邊高瑞，傅予彤，劉軍花*

(1. 金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 南京 210038；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇 南京 210095)

瘤胃作為反芻動(dòng)物特有的消化吸收代謝器官，其發(fā)育狀態(tài)和功能直接影響反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能和健康。哺乳期是瘤胃發(fā)育的關(guān)鍵生理階段，伴隨著幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的逐漸發(fā)育，瘤胃微生物區(qū)系也逐漸成熟，最終具備完整的消化生理功能[1]。因此，哺乳期也是早期干預(yù)和調(diào)控瘤胃發(fā)育的最佳窗口期。

丁酸是一種可以刺激瘤胃上皮細(xì)胞功能發(fā)育的重要物質(zhì)，對(duì)瘤胃生理結(jié)構(gòu)和功能的生長具有重要的促進(jìn)作用。研究表明，在成年山羊瘤胃內(nèi)注射丁酸鈉，可顯著增加瘤胃乳頭的長度、寬度和密度，顯著提高瘤胃空重、瘤胃上皮重，揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的吸收分?jǐn)?shù)也顯著增加[2]。幼齡反芻動(dòng)物飼糧中添加丁酸可對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖、酮體生成、維持瘤胃pH值和維持瘤胃能量穩(wěn)態(tài)有重要作用[3]。左麗君等發(fā)現(xiàn)，在羔羊飼糧中添加丁酸鈉，可顯著增加斷奶羔羊的瘤胃背囊肌層厚度、瘤胃腹囊乳頭高度和瘤胃腹囊肌層厚度[4]。因此，外源補(bǔ)充丁酸是早期干預(yù)和調(diào)控瘤胃發(fā)育的有效策略。

瘤胃微生物是反芻動(dòng)物發(fā)揮反芻生理功能的主要參與成員，可以產(chǎn)生包括乙酸、丙酸和丁酸在內(nèi)的VFA等代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物被瘤胃上皮吸收后成為反芻動(dòng)物的重要營養(yǎng)來源[5]，其含量和比例對(duì)反芻動(dòng)物的生長、生產(chǎn)和健康具有重要的影響。同時(shí)，哺乳期反芻動(dòng)物的瘤胃微生物經(jīng)歷了快速和復(fù)雜的演變過程，且易受到干擾因素的影響而劇烈變化[6]。而瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物區(qū)系在瘤胃生理中也扮演了不同的角色，其結(jié)構(gòu)和功能的改變也會(huì)影響瘤胃的生理功能[7]。已有研究揭示了灌服丁酸對(duì)斷奶羔羊腸道菌群的影響[2]，但關(guān)于丁酸影響羔羊瘤胃微生物組成及功能的研究甚少，也不清楚灌服丁酸是否會(huì)對(duì)瘤胃微生物的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面的影響。

本試驗(yàn)的目的是研究口腔灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及內(nèi)容物與上皮微生物區(qū)系的影響，并進(jìn)一步探索丁酸對(duì)瘤胃微生物發(fā)育作用機(jī)制，為丁酸作為添加劑調(diào)控幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物管理

試驗(yàn)選擇7對(duì)體況良好，胎次一致，體重相近的新生雙胎湖羊羔羊，分為2組，即口腔灌服丁酸鈉的試驗(yàn)組(OB，n=7)和口腔灌服相同體積的生理鹽水的對(duì)照組(CON，n=7)。丁酸鈉粉末(Cayman Chemical，美國)溶解在生理鹽水中，最終濃度為0.2 g/mL。在10日齡起，試驗(yàn)組羔羊按體重1.8 mL/kg口腔灌服丁酸鈉溶液，對(duì)照組口腔灌服相同體積的生理鹽水，每天灌服1次，灌服體積根據(jù)每周稱量的體重調(diào)整1次。試驗(yàn)期間，每天3次將羔羊與母羊分開，以補(bǔ)飼開食料，其余時(shí)間和母羊待在一起，自由哺乳，自由飲水，不接觸母羊的精料。開食料配方根據(jù)NRC(2007)設(shè)計(jì)，滿足湖羊羔羊的營養(yǎng)需要。開食料的組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))如表1所示。

表1 開食料組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 瘤胃樣品的采集

在羔羊49日齡，口腔灌服丁酸鈉2 h后進(jìn)行屠宰采樣。將羔羊致死后，迅速剖開腹腔，找到羔羊胃部，結(jié)扎各胃室的連接處，獲得瘤胃，收集瘤胃內(nèi)容物(至少200 mL)，置于-30 ℃冰箱保存；采集瘤胃上皮組織，在冰磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)中洗3遍，樣品剪成2 cm×2 cm大小，用無菌玻璃片將上皮組織刮下，立即放在液氮中速凍，之后置于-80 ℃冰箱保存。內(nèi)容物樣本用于檢測VFA和內(nèi)容物微生物區(qū)系，上皮樣本用于檢測上皮微生物區(qū)系。

1.3 瘤胃內(nèi)容物VFA的檢測

采用秦為琳等[8]方法，利用采用氣相色譜儀進(jìn)行檢測乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、異丁酸的含量，并計(jì)算乙丙比。

1.4 瘤胃內(nèi)容物和上皮微生物16S rRNA高通量測序

取1 g內(nèi)容物或上皮樣品，用PowerSoil DNA分離試劑盒(MOBIO實(shí)驗(yàn)室，美國)提取微生物DNA，使用引物515F(5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-barcode -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)域。在Illumina MiSeq測序平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測序(2×300 bp)。

對(duì)Illumina MiSeq測序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(raw data)測序序列進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)用Ribosomal Database Project(RDP)Classifier 2.3，使用Silva數(shù)據(jù)庫(v137)進(jìn)行序列比對(duì)(alignment)，確定每條序列的分類等級(jí)(界、門、綱、目、科和屬等)。應(yīng)用Mothur進(jìn)行OTU(operational taxonomic units，分類操作單元)劃分，以序列相似性97%為標(biāo)準(zhǔn)，將這些序列劃分為OTU，并按照序列數(shù)量生成OTU豐度譜，并計(jì)算相對(duì)豐度。采用Canoco5軟件對(duì)菌屬相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示形式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。VFA數(shù)據(jù)和微生物多樣性數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，微生物相對(duì)豐度數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平置于P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

如表2，灌服丁酸顯著影響了哺乳羔羊瘤胃內(nèi)總VFA和丁酸含量，表現(xiàn)為試驗(yàn)組的總VFA和丁酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但對(duì)乙酸和丙酸的含量以及乙丙比等沒有顯著的影響(P>0.05)。這表明，口腔灌服丁酸鈉對(duì)瘤胃內(nèi)乙酸和丙酸的發(fā)酵模式并無顯著的影響。

表2 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃VFA含量的影響

2.2 灌服丁酸鈉對(duì)瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物多樣性的影響

如表3所示，對(duì)于瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物來說，對(duì)照組和試驗(yàn)組的OUT數(shù)量、ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都無顯著差異(P>0.05)。這表明，灌服丁酸對(duì)瘤胃內(nèi)容物和上皮微生物區(qū)系的多樣性和豐富度無顯著的影響。

表3 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物Alpha多樣性的影響

2.3 哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮的門水平和屬水平微生物組成和結(jié)構(gòu)

如圖1所示，試驗(yàn)組和對(duì)照組哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮的門水平微生物的組成較為類似。擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)構(gòu)成了各組90%以上的微生物豐度。放線菌門(Actinobacteria)在瘤胃內(nèi)容物的豐度高于其在瘤胃上皮的豐度。

圖1 哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮的微生物菌門結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)組和對(duì)照組瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮屬水平微生物相對(duì)豐度的熱圖見圖2。普雷沃氏菌屬(Prevotella)、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)是瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮共有的主要菌屬；乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)和互營球菌屬(Syntrophococcus)等是哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物的獨(dú)有菌屬；彎曲桿菌屬(Campylobacter)、薩特氏菌屬(Suttonella)、Snodgrassella、叢單胞菌科(Comamonadaceae)和柔嫩梭菌(Faecalibacterium)等是瘤胃上皮微生物的獨(dú)有菌屬。

2.4 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響

綜合試驗(yàn)組和對(duì)照組哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物的微生物區(qū)系來看，4組微生物區(qū)系存在顯著差異(P<0.01)，主要表現(xiàn)在瘤胃內(nèi)容物微生物與瘤胃上皮微生物在PC1的距離較大(圖3)。對(duì)于瘤胃內(nèi)容物微生物來說，試驗(yàn)組和對(duì)照組微生物區(qū)系的差別較小，具有重疊區(qū)域，表明二者差異較小；而對(duì)于瘤胃上皮微生物來說，試驗(yàn)組微生物區(qū)系與對(duì)照局的距離較大，表明二者存在較大差異。這表明，灌服丁酸對(duì)瘤胃內(nèi)容物微生物區(qū)系的影響較小，對(duì)瘤胃上皮微生物區(qū)系的影響較大。

圖3 哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)RDA圖

灌服丁酸對(duì)哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物菌屬的影響見表4，有4個(gè)屬水平微生物在對(duì)照組和試驗(yàn)組之間存在差異或差異的趨勢。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的梭菌目(Unclassified Clostridiales)和丹毒絲菌科(Unclassified Erysipelotrichaceae)的豐度均顯著下降(P<0.05)，擬桿菌屬豐度有下降的趨勢(P=0.083)，BS11腸道菌族(Unclassified BS11 gut group)的豐度顯著升高(P<0.05)?？傮w上看，灌服丁酸影響哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物菌屬的種類較少，含量也較低。

表4 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物菌屬相對(duì)豐度的影響

灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃上皮微生物菌屬的影響見表5，有11個(gè)屬水平微生物在對(duì)照組和試驗(yàn)組之間存在差異或差異的趨勢。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的擬桿菌目(Unclassified Bacteroidales)、密螺旋體(Treponema)的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)；彎曲桿菌屬、普雷沃氏菌科(Unclassified Prevotellaceae)、擬桿菌屬、γ-變形桿綱(Unclassified Gammaproteobacteria)、梭菌目和月形單胞菌屬(Selenomonas)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，厚壁菌門(P=0.064)和SR1菌簇(P=0.077)有被影響的趨勢。總體上看，灌服丁酸鈉對(duì)影響哺乳羔羊瘤胃上皮微生物菌屬的種類較多，含量相對(duì)較高。

表5 灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃上皮微生物菌屬相對(duì)豐度的影響

3 討論

哺乳羔羊的瘤胃微生物區(qū)系尚未完全建立，瘤胃微生物菌群發(fā)育受諸多因素影響，如遺傳、日糧、年齡及外界環(huán)境等。本研究發(fā)現(xiàn)灌服丁酸鈉對(duì)哺乳羔羊瘤胃主要的VFA參數(shù)影響較小，對(duì)瘤胃內(nèi)容物微生物區(qū)系的組成和結(jié)構(gòu)影響較小，但對(duì)瘤胃上皮微生物區(qū)系的影響較大。

哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮門水平的微生物最主要是擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。擬桿菌門的菌群可參與多種可溶性糖的降解，包括淀粉、果膠、寡糖、木聚糖等，還可作用于類固醇和膽汁酸，有助于機(jī)體對(duì)多糖的吸收以及蛋白質(zhì)的合成[9]。厚壁菌門的菌群具有纖維素和半纖維素降解酶，其主要是對(duì)碳水化合物和蛋白質(zhì)進(jìn)行水解[10]。擬桿菌門和厚壁菌門常共生于反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌區(qū)系中，在瘤胃發(fā)酵過程中扮演著重要角色，二者具有促進(jìn)植物類纖維類多糖的發(fā)酵，碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控吸收，瘤胃微生物平衡，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及宿主自身健康的作用[7]。

普雷沃氏菌、琥珀酸弧菌和丁酸弧菌是哺乳羔羊瘤胃內(nèi)容物和瘤胃上皮主要的微生物菌屬。普雷沃氏菌屬是瘤胃中數(shù)量最多的蛋白質(zhì)降解菌，能高效水解蛋白質(zhì)，在瘤胃中主要參與蛋白質(zhì)降解及肽的吸收和發(fā)酵過程[11]。同時(shí)，普雷沃氏菌擁有高活性的半纖維分解菌，在淀粉、非纖維多糖和單糖的利用中也起到了重要作用，并產(chǎn)生乙酸、琥珀酸及少量的異丁酸、異戊酸和乳酸[12]。琥珀酸弧菌可發(fā)酵多種糖，如麥芽糖和葡萄糖，在淀粉降解的最后一步有著重要作用，主要代謝終產(chǎn)物是乙酸、琥珀酸及少量的甲酸和乳酸[13]。丁酸弧菌是瘤胃中主要的產(chǎn)丁酸菌，也是主要的半纖維素降解菌，能調(diào)節(jié)半纖維素降解酶的分泌[14]。擬桿菌目是一種淀粉和纖維降解菌，可生成乙酸、丙酸，對(duì)瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)代謝具有重要意義[15]。

灌服丁酸鈉影響了瘤胃上皮微生物菌屬的結(jié)構(gòu)和組成，表現(xiàn)為擬桿菌目和密螺旋體的含量升高，彎曲桿菌、毛螺桿菌科、普雷沃氏菌科、擬桿菌屬、梭菌目、γ-變形桿綱和月形單胞菌屬的含量下降。擬桿菌目可參與多種可溶性糖的降解，包括淀粉、果膠、寡糖、木聚糖等，有助于機(jī)體對(duì)多糖的吸收以及蛋白質(zhì)的合成[13]，并可促進(jìn)植物類纖維類多糖的發(fā)酵，以及調(diào)控碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。密螺旋體是一種纖維素分解菌，對(duì)瘤胃內(nèi)纖維物質(zhì)的降解具有重要的意義[16]。這2種菌屬相對(duì)豐度的提高表明口腔灌服丁酸鈉可誘導(dǎo)纖維講解菌的增加，使羔羊有更強(qiáng)的纖維消化能力，更容易適應(yīng)斷奶后的高粗料日糧。彎曲桿菌屬是一種革蘭陰性、微需氧、氧化酶陽性和非發(fā)酵細(xì)菌，是最常見的胃腸道細(xì)菌病原，在牛、羔羊、綿羊和山羊的胃腸道定植[17]，某些種類的彎曲桿菌屬可從腹瀉犢牛中分離出來，但不能從臨床健康的動(dòng)物中分離出來，揭示彎曲桿菌屬可能與犢牛腹瀉有關(guān)[18]。普雷沃氏菌科可降解淀粉、非纖維多糖和單糖，并產(chǎn)生乙酸、琥珀酸及少量的異丁酸、異戊酸和乳酸[19]。許多重要的條件性病原菌屬于γ-變形桿綱，重要的模式生物如大腸桿菌也屬于此綱[20]。梭菌目是一種纖維消化菌，可參與瘤胃內(nèi)淀粉的降解[21]。月形單胞菌屬存在于許多反芻動(dòng)物的瘤胃中，可參與糖類降解，發(fā)酵葡萄糖生成乙酸和丙酸[22]。這些瘤胃上皮微生物菌屬細(xì)菌豐度的變化，表明丁酸鈉的添加有利于羔羊瘤胃的健康發(fā)育，同時(shí)降低了一部分糖類降解菌的相對(duì)豐度。

丁酸是瘤胃上皮細(xì)胞的重要能量來源，主要是被瘤胃上皮細(xì)胞代謝生成酮體[23]，是瘤胃上皮生長和功能的重要促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑[24]。研究表明，口腔灌服丁酸鈉可促進(jìn)哺乳羔羊瘤胃乳頭的生長與瘤胃上皮細(xì)胞增殖的加速和細(xì)胞凋亡的抑制，并增強(qiáng)瘤胃上皮VFA吸收和代謝相關(guān)基因的表達(dá)[25]。反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，丁酸對(duì)瘤胃上皮具有促生長作用，瘤胃上皮對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝又反作用于瘤胃，從而間接改變了瘤胃上皮微生物菌群結(jié)構(gòu)與組成，但對(duì)瘤胃內(nèi)容物微生物區(qū)系的影響較小，對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵模式的影響也較小。

本研究結(jié)果顯示，哺乳羔羊早期灌服丁酸，主要改變了瘤胃上皮微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)，對(duì)瘤胃內(nèi)容物微生物區(qū)系及其發(fā)酵模式影響較小。這表明，灌服丁酸不會(huì)對(duì)哺乳羔羊瘤胃微生物的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，但通過影響瘤胃上皮微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高微生物區(qū)系的穩(wěn)定性，促進(jìn)瘤胃功能的建立和健全，為成年動(dòng)物的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。