王毓甜 米金秋 全浩瑋 王慶鳳 李澤昆 李天天 馬秋剛 黃世猛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193;2.國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)因可引起豬產(chǎn)生嘔吐現(xiàn)象,又稱為嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌、梨孢鐮刀菌等多種鐮孢菌屬真菌產(chǎn)生,屬于單端孢霉菌素類毒素,是畜禽飼料生產(chǎn)中最常見的真菌毒素之一,也是當前全球范圍內(nèi)飼料中污染最為嚴重的霉菌毒素之一[1]。畜禽采食DON污染的飼糧或飼料原料后,會出現(xiàn)采食量減少、生長性能降低、嘔吐、腹瀉等癥狀,甚至死亡,給我國畜禽養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),從吉林、湖南、安徽等區(qū)域采集了1 304份飼料原料進行檢測,DON檢出率為93.56%,超標率為51.76%,其中玉米、玉米副產(chǎn)品和小麥及麩皮的檢出率分別高達96.49%、96.59%和100%[5]。侯楠楠等[6]收集我國山東、江蘇、東北等地區(qū)的飼糧和飼料原料,對DON污染情況進行監(jiān)測,結(jié)果顯示DON的污染率達97.22%,超標率為27.42%。最新調(diào)研結(jié)果表明,2021年調(diào)查的我國1 025份飼糧和飼料原料樣品中DON檢出率均達到88%以上[7]。由此可見,我國飼糧和飼料原料的DON檢出率和超標率維持在較高水平。攝入DON污染的飼糧和飼料原料,容易引起畜禽不同程度的中毒情況,其中DON的毒性作用主要表現(xiàn)為細胞毒性、多器官組織病理毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、消化道毒性、肝臟毒性和致畸致癌等[8-11]。肝臟作為DON主要作用的靶器官之一,可以導致肝細胞脂肪變性及肝細胞癌,DON可增加肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性,破壞機體氧化/抗氧化酶系統(tǒng),導致氧化應激,誘導肝臟組織發(fā)生病理損傷[12]。DON對肝臟的影響鮮有系統(tǒng)研究[12],肝臟作為機體主要的合成代謝和分解代謝器官,參與能量代謝、異種生物解毒、營養(yǎng)物質(zhì)代謝和吸收、蛋白質(zhì)合成和膽汁的產(chǎn)生[13]。研究表明,肝臟是DON主要靶器官之一,DON可改變肝臟組織形態(tài),誘導炎癥反應,增加細胞凋亡和氧化應激[14-16]。已有研究證實,添加具有抗炎、抗氧化的功能活性物質(zhì),可以改善機體的氧化還原狀態(tài),進而緩解炎癥和氧化損傷。

褐藻寡糖(alginate oligosaccharides,AOS)也稱褐藻膠低聚糖,包括低聚甘露糖醛酸和低聚古羅糖醛酸,是由褐藻膠經(jīng)過降解得到聚合度為2～25的功能性寡糖[17]。AOS具有非免疫、無毒性、生物可降解的低聚合度特性[17-19],其分子質(zhì)量小、溶解度高,容易被機體吸收和利用,已有大量研究證實了AOS具有多種活性功能,例如抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡、抗菌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)腸道菌群等[20-23]。雖然AOS的各種生物學功能得到廣泛關注,但對于AOS是否具有改善DON誘導小鼠肝臟損傷的研究鮮有報道。因此,本試驗旨在研究AOS對DON誘導小鼠肝臟損傷的緩解效果,旨在為AOS在畜禽生產(chǎn)中的應用提供理論科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

無特異性病原體(SPF)級7周齡雌性C57BL/6J小鼠購自斯貝福(北京)生物科技有限公司。經(jīng)過1周適應后,將32只8周齡小鼠根據(jù)體重隨機分為4個組,即對照組(CON組)、褐藻寡糖組(AOS組)、嘔吐毒素組(DON組)和褐藻寡糖+嘔吐毒素組(AOS+DON組),每組8只小鼠。每籠飼養(yǎng)4只小鼠。本試驗共計28 d,分為DON處理前(前21 d)和處理后(后7 d)2個階段。前21 d,AOS組和AOS+DON組小鼠每天灌胃200 μL(200 mg/kg BW)AOS,CON組和DON組小鼠每天灌胃等體積無菌生理鹽水;后7 d,DON組和AOS+DON組小鼠每天灌胃100 μL(4.8 mg/kg BW)DON,CON和DON組小鼠每天灌胃等體積無菌生理鹽水。小鼠自由飲水和采食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22 ℃,相對濕度為35%～44%,12 h光照12 h黑暗。所有涉及小鼠的試驗過程均遵循中國農(nóng)業(yè)動物護理和使用倫理委員會的指導方針進行。試驗期間每周記錄小鼠體重,觀察小鼠整體健康狀況?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.91粗蛋白質(zhì) CP18.80粗脂肪 EE5.26粗纖維 CF3.06鈣 Ca1.12總磷 TP0.72賴氨酸 Lys1.40蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys1.15

1.2 樣品收集

試驗結(jié)束后,眼球采血法采集小鼠血液,置于無抗凝劑的離心管中,在4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離血清并于-80 ℃保存。隨后脫頸處死小鼠,無機械損傷分離肝臟組織,稱量肝臟重量并記錄,用無菌生理鹽水沖洗后,取一份肝臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定保存,用于制備切片;另一份肝臟組織凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)分析。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 體重和體增重

每周對小鼠稱重并記錄數(shù)據(jù),統(tǒng)計各組小鼠的8、9、10、11、12周齡的體重和8～11周體增重。

1.3.2 肝臟指數(shù)

分離完整肝臟并用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗,用濾紙吸去水分后稱重,計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=[肝臟重量(g)/體重(g)]×100。

1.3.3 肝臟組織蘇木精-伊紅染色和免疫熒光分析

剪取各小鼠肝臟組織,用無菌磷酸鹽緩沖液清洗后,固定在4%多聚甲醛溶液中,對其進行脫水、石蠟包埋樣品切片,通過蘇木精-伊紅染色,在光學顯微鏡下觀察并分析肝臟組織病理學變化。在武漢塞維爾生物科技有限公司完成肝臟組織F4/80免疫熒光分析,觀察肝臟組織巨噬細胞浸潤情況,通過熒光強度平均值反映巨噬細胞含量,并進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 血清和肝臟炎癥細胞因子和氧化/抗氧化指標

使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析試劑盒檢測小鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。取肝臟組織樣品,冰上解凍后,制備小鼠肝臟組織勻漿樣品,取上清測定肝臟炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10)含量;同時,取上清使用比色法測定肝臟丙二醛(MDA)含量和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。以上指標均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

1.3.5 肝臟功能指標

收集小鼠血清樣品,使用全自動血液生化分析系統(tǒng)(AU5400,Beckman Coulter,美國)測定小鼠血清中反映肝臟功能的指標,包括血清AST、AST、乳酸脫氫酶(LDH)活性及甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量,均使用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏多重比較檢驗分析組間差異顯著性,并分析AOS和DON對小鼠的交互作用。結(jié)果用平均值±標準誤表示,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 9.0軟件制作數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOS對DON誘導小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

由表2可知,各組小鼠初始體重(8周齡體重)無顯著差異(P>0.05)。給小鼠灌胃AOS后,與CON組相比,AOS組的10和11周齡體重顯著增加(P<0.05);且AOS組的8～11周齡體增重顯著高于對照組(P<0.05)。DON誘導后,與CON組相比,DON組的12周齡體重顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的12周齡體重顯著增加(P<0.05)。與CON組相比,DON組的肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。12周齡體重、肝臟指數(shù)、11～12周齡體重變化存在AOS與DON的顯著交互作用(P<0.05)。

表2 AOS對DON誘導小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

2.2 AOS對DON誘導小鼠血清和肝臟炎癥細胞因子和氧化/抗氧化指標的影響

如圖1可知,與CON組相比,DON組的血清和肝臟IL-1β、IL-68和TNF-α含量顯著增加(P<0.05),血清IL-8含量顯著增加(P<0.05),提示DON可引起小鼠機體和肝臟組織中促炎細胞因子含量的增加,造成機體出現(xiàn)明顯的炎癥損傷。與DON組相比,AOS+DON組的血清和肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05),血清IL-8含量顯著降低(P<0.05);與CON組相比,DON和AOS+DON組的肝臟IL-10含量顯著降低(P<0.05)。

與CON組相比,DON組的肝臟MDA含量顯著增加(P<0.05),肝臟T-SOD活性顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05),肝臟T-SOD活性顯著增加(P<0.05)。與CON組相比,AOS組的肝臟T-SOD活性顯著增加(P<0.05)。同時,除肝臟IL-10和T-SOD指標外,其余指標均存在AOS與DON的顯著交互作用(PAOS×DON<0.05)。上述結(jié)果提示,AOS通過調(diào)控多種細胞因子分泌和氧化/抗氧化酶活性緩解DON誘導的小鼠機體和肝臟損傷。

2.3 AOS對DON誘導小鼠肝臟組織病理學的影響

如圖2所示,CON組和AOS組小鼠肝臟組織病理學切片中肝細胞結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,未見明顯肝細胞病理損傷、炎癥浸潤或脂質(zhì)沉積;DON組小鼠肝臟組織病理學切片中出現(xiàn)肝細胞點狀壞死,且變形、腫脹,存在明顯炎癥浸潤、脂質(zhì)沉積或細胞瘤樣病變,呈特征性放射纖維狀;AOS+DON組病變程度明顯減輕,肝細胞形態(tài)明顯改善,且脂肪空泡數(shù)量減少。

F4/80免疫熒光染色后,與CON組相比,DON組的肝臟巨噬細胞含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的肝臟巨噬細胞含量顯著減少(P<0.05)。

CON:對照組;AOS:褐藻寡糖組;DON:嘔吐毒素組;AOS+DON:褐藻寡糖+嘔吐毒素組。數(shù)據(jù)柱標相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.4 AOS對DON誘導小鼠血清AST、ALT、LDH活性及TG、TC含量的影響

如圖3所示,與CON組相比,DON組的血清AST、ALT和LDH活性均顯著增加(P<0.05),AOS組的血清AST活性顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的血清AST、ALT和LDH活性均顯著降低(P<0.05)。與CON組相比,DON組的血清TG和TC含量均顯著增加(P<0.05),AOS組的血清TG含量顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AOS+DON組的血清TG和TC含量均顯著降低(P<0.05)。同時,除血清AST和TG指標外,其余指標均存在AOS與DON的顯著交互作用(PAOS×DON<0.05)。上述結(jié)果提示,AOS對DON誘導的小鼠肝臟損傷有顯著緩解效果,尤其在改善小鼠血清中肝臟功能標志性指標方面。

DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole;H&E:蘇木精-伊紅 hematoxylin eosin。

圖3 AOS對DON誘導小鼠血清AST、ALT、LDH活性及TG、TC含量的影響

3 討 論

3.1 AOS對DON誘導小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

研究表明,與對照組相比,小鼠采食DON飼糧后,食糜中DON含量升高,造成小鼠胃腸道損傷,進而降低其平均日增重和平均日采食量[24]。與前人研究結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn)DON可導致小鼠體重降低,阻礙其生長;與CON組相比,灌胃3周的AOS可顯著增加小鼠體重和體增重;與DON組相比,AOS可緩解DON誘導的小鼠體重降低。張麗等[25]研究表明,飼糧中添加20、40或80 mg/kg AOS顯著提升斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量,改善仔豬生長性能。劉萍等[26]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加褐藻糖膠可顯著降低1～14天仔豬料重比,但對試驗全期仔豬平均日增重和平均日采食量無顯著影響。

研究發(fā)現(xiàn),給小鼠灌胃放射性同位素示蹤標記的DON,血漿和組織的吸收峰值在30 min;小鼠口服DON(25 mg/kg BW),5 min后檢測不同組織中DON濃度為:肝臟(19.5±1.9) μg/kg,血漿12.1 μg/mL,腎臟(7.6±0.5) μg/kg,脾臟(7.3±0.8) μg/kg,心臟(6.8±0.9) μg/kg和大腦(0.8±0.1) μg/kg[27]。由此可見,肝臟是機體代謝DON的重要解毒器官之一。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與CON組相比,DON灌胃小鼠可顯著增加肝臟指數(shù),表明DON對肝細胞系和實體肝臟組織具有明顯的毒性作用[13]。然而,AOS可顯著減少DON誘導的小鼠肝臟指數(shù)增加。這可能是因為AOS能下調(diào)促炎細胞因子的表達,上調(diào)抗炎細胞因子的表達和分泌,發(fā)揮抗炎和抗氧化損傷功能,進而緩解組織器官的炎癥損傷[27]。因此,AOS通過調(diào)控小鼠的生長性能和肝臟功能緩解DON誘導的肝臟損傷。

3.2 AOS對DON誘導小鼠血清和肝臟炎癥細胞因子和氧化/抗氧化指標的影響

炎癥細胞因子含量是反映機體炎癥損傷和免疫失調(diào)的重要生物標志物[28]。研究發(fā)現(xiàn),DON暴露上調(diào)機體炎癥反應,并選擇性促進機體促炎細胞因子mRNA表達上調(diào),例如DON誘導的仔豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2)的細胞損傷是通過促進氧自由基的產(chǎn)生,顯著上調(diào)與凋亡、炎癥相關基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達[29],而通過外源補充杜仲黃酮能顯著緩解DON誘導的促炎細胞因子含量的增加[30]。同時,氧化應激是DON誘導的重要毒性機制之一,研究發(fā)現(xiàn),DON可導致小鼠肝臟發(fā)生明顯的氧化應激,增加肝臟組織中MDA含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性,降低過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性[31]。且隨著DON濃度的增強,對動物的毒性作用加強,導致氧化應激現(xiàn)象加劇,并伴隨肝臟組織損傷、免疫失調(diào)等現(xiàn)象[32]。大量研究證明,海藻多糖的水解產(chǎn)物寡糖對小鼠肝臟損傷具有一定保護作用。例如,殼寡糖具有良好的抗氧化活性,能夠增強體內(nèi)抗氧化酶活性,在肝臟損傷中起到保護作用,多種植物或海藻來源的多糖或寡糖能不同程度地降低機體促炎細胞因子的合成和分泌[33]。與前人研究結(jié)果一致,本試驗中DON組的小鼠肝臟MDA含量較CON組顯著增加,而AOS可以抑制MDA含量的升高,并提高肝臟T-SOD活性。因此,AOS能夠通過降低DON導致的炎癥因子分泌,緩解機體炎癥損傷,同時中和DON的氧化應激毒性,促進小鼠體內(nèi)氧化還原代謝平衡。

3.3 AOS對DON誘導小鼠肝臟組織病理學和肝臟功能指標的影響

在本研究中,與健康小鼠相比,DON組肝臟組織出現(xiàn)明顯病理變化,出現(xiàn)細胞點狀壞死、細胞間界限模糊,且凋亡增多,存在明顯脂質(zhì)沉積,提示了DON導致小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯病理損傷,然而,添加AOS可顯著緩解上述肝臟病理損傷癥狀。肝臟和胃腸道是霉菌毒素代謝的主要部位[34],依據(jù)最新綜述文章,霉菌毒素顯著破壞機體的腸道屏障、免疫機能、抗氧化功能、微生態(tài)平衡和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等,其中DON造成腸道屏障功能障礙、免疫失調(diào)以及細胞死亡等毒性作用較為強烈[35],而且大量研究證實了不同濃度DON可導致機體出現(xiàn)急性或慢性肝臟組織損傷[36],同時,DON能影響動物肝臟組織結(jié)構(gòu)完整性和功能[37]。Peng等[38]研究發(fā)現(xiàn),小鼠攝入DON(25 μg/kg BW)30和90 d會導致肝臟中央靜脈周圍輕度炎癥浸潤,IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高,ALT活性升高,提示肝臟功能損傷。此外,已有研究證實了DON可引起肝細胞破裂、空泡化和巨噬細胞增殖[14]。與本試驗結(jié)果一致,均提示了DON可破壞肝臟形態(tài)和功能,導致肝臟毒性和炎癥。

研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加AOS可激活脂肪酸代謝相關途徑,減少肝臟組織脂肪積累,增加抗氧化活性,從而使機體免受氧化損傷[39]。Hao等[33]研究發(fā)現(xiàn),添加AOS 10 mg/kg可改善與免疫和抗腫瘤作用相關的血液代謝產(chǎn)物,從而改善小鼠的肝臟組織損傷,上述結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。這提示AOS能夠通過減少某些脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,激活小鼠機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng),緩解DON誘導的肝臟損傷。AST、ALT和LDH活性是反映肝臟功能損傷的重要指標,肝細胞發(fā)生嚴重壞死時,上述酶活性顯著升高。同時,TC和TG作為血脂的重要組分,如果肝臟發(fā)生病變,其含量會有所增加,且其含量升高可促進脂肪肝的發(fā)生與發(fā)展,一定程度上反映肝臟損傷程度。有研究表明,海藻酸寡糖顯著緩解高脂飼糧誘導小鼠血清中肝臟功能損傷指標(AST、ALT和LDH)和血脂代謝指標(TG和TC)異常[40]。與上述結(jié)果類似,本試驗表明AOS可緩解DON誘導的小鼠臟肝功能紊亂和脂類代謝異常,減少機體脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生和肝臟脂質(zhì)沉積,進而緩解DON誘導的小鼠肝臟損傷。

4 結(jié) 論

AOS能夠改善肝臟病理學損傷、機體炎癥和氧化應激,維護肝臟功能,進而緩解DON誘導的小鼠肝臟損傷。