石一凡，李曉彤，劉俊澤，李春梅，李延森

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心，江蘇 南京 210095)

在生豬養(yǎng)殖業(yè)中，公豬發(fā)揮重要作用。為了提高優(yōu)質(zhì)公豬資源的利用率，降低飼養(yǎng)成本，同時降低動物之間疾病的傳播風(fēng)險，人工授精被廣泛用于養(yǎng)豬業(yè)。液體形式儲存的公豬精液在豬的人工授精中較為普遍，但精子對溫度變化比較敏感，多于15～17 ℃條件下保存運輸，在稀釋液中可維持精子生育能力3～7 d[1-2]，當(dāng)溫度升高時精子活力明顯降低。

精液保存中最大的問題是在保存過程中對精子結(jié)構(gòu)的損害，導(dǎo)致精子的生育能力差[3]。精子在保存過程中生育能力降低的機制尚不完全清楚。然而，最近人們對活性氧(reactive oxygen species，ROS)在保存過程中對精子功能和受精能力的作用越來越感興趣。適宜水平的ROS對于正常受精、獲能、運動和頂體反應(yīng)是必不可少的[4]。據(jù)報道，在精液保存和人工授精的各種過程中，由于過度或不適當(dāng)形成的ROS造成氧化損傷，精子活力和生育能力降低[5]。精子分化程度高，無DNA修復(fù)機制，細胞膜含較高水平的多不飽和脂肪酸，且本身細胞質(zhì)抗氧化酶少，更易受氧化應(yīng)激損傷[6]。精子功能障礙和ROS的過量產(chǎn)生之間存在關(guān)聯(lián)，高溫引起損傷的機制之一是氧化應(yīng)激。精子質(zhì)膜過氧化損傷被認為是雄性不育的重要病理機制[7-8]。已知脂質(zhì)過氧化物可引起精子細胞的各種損傷，如膜損傷和運動性降低[9]。許多研究表明，膜脂質(zhì)過氧化是保存在4 ℃的液體精液[10]和冷凍保存的精液[11]中精子功能缺陷的原因之一。此外，熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會促進過早獲能，并增加獲能和頂體反應(yīng)精子的比例[12]。這種過早獲能的狀態(tài)會降低精子的壽命、受精和胚胎發(fā)育速度。精子細胞可能攜帶誘導(dǎo)卵母細胞損傷的代謝物，如脂質(zhì)過氧化和抗氧化劑的減少，損害胚胎發(fā)育[13]。因此，隨著保存時間和溫度的增加，精子產(chǎn)生過多的ROS可能會對精子造成損傷，進而對精子質(zhì)量產(chǎn)生影響，影響母豬受孕率及產(chǎn)仔數(shù)[14]。

維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A進入動物體內(nèi)后的活性代謝物，有調(diào)節(jié)細胞氧化還原平衡的能力。研究表明，人類精子上有維甲酸受體α(retinoic acid receptor α，RARα)蛋白表達，且在精索靜脈曲張患者精子中表達降低，這暗示RA與精子活力有一定關(guān)系[15]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，RA能改善高溫對小鼠附睪精子活力產(chǎn)生的影響，提高小鼠睪丸抗氧化能力[16]。用濃度為100 nmol·L-1RA處理人精子，可使其存活率顯著升高，精子丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量降低，重新調(diào)整精子能量代謝水平，提示給予RA補充可能是治療男性不育的一種有前途的治療方法[17]?；谝陨涎芯浚疚氖紫却_立體外熱損傷模型參數(shù)，其次篩選適宜RA處理劑量，并確定豬精子中是否表達RARα，探究體外高溫處理對豬精子的影響以及RA的保護作用，以期為延長公豬精液體外保存期限提供策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成年大約克夏種公豬精液(活力>70%)，購自江蘇省南通市如東縣日昇畜牧養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。

1.2 試驗試劑

EBSS購自上海源培生物科技股份有限公司；RA、Triton X-100購自上海源葉生物科技有限公司；DMSO購自北京蘭杰柯科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、PBS、RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；總膽固醇、甘油三酯、丙酮酸、MDA、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；RARα抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；Alexa flour 488、DAPI染液購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 建立高溫體外豬精子損傷模型

將相同來源的精液隨機分為5組：0、1、2、3和4 h組，每組3個重復(fù)，為了消除精液稀釋液中其他物質(zhì)對試驗的影響，將精液1 000g離心15 min，棄去上清，加入EBSS培養(yǎng)基重懸，分別于39 ℃中孵育0、1、2、3和4 h后，利用計算機輔助精子分析方法(computer-aided sperm analysis，CASA)測定不同組別精子活力，選出適合的孵育時間用于后續(xù)試驗。

1.3.2 篩選RA適宜添加濃度

將相同來源的精液隨機分為6組，用不含RA(CON組)和含不同濃度RA(10、50、100和1 000 nmol·L-1組)的EBSS重懸(RA用DMSO溶解)，DMSO組用含相應(yīng)劑量DMSO的EBSS重懸，每組設(shè)置3個重復(fù)，39 ℃下孵育3 h，測定精子活力，篩選出RA的最適添加濃度用于后續(xù)試驗。

1.3.3 RA對體外高溫條件下豬精子活力的影響

將相同來源的精液隨機分為4組，分別為：37 ℃、37 ℃+RA、39 ℃、39 ℃+RA，每組設(shè)3個重復(fù)，精液1 000g離心后加入EBSS重懸，根據(jù)1.3.2中得出的RA濃度，37 ℃+RA組和39 ℃+RA組培養(yǎng)基中RA終濃度為100 nmol·L-1，37 ℃組和39 ℃組培養(yǎng)基中不含RA；37 ℃組和37 ℃+RA組于37 ℃下孵育3 h，39 ℃組和39 ℃+RA組于39 ℃下孵育3 h，測定精子活力。

1.4 樣品采集

將1.3.3中樣品處理完成后，精液1 000g離心15 min，精子用PBS洗滌2遍后儲存于200 μL離心管中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標和方法

1.5.1 精子活力測定

將載玻片和蓋玻片置于37 ℃載物臺上預(yù)熱，用移液槍將樣品輕輕吹打混勻，吸取10 μL于預(yù)熱的載玻片上，加蓋蓋玻片，立即在400倍顯微鏡下觀察精子，每個樣品至少選取5個視野，利用CASA檢測精子活力。精子活力根據(jù)其運動特征劃分為：總活力、前進運動精子比例、快速運動精子比例、慢速運動精子比例、原地運動精子比例和不運動精子比例。

1.5.2 精子代謝指標測定

向精子樣品中加入RIPA裂解液，充分裂解后，10 000g離心5 min，收集上清液，按照試劑盒說明書中步驟測定相關(guān)指標。采用比色法測定精子中丙酮酸含量：丙酮酸能與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)物在堿性溶液中顯紅棕色，顏色深淺與丙酮酸含量成正比。采用葡萄氧化酶法測定精子中葡萄糖含量。采用COD-PAP法測定精子中總膽固醇含量：反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與膽固醇的含量成正比。采用CPO-PAP法測定精子中甘油三酯含量：反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與甘油三酯的含量成正比。

1.5.3 精子抗氧化性能測定

向精子樣品中加入RIPA裂解液，充分裂解后，10 000g離心5 min，收集上清液，使用TBA法測定精子MDA含量，分別采用羥胺法、鉬酸銨法、比色法和FRAP法測定精子T-SOD、CAT、GSH-PX和T-AOC。步驟嚴格按照說明書進行。

1.5.4 精子RARα的定位

將精液樣本1 000g離心15 min，PBS洗滌2遍，使用2% PFA/PBS將精子固定30 min，取20 μL精液涂片，在超凈臺自然風(fēng)干。加100 μL含0.5% Triton X-100的PBS通透10 min，PBS洗滌3次，置于搖床上，每次5 min。用免疫組化筆在精子周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加200 μL含10% BSA的PBS室溫封閉30 min。甩去封閉液，然后滴加RARα抗體(1∶200稀釋)作為一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，然后滴加Alexa flour 488(1∶200稀釋)作為二抗37 ℃孵育15 min。不滴加一抗的精子細胞作為陰性對照。PBS洗滌3次后，加DAPI染液避光孵育10 min。PBS洗滌3次后，滴加3滴抗淬滅劑，加蓋蓋玻片，立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2010進行整理，用SPSS 25.0分別對處理時間篩選試驗結(jié)果和濃度篩選試驗結(jié)果進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法進行多重比較。對RA和溫度兩因子水平試驗數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析，Duncan法進行多重比較，試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 高溫條件下不同處理時間對體外豬精子活力的影響

在39 ℃條件下孵育不同時間對精子活力的影響如圖1所示。與處理前相比，39 ℃處理2、3和4 h后精子總活力均顯著降低(P<0.05)；39 ℃處理4 h后前進運動精子比例和快速運動精子比例顯著降低(P<0.05)；39 ℃處理2 h和3 h后慢速運動精子比例顯著增加(P<0.05)；39 ℃處理2 h和3 h后原地運動精子比例顯著升高(P<0.05)；39 ℃處理2、3和4 h后不運動精子比例顯著升高(P<0.05)。隨著孵育時間的增加，精子的運動性能逐漸變差。因此，本試驗選擇39 ℃孵育3 h進行后續(xù)試驗。

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 高溫條件下不同濃度RA對體外豬精子活力的影響

不同濃度RA對高溫條件下豬精子活力的影響如圖2所示。培養(yǎng)基中添加DMSO不會對精子活力產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，培養(yǎng)基中含50 nmol·L-1和100 nmol·L-1RA能顯著提高精子總活力(P<0.05)，顯著降低不運動精子比例(P<0.05)，含10 nmol·L-1和100 nmol·L-1RA能顯著提高前進運動精子比例，且濃度為100 nmol·L-1作用效果最好。更高的劑量1 000 nmol·L-1RA未對精子運動性能產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。因此，選用100 nmol·L-1濃度RA繼續(xù)進行試驗。

2.3 RA對體外高溫條件下豬精子運動能力的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對體外高溫條件下豬精子運動能力的影響如圖3所示。由圖3可知，與37 ℃相比，39 ℃培養(yǎng)3 h會顯著降低精子總活力及前進運動精子比例(P<0.05)，顯著提高不運動精子比例(P<0.05)，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著降低原地運動精子比例(P<0.05)。與39 ℃相比，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著提高精子總活力、前進運動精子比例以及快速運動精子比例(P<0.05)，顯著降低不運動精子比例(P<0.05)。說明高溫能顯著降低體外培養(yǎng)精子運動能力，100 nmol·L-1RA能使熱處理精子運動能力得到顯著改善。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA；*表示差異顯著(P<0.05)；孵育時間為3 h。

2.4 RA對體外高溫條件下豬精子抗氧化性能的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對高溫條件下體外豬精子抗氧化能力的影響如圖4所示。由圖可知，與37 ℃相比，39 ℃培養(yǎng)能顯著增加精子MDA水平(P<0.05)，降低精子T-SOD活力(P<0.05)；與39 ℃相比，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著降低精子MDA水平(P<0.05)，提高精子T-SOD活力(P<0.05)。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA；*表示差異顯著(P<0.05)；孵育時間為3 h。

2.5 RA對體外高溫條件下豬精子脂質(zhì)和葡萄糖代謝的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對體外高溫條件下公豬精子代謝的影響如圖5所示。由圖可知，熱處理和RA處理對精子丙酮酸、葡萄糖、總膽固醇及甘油三酯含量無顯著影響。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA。

2.6 豬精子RARα的定位及其與RA關(guān)系

豬精子RARα的免疫熒光定位結(jié)果如圖6所示。豬精子RARα蛋白表達主要集中在精子尾部的主段和末段，頭部和富含線粒體的中段有較弱表達，但不明顯。如圖可見，培養(yǎng)基中添加100 nmol·L-1RA未發(fā)現(xiàn)與未添加RA組精子RARα表達位置的明顯變化。

3 討論

當(dāng)環(huán)境溫度超過其熱中性區(qū)的上限時，豬就會發(fā)生熱應(yīng)激。熱應(yīng)激會影響所有類型的睪丸細胞，其中精子發(fā)生過程較易受到熱應(yīng)激的影響[18]。精子形成后對環(huán)境變化同樣敏感，睪丸溫度升高對精子活力、形態(tài)和受精能力都會產(chǎn)生有害影響。當(dāng)睪丸受熱的雄性精子被用來繁殖胚胎時，胚胎死亡率增加，發(fā)育通常會受阻。使用暴露在高溫下的雄性精子進行體外受精時，精子穿透率、受精率和原核形成率都會下降，早期胚胎發(fā)育異常也會增加[18]。從陰囊隔離的公牛身上采集的精子進行體外受精后，胚胎發(fā)育率降低，這是因為形態(tài)異常的精子比例很高[19]。精子細胞離開睪丸后，也很容易受到環(huán)境變化的影響。研究表明，精子細胞在受精前暴露于熱應(yīng)激雌性生殖道中的高溫環(huán)境條件，對精子功能的影響可以在一年中的溫暖月份持續(xù)存在[20-21]。精子運動性能與公豬繁殖性能顯著相關(guān)，運動性能的降低也意味著繁殖性能變差[22]。

本試驗為探究RA對高溫下體外豬精子活力的影響，根據(jù)實驗室前期研究，試驗選擇首先將精子置于39 ℃培養(yǎng)箱中孵育不同時間，測定精子運動性能，發(fā)現(xiàn)在39 ℃條件下，隨著孵育時間的延長，精子活力隨之降低，不運動精子比例隨之升高，孵育4 h時活力下降最多，最終選擇3 h孵育時間。然后為篩選RA適宜添加濃度，在39 ℃條件下添加不同濃度RA孵育3 h，測定精子活力。我們選擇了Perrotta等[15]和Malivindi等[17]試驗中對人精子的處理劑量：10、50和100 nmol·L-1，并在此基礎(chǔ)上增加了濃度1 000 nmol·L-1，以明確高劑量RA是否對精子有毒害作用。結(jié)果顯示在10 ～ 100 nmol·L-1之間隨著RA添加劑量的升高，精子活力逐漸改善，且100 nmol·L-1添加劑量效果最好。之前未有試驗探究100 nmol·L-1以上RA對精子活力的影響，在本試驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度增加到1 000 nmol·L-1時RA對精子活力的改善作用消失，但并無有害影響，說明在100 ～ 1 000 nmol·L-1之間可能存在更加適宜的濃度。本文研究結(jié)果表明，100 nmol·L-1RA能顯著提高體外高溫條件下的精子總活力、前進運動精子比例以及快速運動精子比例，顯著降低不運動精子比例，表明精液稀釋液中添加適宜劑量的RA可通過改變精子運動狀態(tài)，來提高精液品質(zhì)，而RA具體添加量還需進一步試驗確定。

評估脂質(zhì)過氧化對精子影響的一個簡單指標是精子和精漿MDA的測定，MDA是一種穩(wěn)定的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[23]。而評估精子抗氧化性能的指標一般有T-SOD、CAT和T-AOC等。SOD是一種高度特異性的超氧陰離子自由基清除酶，催化超氧化物歧化為氧和過氧化氫，其活性的變化可能導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生不平衡。本試驗結(jié)果表明，39 ℃熱處理后精子MDA水平顯著升高，T-SOD活力顯著降低。RA處理后能顯著降低熱處理精子的MDA水平，顯著提高精子T-SOD活力。Malivindi等[17]研究也表明，RA能降低精子的MDA水平，提高精子SOD和GST活力。

精子細胞可以獨立調(diào)節(jié)自身的代謝[24]，根據(jù)其能量需求自主調(diào)節(jié)能量底物的利用[25]。在體細胞中已觀察到RA在脂質(zhì)代謝中的作用，能調(diào)節(jié)成年動物的能量平衡和肥胖[26]。已有研究表明，RA能重新調(diào)整精子的代謝，以提高精子的存活率和獲能能力[17]。誘導(dǎo)獲能的物質(zhì)具有降低甘油三酯含量的作用，同時伴隨著與能量消耗有關(guān)的一些酶活性的增加[27]。獲能的精子表現(xiàn)出更高的代謝率和總體能量消耗。因此，可以概括地說，在獲能過程中，能量需求增加，總體能量消耗，與分解代謝有關(guān)。從這個角度出發(fā)，我們研究了RA對高溫引起的精子運動能力改變的保護作用是否會涉及葡萄糖和脂質(zhì)代謝的具體變化。膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要組成部分，它在促進膜穩(wěn)定性的同時保證了膜的流動性，在確保精子的正常代謝方面起了重要作用。有氧糖酵解是許多哺乳動物精子運動和獲能的主要ATP來源[28]。糖酵解底物對于運動[29]、與獲能相關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸化和過度激活[30]以及受精[31]都是必不可少的。乳酸脫氫酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時伴隨NADH氧化為NAD+，這是糖酵解持續(xù)產(chǎn)生ATP所必須的。因此，丙酮酸含量也反應(yīng)了糖代謝水平[32]。本試驗結(jié)果表明，39 ℃熱處理及RA處理對精子中丙酮酸、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇無顯著影響?？赡苁翘幚頃r間還未引起代謝發(fā)生顯著變化。

RA是精子發(fā)育和成熟所必需的維生素A的主要生物活性形式[33]。RA的生物學(xué)效應(yīng)是通過特定的核受體RAR介導(dǎo)的，RARα是一個具有轉(zhuǎn)錄因子作用的核受體，它與視黃酸X受體形成異二聚體后，可以與許多基因啟動子中的RA反應(yīng)元件結(jié)合，控制基因表達，現(xiàn)已證明其可在支持細胞和生殖細胞中表達[34-35]。RA通過其受體在雄性生殖過程中發(fā)揮著重要作用。通過小鼠遺傳學(xué)研究證明了RARα在睪丸和附睪中起關(guān)鍵作用，在這些研究中，RARα基因的破壞導(dǎo)致了許多精子發(fā)生和不育的缺陷[36-37]。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)不同活力的人精子中RARα的蛋白表達水平不同，利用RA處理精子，可提高精子存活率和抗氧化力[15，17]。在本試驗中，通過免疫熒光測定發(fā)現(xiàn)，RARα蛋白主要在豬精子的頸部和尾部主段表達，這為通過精液稀釋液中添加RA提高精子活力提供理論支持。但本試驗發(fā)現(xiàn)添加RA未明顯改變精子富含線粒體部位的RARα蛋白的表達，說明RA并不是通過改變RARα蛋白的表達發(fā)揮作用，具體作用機制還需進一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述，39 ℃熱處理會降低精子總活力、前進運動精子比例和快速運動精子比例，提高慢速運動和不運動精子比例，且隨著處理時間的增長影響增加。當(dāng)培養(yǎng)液中添加RA時，熱處理精子的丙酮酸、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量無顯著改變，但精子MDA含量顯著降低，T-SOD活性顯著提高，精子運動能力顯著改善，表明RA能維持高溫條件下精子抗氧化能力和精子活力。本試驗中添加100 nmol·L-1RA效果最好，為RA作為精液稀釋液中提高精子活力、保護精子免受氧化應(yīng)激損傷的有效成分提供理論依據(jù)。