人員的采取定期培訓(xùn)學(xué)習(xí)和考核制度，以保證快檢結(jié)果的準(zhǔn)確性。前處理方法的簡便性、適用檢測獸藥種類的多樣性、性價比都成為目前選擇獸藥殘留試劑盒不可量化的因素，建議應(yīng)用人員根據(jù)實(shí)際情況客觀選擇，避免盲目追求高靈敏度。

3.3 與儀器方法的比較

本研究中磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類獸藥殘留試劑盒的前處理方法比較簡單，但氯霉素獸藥殘留試劑盒前處理過程需經(jīng)過提取、氮吹濃縮等步驟，這些操作相對其他快速檢測法仍相對繁瑣，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，需要額外配置大型儀器設(shè)備，占地空間大。鑒于此，有些廠家提供了可以同時進(jìn)行提取、濃縮、離心等步驟的可移動式全自動提取儀[24]，但該儀器操作通量小，在實(shí)際現(xiàn)場應(yīng)用時存在諸多限制因素，在完成前處理時仍需借助實(shí)驗(yàn)室儀器，給實(shí)際推廣應(yīng)用帶來困難，因此在實(shí)際購買時應(yīng)考慮到客觀條件和實(shí)際應(yīng)用再進(jìn)行實(shí)際購買。

儀器方法一般是包括萃取、凈化等前處理過程和樣品上機(jī)過程。對這四類藥物采用通用國家標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25-26]進(jìn)行確證試驗(yàn)，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以定性和準(zhǔn)確定量，但前處理方法過于復(fù)雜，對回收率造成影響，不利于計算樣品實(shí)際濃度，因此要對前處理方法做合理優(yōu)化；試劑盒方法靈敏度更高，可以用作大量樣品的初篩，但免疫學(xué)方法容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響，所以要控制好試劑盒的質(zhì)量技術(shù)參數(shù)。

4 結(jié)論

本研究對北京市售常見4個品牌的四類獸藥殘留ELISA試劑盒的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行了全面評價，每類獸藥綜合評價了6個技術(shù)指標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度以及交叉反應(yīng)。從檢測結(jié)果來看，獸藥殘留ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，符合檢測要求；檢測限和定量限達(dá)到試劑盒說明書中所標(biāo)注的濃度，限值低，符合國家標(biāo)準(zhǔn)中儀器方法的靈敏度的要求；準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果存在差異，特異性不同。綜合所有指標(biāo)，1號優(yōu)于2號；3號優(yōu)于4號?；鶎討?yīng)用單位可根據(jù)檢測要求選擇合適的獸藥殘留ELISA試劑盒，為獸藥殘留ELISA試劑盒的選擇提供參考。