王 婷 陳景龍 靳杰豪 明建華 邵仙萍 楊 霞 葉金云 吳成龍

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖州 313000)

在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中,普遍采用提高飼料脂肪水平以節(jié)約蛋白質(zhì)的策略,以達(dá)到節(jié)約生產(chǎn)成本、減少氮排放和保護(hù)養(yǎng)殖水體環(huán)境的目的[1-2]。然而,魚類對(duì)脂肪的需求和利用能力受其生理?xiàng)l件的限制,飼料中脂肪含量過高往往會(huì)導(dǎo)致魚體脂肪蓄積,引起魚類脂代謝障礙與紊亂,導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝,造成氧化應(yīng)激損傷,抗病力下降,甚至?xí)鸨┌l(fā)性死亡,這嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3-5]。因此,通過綠色飼料添加劑來調(diào)控魚體的脂代謝,以降低其脂肪沉積,增強(qiáng)魚體抗氧化應(yīng)激能力已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

槲皮素(分子式C15H10O7)是一種廣泛存在于各種果蔬和中草藥中的黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及抑制脂質(zhì)過氧化等多種生理功能[6-7]。近年來,槲皮素作為一種新型的飼料添加劑在陸生動(dòng)物中的研究較多。據(jù)報(bào)道,飼糧中添加適量槲皮素可改善海南褐蛋雞產(chǎn)蛋中后期的蛋品質(zhì)[8],促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的利用[9],調(diào)控?cái)嗄套胸i糞便微生物組成進(jìn)而促進(jìn)腸道健康,提高其生長(zhǎng)性能[10]。目前,槲皮素在水產(chǎn)動(dòng)物上僅有較少的研究報(bào)道,如飼料中添加適量槲皮素可促進(jìn)團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[11]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[7]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]的生長(zhǎng),改善斑馬魚(Daniorerio)的焦慮行為和降低其細(xì)胞凋亡[13],增強(qiáng)克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)的抗氧化能力和免疫力[14],可抑制土霉素誘導(dǎo)克林雷氏鲇(Rhamdiaquelen)血漿皮質(zhì)醇水平升高而引起的應(yīng)激反應(yīng)[15]。然而,槲皮素在高脂養(yǎng)殖魚類上的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。

青魚(Mylopharyngodonpiceus)是我國(guó)主養(yǎng)的淡水肉食性魚類,其營(yíng)養(yǎng)豐富,經(jīng)濟(jì)效益好,2022年我國(guó)青魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量高達(dá)71.55萬(wàn)t[16]。然而,在集約化的養(yǎng)殖生產(chǎn)中,人工養(yǎng)殖的青魚脂肪過度沉積而導(dǎo)致脂代謝紊亂,造成營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝。這類魚抗病、抗應(yīng)激能力下降,死亡率升高,生長(zhǎng)受阻。因此,本研究以青魚為研究對(duì)象,在高脂飼料中添加不同劑量的槲皮素,研究其對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、脂代謝和腸道菌群的影響,為槲皮素在青魚高脂飼料中的合理應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料制備

槲皮素購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)),純度≥95%。

以進(jìn)口魚粉、酪蛋白和豆粕為蛋白質(zhì)源,玉米淀粉和面粉為糖源,魚油和大豆油為脂肪源配制等氮不等能的飼料。試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)對(duì)照組,即正常脂肪組(NFD組,粗脂肪5%)和高脂組(HFD組,粗脂肪15%),以及參考Xu等[7]和Dong等[17]的研究和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果在高脂組飼料中分別添加300(HFDQ1組)、600(HFDQ2組)、900(HFDQ3組)和1 200 mg/kg(HFDQ4組)的槲皮素組成4個(gè)槲皮素添加組(HFDQ組),共配制6種飼料,飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。將各種固體原料粉碎后過60目篩,通過逐級(jí)擴(kuò)大法添加微量成分,然后加入魚油和大豆油混勻,再用飼料造粒機(jī)制成粒徑2 mm的顆粒飼料,置于烘箱中40 ℃烘干,用自封袋封裝標(biāo)注后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsNFDHFDHFDQ1HFDQ2HFDQ3HFDQ4氯化膽堿 Choline chloride0.500.500.500.500.500.50維生素預(yù)混料 Vitamin premix1)0.100.100.100.100.100.10礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)0.300.300.300.300.300.30纖維素 Cellulose9.051.051.020.990.960.93羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethylcellulose2.002.002.002.002.002.002,6-二叔丁基羥基甲苯 BHT0.050.050.050.050.050.05槲皮素 Quercetin0.030.060.090.12合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)干物質(zhì) DM94.9395.1595.2495.2995.2095.46粗蛋白質(zhì) CP36.6936.7436.8136.7136.7336.76粗脂肪 EE4.9814.0814.3114.2014.2414.58粗灰分 Ash7.217.267.287.267.287.28

1.2 試驗(yàn)魚和飼養(yǎng)管理

青魚幼魚購(gòu)于湖州南潯菱湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。正式試驗(yàn)前,青魚在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中以NFD組飼料投喂馴養(yǎng)1周,然后選擇健康的青魚幼魚540尾,初體質(zhì)量為(10.57±0.41) g,隨機(jī)分為6組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾魚,分別放養(yǎng)于室內(nèi)18個(gè)養(yǎng)殖桶(重復(fù))中。6組試驗(yàn)青魚分別投喂上述6種飼料,每天飽食投喂2次(08:00、16:30),且每次投飼45 min后收集殘餌并烘干稱重,攝食飼料總量為投飼量減去烘干殘餌量。每天吸污換水1次,換水量為原來的1/4～1/3,用氣泵持續(xù)充氣增氧,溶氧量≥6 mg/L,水溫(27.0±1.5) ℃,pH 7.5～8.0。試驗(yàn)期8周。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,將各桶青魚稱重計(jì)數(shù)。從每桶中隨機(jī)取3尾青魚,用100 mmol/L MS-222快速麻醉后,從尾靜脈用一次性醫(yī)用注射器采血。血樣在4 ℃冰箱中靜置8 h后,在4 ℃下以3 500 r/min離心15 min制備血清,于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。魚體采血后立即剖開腹腔,剝離出內(nèi)臟和肝臟并稱重,取適量肝臟用于生化指標(biāo)分析,并在無(wú)菌條件下取適量的腸道內(nèi)容物,用于腸道菌群分析;同時(shí),另取適量肝臟和腸道用于制作組織切片。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定

增重率(WGR,%)=100×(魚體末均重-
魚體初均重)/魚體初均重;
特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=100×(ln魚體末均重-
ln魚體初均重)/飼喂天數(shù);
飼料系數(shù)(FCR)=攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)/
(魚體末重-魚體初重);
成活率(SR,%)=100×末魚尾數(shù)/初魚尾數(shù);
肝體指數(shù)(HSI,%)=100×每尾魚末肝臟重/
每尾魚末體重;
臟體指數(shù)(VSI,%)=100×每尾魚末內(nèi)臟重/
每尾魚末體重;
肥滿度(CF,g/cm3)=100×每尾魚末體重/
每尾魚末體長(zhǎng)3。

1.4.2 血清和肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(NEFA)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

肝臟樣品與生理鹽水按1∶9(質(zhì)量體積比)的比例進(jìn)行冰浴電動(dòng)勻漿,然后在4 ℃下以3 500 r/min離心15 min制備上清液用于分析。測(cè)定肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)活性和總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量。

以上指標(biāo)測(cè)定均按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。

1.4.3 肝臟和腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

肝臟和腸道于4%的中性甲醛中固定48 h后,送至杭州浩克生物技術(shù)有限公司進(jìn)行脫水、透明、浸蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,然后進(jìn)行顯微觀察并拍照。使用ImageJ軟件測(cè)量各組腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.4.4 腸道菌群分析

利用通用引物F338/R806(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)域序列。PCR產(chǎn)物純化后在上海派森諾生物科技股份有限公司的Illumina PE250平臺(tái)上測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用QIIME 2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析和質(zhì)量篩選而得到優(yōu)化序列,對(duì)有效操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類分析,通過Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估樣本的alpha多樣性。通過QIIME 2在門和屬分類水平對(duì)菌群組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異化分析,并計(jì)算腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),計(jì)算公式為:

穩(wěn)態(tài)指數(shù)=[梭桿菌門(Fusobacteria)+厚壁菌門
(Firmicutes)+擬桿菌門(Bacteroidetes)]/
變形菌門(Proteobacteria)。

同時(shí),利用PICRUSt2預(yù)測(cè)青魚腸道菌群功能。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,NFD組與HFD組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析;HFD組和HFDQ組則采用單因素方差分析(one-way ANOVA),若組間差異顯著,則采用Tukey氏法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,與NFD組相比,HFD組青魚末體重、WGR、SGR和SR顯著降低(P<0.05),HSI、VSI和CF顯著提高(P<0.05),而FCR無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚末體重、WGR、SGR和SR呈先升高后降低的變化趨勢(shì),且均當(dāng)添加量為600 mg/kg時(shí)達(dá)到最高,并顯著高于HFD組(P<0.05);而FCR、HSI和CF呈先降低后升高的變化趨勢(shì),且當(dāng)添加量為600和900 mg/kg時(shí)達(dá)到較低水平,并顯著低于HFD組(P<0.05);當(dāng)槲皮素添加量為1 200 mg/kg時(shí),VSI最低,并顯著低于HFD組(P<0.05)。如圖1所示,利用青魚WGR與槲皮素添加量的折線模型擬合得出,青魚高脂飼料中槲皮素的適宜添加量為597.13 mg/kg。

表2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚生長(zhǎng)性能的影響

圖1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚WGR的影響

2.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知,與NFD組相比,HFD組青魚肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC顯著降低(P<0.05),而肝臟MDA含量顯著提高(P<0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC均呈先升高后降低的變化趨勢(shì),且當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)肝臟SOD和GPx活性最高,當(dāng)添加量為600 mg/kg時(shí)肝臟GR活性和T-AOC最高,當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí)肝臟CAT活性最高,并均顯著高于HFD組(P<0.05);肝臟MDA含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì),當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí),肝臟MDA含量最低,顯著低于其他各組(P<0.05)。

表3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚血清脂代謝指標(biāo)的影響

由表4可知,與NFD組相比,HFD組青魚血清TG、TC、LDL-C和NEFA含量顯著提高(P<0.05),而血清HDL-C含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚血清TG、TC和NEFA含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì),而血清HDL-C含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì),當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí),血清TG、TC和NEFA含量達(dá)到最低,顯著低于HFD組(P<0.05);當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí),血清HDL-C含量最高,顯著高于HFD組(P<0.05)。當(dāng)槲皮素添加量為900和1 200 mg/kg時(shí),血清LDL-C含量較低,顯著低于HFD組(P<0.05)。

表4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚血清脂代謝指標(biāo)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items組別 GroupsNFDHFDHFDQ1HFDQ2HFDQ3HFDQ4低密度脂蛋白膽固醇LDL-C/(mmol/L)1.45±0.24?1.70±0.15a1.56±0.35ab1.52±0.27ab1.29±0.24b1.17±0.18b高密度脂蛋白膽固醇HDL-C/(mmol/L)0.98±0.171.05±0.18b1.59±0.21a1.45±0.22ab1.22±0.19ab1.14±0.16b游離脂肪酸NEFA/(μmol/L)638.22±77.96?807.34±123.42a753.11±117.32ab554.82±118.68c531.34±81.17c617.59±68.24bc

2.4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

如圖2所示,NFD組青魚肝細(xì)胞分布均勻,細(xì)胞核和細(xì)胞膜的界限清晰;而HFD組肝細(xì)胞核溶解或缺失,部分出現(xiàn)空泡化。在高脂飼料中添加槲皮素后,肝細(xì)胞空泡化程度與HFD組相比有所下降,其中HFDQ1組肝細(xì)胞核溶解或缺失現(xiàn)象有所改善,但仍存在空泡化現(xiàn)象;而HFDQ2組、HFDQ3組和HFDQ4組肝細(xì)胞核較清晰,細(xì)胞空泡化現(xiàn)象也明顯改善。

He:肝細(xì)胞 hepatocyte;N:細(xì)胞核 nucleus;HS:肝血竇 hepatic sinusoid;HPV:肝細(xì)胞空泡化 hepatocyte vacuolation;Ka:細(xì)胞核溶解 karyolysis。

如圖3所示,NFD組青魚腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰,絨毛排列緊密有序;而HFD組腸道絨毛高度降低,不夠致密完整。在高脂飼料中添加槲皮素后,腸絨毛高度有所提高,排列也較致密。由表5可知,NFD組青魚絨毛高度和肌層厚度顯著高于HFD組(P<0.05),而2組之間絨毛寬度無(wú)顯著差異(P>0.05);與HFD組相比,HFDQ組絨毛高度均顯著提高(P<0.05),且HFDQ1組絨毛寬度和HFDQ1組、HFDQ2組、HFDQ4組肌層厚度也均顯著提高(P<0.05)。

2.5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群的影響

2.5.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群alpha多樣性的影響

由表6可知,各組樣本的覆蓋率均高于99%,表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)覆蓋了大多數(shù)微生物物種。與NFD組相比,HFD組Chao1指數(shù)較高,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較低,但2組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與HFD組相比,隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈先升高后降低的變化趨勢(shì),但各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

VH:絨毛高度 villus height;VW:絨毛寬度 villus width;MT:肌層厚度 muscular thickness;GC:杯狀細(xì)胞 goblet cell。

表5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表6 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群alpha多樣性的影響

2.5.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群組成和穩(wěn)態(tài)指數(shù)的影響

如圖4所示,在門水平上,青魚腸道菌群主要有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門,其中變形菌門在6個(gè)組中的相對(duì)豐度分別為57.38%、71.43%、51.05%、60.69%、56.62%和69.29%。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(表7和圖5),與HFD組相比,高脂飼料中添加槲皮素提高了厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度以及腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),降低了變形菌門的相對(duì)豐度,但各組之間菌門的相對(duì)豐度和穩(wěn)態(tài)指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群在門水平上相對(duì)豐度的影響

由表7可知,在屬水平上,青魚腸道菌群主要有乳球菌屬(Lactococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和氣單胞菌屬(Aeromonas)。其中,隨著飼料中槲皮素添加量的增加,乳球菌屬和紅桿菌屬的相對(duì)豐度呈先升高后降低的變化趨勢(shì),而不動(dòng)桿菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度則呈先降低后升高的變化趨勢(shì),但各組之間菌屬的相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表7 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群在門和屬水平上相對(duì)豐度的影響

2.5.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群的功能預(yù)測(cè)

基于PICRUSt2對(duì)6組青魚腸道菌群樣品進(jìn)行功能預(yù)測(cè),利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)得到33種二級(jí)功能通路,其中參與代謝的通路最多,占比33.33%。根據(jù)每個(gè)樣品中的通路豐度信息及其功能進(jìn)行聚類分析,繪制成如圖6所示的熱圖。結(jié)果顯示,不同組青魚腸道菌群在功能上存在差異,其中HFDQ1組、HFDQ2組和HFDQ3組青魚腸道中與脂代謝、其他次生代謝物的生物合成、能量代謝以及外源生物降解和代謝等功能有關(guān)的通路豐度高于HFD組,而心血管疾病和免疫性疾病的通路豐度低于HFD組;HFDQ1組和HFDQ2組細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、萜類和聚酮類化合物代謝、氨基酸代謝以及輔助因子和維生素代謝的通路豐度高于HFD組;HFDQ3組內(nèi)分泌系統(tǒng)、復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝、折疊、分類和降解、翻譯、其他氨基酸代謝、聚糖生物合成和代謝、細(xì)胞群落-原核生物以及信號(hào)分子和相互作用的通路豐度高于HFD組。

3 討 論

3.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚生長(zhǎng)性能的影響

研究表明,高脂飼料養(yǎng)殖團(tuán)頭魴30 d可以顯著提高其WGR,而飼喂60 d后其WGR與正常脂肪飼料相比無(wú)顯著差異[18]。另外,也有研究報(bào)道,高脂飼料會(huì)降低大口黑鱸(Micropterussalmoides)[19]、草魚[20]和日本黃姑魚(Nibeajaponica)[21]的生長(zhǎng)性能。本研究中,與NFD組相比,HFD組青魚WGR、SGR和SR均顯著降低,而HSI和VSI顯著提高,說明高脂對(duì)青魚的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響。這可能與魚體攝入的脂肪超出了自身的需求有關(guān),造成其在肝臟和內(nèi)臟中過度積累,導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪含量增加,肝臟脂肪變性,脂代謝紊亂,從而表現(xiàn)出生長(zhǎng)性能下降[22-23]。

數(shù)據(jù)柱無(wú)標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

圖6 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群功能的預(yù)測(cè)

據(jù)報(bào)道,槲皮素對(duì)魚類的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。孫如意等[24]在飼料中添加100 mg/kg槲皮素可以顯著提高黃河鯉(Cyprinuscarpio)的WGR和SGR,并降低FCR。李劍等[25]在飼料中添加200 mg/kg槲皮素可顯著提高吉富羅非魚(GIFTOreochromisniloticus)幼魚WGR、SGR、蛋白質(zhì)效率(PER)和CF,并降低FCR。Jia等[11]報(bào)道,高脂飼料中添加0.8%的槲皮素可以提高團(tuán)頭魴的WGR。Dong等[17]研究也發(fā)現(xiàn),高脂飼料中添加0.5和1.0 g/kg的槲皮素可以顯著提高花鱸(Lateolabraxmaculatus)的WGR和SGR,降低FCR。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料中添加600和900 mg/kg槲皮素可顯著提高青魚WGR、SGR和SR,降低FCR、HSI和VSI,從而促進(jìn)青魚的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果類似,但不同研究者得出的槲皮素添加量不同,這可能與魚的品種和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān),其促進(jìn)生長(zhǎng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

脂肪在魚體中過度沉積會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)自由基,若抗氧化系統(tǒng)未能及時(shí)清除這些自由基,則會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[26-27]。魚類在進(jìn)化過程中形成了抗氧化酶防御系統(tǒng),如SOD可催化超氧陰離子歧化生成氧氣(O2)和過氧化氫(H2O2),H2O2又在CAT和GPx的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水(H2O)和O2,從而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[28];而MDA是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物,可作為衡量氧化應(yīng)激程度的標(biāo)志[29]。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC顯著降低,而肝臟MDA含量顯著提高。這與在花鱸[17]、青魚[30]和黃河鯉[31]上的研究結(jié)果一致,說明高脂飼料會(huì)引起魚體抗氧化能力降低,引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

槲皮素是一種強(qiáng)抗氧化劑,其分子結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)抗氧化基團(tuán),即B環(huán)中的鄰苯二酚基團(tuán)和AC環(huán)3位點(diǎn)上的羥基(—OH)基團(tuán)[32],具有強(qiáng)抗氧化活性,能夠有效清除體內(nèi)自由基,從而減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[33]。研究表明,槲皮素可提高黃河鯉[24]、斑馬魚[34]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[35]和烏鱧(Channaargus)[36]肝臟中的抗氧化酶活性,降低肝臟MDA含量。本試驗(yàn)中,高脂飼料中添加600 mg/kg槲皮素可顯著提高青魚肝臟CAT、GPx和GR活性以及T-AOC,降低肝臟MDA含量,從而增強(qiáng)青魚機(jī)體的抗氧化能力。Dong等[17]在高脂飼料中添加1 g/kg槲皮素也可顯著提高花鱸肝臟CAT和SOD活性、T-AOC以及谷胱甘肽(GSH)含量,降低肝臟MDA含量。本研究與在花鱸[17]上的研究結(jié)果類似,說明槲皮素可以提高青魚抗氧化酶活性,緩解高脂誘導(dǎo)而引起的氧化應(yīng)激,進(jìn)而維持肝臟的氧化還原穩(wěn)態(tài)。

3.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚血清脂代謝指標(biāo)的影響

閆亞楠[38]報(bào)道,高脂飼料中添加0.4%和0.8%的槲皮素可以降低團(tuán)頭魴血清TG和TC含量。劉超[39]也報(bào)道了用分蘗蔥頭槲皮素對(duì)高脂血癥小鼠灌胃50 d后,可降低其血清TG、TC和LDL-C含量,從而降低血脂水平。同樣,槲皮素還可通過降低高脂飼糧飼養(yǎng)小鼠血清和肝臟TG和TC含量,改善小鼠肝臟的脂肪變性[40]。本研究中,高脂飼料中添加900 mg/kg槲皮素可顯著降低青魚血清TG、TC、LDL-C和NEFA含量,表明槲皮素可降低高脂飼料飼養(yǎng)青魚的血脂水平。

3.4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

肝臟組織形態(tài)觀察是了解肝臟病理情況的重要手段之一。本研究中,肝臟組織切片顯示,高脂飼料誘導(dǎo)了青魚肝細(xì)胞損傷,如肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核溶解或消失,這與在鯉魚[41]和草魚[42]上的相關(guān)報(bào)道類似。然而,在青魚高脂飼料中添加600～1 200 mg/kg槲皮素后,可以減輕上述癥狀,表明槲皮素可改善青魚肝細(xì)胞的脂代謝,有利于青魚肝臟健康。這與以前的一些報(bào)道相吻合,如古送汗·買提尼亞孜等[40]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可有效抑制高脂飼糧飼養(yǎng)小鼠肝臟脂滴的聚集;同樣,槲皮素還可明顯改善非酒精性脂肪肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)沉積和纖維化病變,減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[43-44]。

腸道是魚類消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所,腸絨毛在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和提高生長(zhǎng)性能方面發(fā)揮著重要作用[45]。腸道絨毛高度、絨毛寬度和腸壁肌層厚度通常與腸道健康和營(yíng)養(yǎng)吸收效率密切相關(guān)[46]。Liu等[47]報(bào)道,高脂飼料可誘導(dǎo)草魚腸道絨毛發(fā)生結(jié)構(gòu)性紊亂,如絨毛萎縮、粘連或脫落,且高脂顯著降低草魚幼魚腸道絨毛高度和絨毛寬度。Zhao等[48]也研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料飼養(yǎng)斑馬魚的腸道絨毛萎縮,絨毛高度顯著下降。在本研究中,與NFD組相比,HFD組青魚幼魚腸道絨毛高度和肌層厚度顯著降低,而在高脂飼料中添加適量槲皮素可以提高青魚腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度,說明槲皮素可以改善高脂飼料飼養(yǎng)青魚的腸道組織形態(tài),有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。

3.5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道菌群的影響

魚類腸道菌群在維持腸道健康、促進(jìn)腸道發(fā)育、抵御病原侵襲以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和脂代謝等方面均具有重要的作用[49]。Liu等[47]研究表明,高脂飼料飼養(yǎng)草魚腸道菌群Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均有所降低。但也有報(bào)道稱,高脂脅迫未顯著改變大口黑鱸[50]、斑馬魚[48,51]腸道菌群的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和ACE指數(shù),本試驗(yàn)結(jié)果與之類似。羅君等[52]在基礎(chǔ)飼料中添加0.381 g/kg的槲皮素-5′-磺酸鈉可顯著提高雜交石斑魚腸道菌群的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。本研究中,高脂飼料中添加600和900 mg/kg槲皮素可提高青魚腸道菌群的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),這表明在高脂飼料中添加適量槲皮素有利于提高青魚腸道菌群的alpha多樣性。

本研究中,在門水平上,青魚幼魚腸道菌群主要為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門。這與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[53]的腸道菌群組成類似。有研究指出,變形菌門是腸道炎癥的特征微生物[54],擬桿菌門可作為衡量動(dòng)物腸道健康的指標(biāo)[55],而厚壁菌門和放線菌門在促進(jìn)魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收及代謝中起著重要作用[56-57]。腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù)可作為評(píng)價(jià)魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的參數(shù),能有效反映飼料對(duì)菌群組成的總體影響,其值較高表明魚體的健康狀況較佳[58-59]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在門水平上,高脂飼料中添加槲皮素提高了高脂飼料飼養(yǎng)青魚腸道厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度以及腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),而降低了變形菌門的相對(duì)豐度。在屬水平上,主要有益菌為乳球菌屬[60]和紅桿菌屬[61],主要有害或潛在有害菌為不動(dòng)桿菌屬[62]、鄰單胞菌屬[63]和氣單胞菌屬[62]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在屬水平上,有益菌相對(duì)豐度隨槲皮素添加量的增加有升高的變化趨勢(shì),而有害菌相對(duì)豐度呈下降的變化趨勢(shì)。在門和屬水平上的研究結(jié)果表明,槲皮素可以使一些有益菌的相對(duì)豐度提高,而使有害菌的相對(duì)豐度降低。以前也有類似的研究報(bào)道,Porras等[64]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素干預(yù)后顯著降低了高脂飼料飼養(yǎng)小鼠腸道變形菌門的相對(duì)豐度,而提高了擬桿菌門的相對(duì)豐度。以上研究表明,槲皮素可調(diào)節(jié)高脂所誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂,改善腸道菌群的組成。

青魚腸道菌群的功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),在高脂飼料中添加適量的槲皮素,與脂代謝、其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、能量代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝以及聚糖生物合成和代謝等有關(guān)代謝功能的通路豐度有所升高,免疫性疾病、心血管疾病等有關(guān)疾病的通路豐度有所降低,這表明槲皮素可以促進(jìn)腸道菌群參與機(jī)體代謝過程,提高機(jī)體的抗病力。這可能與槲皮素提高了青魚腸道門水平上厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度,降低了變形菌門的相對(duì)豐度有關(guān)。

4 結(jié) 論

高脂飼料飼養(yǎng)青魚導(dǎo)致其生長(zhǎng)性能下降以及氧化應(yīng)激損傷,出現(xiàn)脂代謝和肝臟、腸道組織病理學(xué)異常以及腸道菌群紊亂;而在高脂飼料中添加適量槲皮素(600～900 mg/kg)可促進(jìn)高脂飼料飼養(yǎng)青魚的生長(zhǎng),增強(qiáng)其抗氧化能力,促進(jìn)脂代謝,減少魚體脂肪過度沉積,改善腸道菌群組成。