牛秋雪 邵仙萍* 葉金云* 戚常樂 吳成龍 龐 棟 董舒樂 莫俊燕

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,水生動(dòng)物繁育與營養(yǎng)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖州 313000;2.湖州學(xué)院生命健康學(xué)院,湖州 313000)

魚粉富含蛋白質(zhì),氨基酸組成均衡,適口性好,可被水產(chǎn)動(dòng)物較好的吸收利用,一直是水產(chǎn)動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)的主要來源[1]。近年來,魚粉的需求持續(xù)增加,但由于氣候和環(huán)境因素,海洋漁業(yè)資源暴跌,導(dǎo)致魚粉產(chǎn)量急劇下降,供不應(yīng)求,魚粉價(jià)格居高不下[2]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,我國對(duì)魚粉的需求量越來越高,國產(chǎn)魚粉的產(chǎn)量又滿足不了國內(nèi)的市場(chǎng)需求,魚粉長期依賴進(jìn)口,這種情況嚴(yán)重增加了養(yǎng)殖成本,降低了經(jīng)濟(jì)效益,阻礙了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,因此,尋找合適的蛋白質(zhì)源替代魚粉迫在眉睫。

水產(chǎn)養(yǎng)殖的進(jìn)一步增長取決于開發(fā)可持續(xù)的蛋白質(zhì)來源,以取代水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的魚粉。昆蟲種類和數(shù)量繁多,繁殖周期短,生長快且成本低廉,對(duì)環(huán)境影響小,已受到研究者們的廣泛關(guān)注[3-4]。黑水虻(Hermetiaillucens)學(xué)名亮斑扁角水虻,是腐生性昆蟲,隸屬雙翅目,水虻科,扁角水虻屬。黑水虻幼蟲具有蛋白質(zhì)含量高,氨基酸組成均衡,富含抗菌肽、幾丁質(zhì)等特性。因此,黑水虻幼蟲可以作為替代飼料中魚粉的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料,在水產(chǎn)動(dòng)物飼料行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。黑水虻幼蟲粉作為一種潛在的高質(zhì)量蛋白質(zhì)來源,已有學(xué)者在大口黑鱸(Micropterussalmoides)[6-8]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[9]、烏鱧(Channaargus)[10]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[11]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[12]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[13]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[14]、建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[15]等水產(chǎn)動(dòng)物中進(jìn)行了研究,并獲得了良好的研究效果。Li等[13]用脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中的魚粉飼養(yǎng)半滑舌鰨,發(fā)現(xiàn)25%替代組的生長性能和飼料利用率最好。韓星星[14]在對(duì)大黃魚進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),飼喂用40%的脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉的飼料,對(duì)大黃魚幼魚的生長性能、體成分不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。Li等[15]用脫脂黑水虻蟲粉替代魚粉飼養(yǎng)建鯉,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可替代50%的魚粉。Wang等[16]發(fā)現(xiàn),60%的黑水虻幼蟲粉替代魚粉不會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長、機(jī)體免疫和抗氧化能力造成負(fù)面影響,超過60%的替代比例則會(huì)對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)造成不利影響。

中華鱉(Pelodiscussinensis)又稱甲魚、元魚等,屬于卵生兩棲爬行類動(dòng)物,是我國著名且重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。中華鱉富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖及多種微量元素與維生素,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,是一種傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品,廣泛受到人們的喜愛[17]。中華鱉生活于淡水水域,是以肉食性為主的雜食性動(dòng)物,對(duì)蛋白質(zhì)的需求量非常高,飼料配方中魚粉的占比較大,但是近年來魚粉產(chǎn)量供不應(yīng)求,價(jià)格居高不下,所以目前對(duì)中華鱉飼料中魚粉替代蛋白質(zhì)源方面的研究比較多,如使用發(fā)酵豆粕[18]、棉粕酶解蛋白[19]、蠶蛹粉[20]、蠅蛆蛋白[21]、大豆?jié)饪s蛋白[22]、大米酶解蛋白[23]等替代飼料中不同比例的魚粉。雖然已經(jīng)有很多專家學(xué)者對(duì)黑水虻蟲粉替代魚粉開展了研究,但是大多集中在魚類和甲殼類動(dòng)物上,在兩棲爬行類動(dòng)物上的研究成果較少。為此,本試驗(yàn)以脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中不同水平的魚粉,研究其對(duì)中華鱉稚鱉生長性能、抗氧化能力以及肝臟和腸道健康的影響,以期為黑水虻蟲粉在中華鱉飼料中的應(yīng)用提供參考依據(jù),為中華鱉規(guī)?；慕】叼B(yǎng)殖提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料的制作

以白魚粉(粗蛋白質(zhì)含量為67.68%,粗脂肪含量為6.54%)、脫脂黑水虻幼蟲粉(粗蛋白質(zhì)含量為46.71%,粗脂肪含量為13.72%)、豆粕、玉米蛋白粉和血粉為蛋白質(zhì)源,α-淀粉為糖源,魚油為脂肪源,配制成5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。5種試驗(yàn)飼料中脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉的比例分別為0(F0)、15%(F15)、30%(F30)、45%(F45)、60%(F60)。試驗(yàn)飼料的各種原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過60目篩稱重,通過逐級(jí)擴(kuò)大法將各種原料混勻,充分混勻后將混合物用雙螺桿擠條機(jī)制成直徑為1.5 mm的顆粒飼料,然后放到熱風(fēng)循環(huán)烘箱內(nèi)37 ℃烘至恒重,最后密封好放到-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1,白魚粉、脫脂黑水虻幼蟲粉以及試驗(yàn)飼料的氨基酸組成見表2。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items試驗(yàn)飼料 Experimental dietsF0F15F30F45F60魚油 Fish oil4.303.222.161.08酵母水解物 Yeast hydrolysate1.501.501.501.501.50維生素預(yù)混料 Vitamin premix1)0.600.600.600.600.60礦物元素預(yù)混料 Mineral premix2)0.600.600.600.600.60磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.801.801.801.801.80氯化膽堿 Choline chloride0.500.500.500.500.50合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平(實(shí)測(cè)值) Nutrient levels (measured values)干物質(zhì) DM91.9792.8993.0093.4293.45粗蛋白質(zhì) CP45.5345.7245.6545.4045.50粗脂肪 EE7.127.207.167.407.41粗灰分 Ash10.6511.3812.2012.7213.24

表2 白魚粉、脫脂黑水虻幼蟲粉以及試驗(yàn)飼料的氨基酸組成(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目Items白魚粉White fish meal脫脂黑水虻幼蟲粉Defatted black soldier fly larvae meal試驗(yàn)飼料 Experimental dietsF0F15F30F45F60半胱氨酸 Cys0.69±0.020.39±0.010.49±0.010.47±0.010.47±0.010.45±0.010.42±0.01酪氨酸 Tyr2.19±0.052.80±0.041.39±0.011.51±0.011.62±0.021.79±0.011.96±0.06脯氨酸 Pro6.59±0.125.13±0.065.40±0.015.22±0.035.24±0.065.08±0.015.09±0.11總非必需氨基酸 TNEAA36.20±0.8226.10±0.5125.28±0.0625.00±0.0924.86±0.2024.90±0.1225.15±0.70總氨基酸 TAA66.40±1.5545.64±0.7845.01±0.1644.54±0.1844.01±0.3644.15±0.2044.51±0.32

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用中華鱉稚鱉購自浙江湖州菱湖養(yǎng)殖場(chǎng),在湖州師范學(xué)院水生生物養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行養(yǎng)殖。中華鱉稚鱉在規(guī)格為50 cm×60 cm×40 cm的玻璃缸內(nèi)養(yǎng)殖,缸內(nèi)設(shè)有增氧裝置,一共25個(gè)玻璃缸。在每個(gè)玻璃缸內(nèi)都采用聚氯乙烯(PVC)扁管及網(wǎng)片作為水中的遮蔽物,水面上設(shè)置漂浮木板作為中華鱉稚鱉休息與曬背場(chǎng)所。選取規(guī)格相近、體表無傷、體質(zhì)健壯的中華鱉稚鱉175只,初重為(4.98±0.18) g,在經(jīng)過低濃度的碘消毒后,隨機(jī)分成5組,每組設(shè)置5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)7只中華鱉,分別飼喂5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料,養(yǎng)殖周期為8周。在飼養(yǎng)過程中,每日投喂量為每缸中華鱉體重的3%～5%,每日投喂3次(08:00、12:30、17:30),每周根據(jù)中華鱉稚鱉生長情況調(diào)整投喂量。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)開始前先暫養(yǎng)1周。試驗(yàn)期間,水溫保持在28～32 ℃,每天保持不間斷地充氣增氧和吸污,每次吸污之后再進(jìn)行飼料投喂;每天換水,每次的換水量大約為總水量的1/3;光照與自然光照同步。試驗(yàn)期間記錄水溫、投喂量、攝食和死亡情況。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品采集

飼養(yǎng)8周后,禁食24 h,用MS-222將中華鱉稚鱉麻醉,用毛巾擦干體表的水分,記錄每組中華鱉數(shù)目并稱重,測(cè)量體長、體厚、體寬。從每個(gè)玻璃缸中隨機(jī)選取1只中華鱉進(jìn)行體成分分析,余下的中華鱉稚鱉進(jìn)行試驗(yàn)樣品的采集。使用1 mL注射器,從中華鱉稚鱉的脖頸血管處抽血,將血液放入1.5 mL離心管中,在4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min,吸取上清液,然后將血清樣品放在-80 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩ｋS后將中華鱉稚鱉于冰袋上解剖,采集肝臟和腸道,剝離四肢附著的脂肪組織,測(cè)量肝臟濕重和四肢脂肪濕重并記錄,另取部分腸道組織置于組織固定液中,用于制作組織切片。

1.3.2 生長性能與形體指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)以下公式計(jì)算相關(guān)指標(biāo):

成活率(survival rate,SR,%)=
(終末只數(shù)/初始只數(shù))×100;
增重率(weight gain rate,WGR,%)=
[(終末體重-初始體重)/初始體重]×100;
飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=
攝食量/(終末體重-初始體重);
特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=
[(ln終末體重-ln初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù)]×100;
體比系數(shù)(body coefficient,BC,%)=
(體厚/體寬)×100;
肝體指數(shù)(hepatosomatic index,HSI,%)=
(肝臟濕重/終末體重)×100;
脂體指數(shù)(intraperitoneal index,IPI,%)=
(四肢脂肪濕重/終末體重)×100。

1.3.3 試驗(yàn)飼料和中華鱉體常規(guī)營養(yǎng)成分分析

試驗(yàn)飼料和中華鱉體的常規(guī)營養(yǎng)成分含量檢測(cè)方法如下:按照(105±2) ℃烘箱烘至恒重的方法直接測(cè)定水分含量,然后計(jì)算干物質(zhì)含量;使用杜馬斯全自動(dòng)快速定氮儀測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量;按照索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量;使用馬弗爐于550 ℃灼燒法測(cè)定粗灰分含量;使用全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立L-8900)測(cè)定氨基酸(除色氨酸)含量。

1.3.4 血清生化指標(biāo)、肝臟抗氧化指標(biāo)以及肝臟和腸道消化酶活性的測(cè)定

血清生化指標(biāo):總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、乳酸(LD)含量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性,ALB/GLB、GOT/GPT比值。

肝臟抗氧化指標(biāo):丙二醛(MDA)含量,過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,總抗氧化能力(T-AOC)。

肝臟和腸道消化酶活性:胰蛋白酶(TRY)、α-淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性。

以上指標(biāo)均采用南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定方法參照說明書進(jìn)行。

1.3.5 腸道組織形態(tài)和腸道菌群的測(cè)定

將剛分離的腸道組織在4 ℃環(huán)境下固定于4%多聚甲醛內(nèi),送至杭州浩克生物技術(shù)有限公司進(jìn)行石蠟包埋制作切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后用KF-Viewer軟件觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并測(cè)量絨毛高度(VH)、黏膜厚度(MT)、隱窩深度(CD)。取腸道組織送至廣州基迪奧生物科技有限公司,進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序,然后對(duì)中華鱉稚鱉的腸道菌群進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理。用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),如果差異顯著,再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn),試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié) 果

2.1 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉生長性能與形體指標(biāo)的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉生長性能與形體指標(biāo)的影響如表3所示。各組中華鱉稚鱉的攝食量、體比系數(shù)和肝體指數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組(F0組)相比,F15、F30和F45組的終末體重、成活率、增重率和特定生長率均沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05),F60組則顯著降低(P<0.05);F15和F45組的飼料系數(shù)沒有顯著變化(P>0.05),F30和F60組則顯著升高(P<0.05)。中華鱉稚鱉的脂體指數(shù)隨著替代比例的上升呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì),當(dāng)脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例為45%和60%時(shí),與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。

表3 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉生長性能與形體指標(biāo)的影響

2.2 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉體成分的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉體成分的影響如表4所示。脫脂黑水虻幼蟲粉替代不同比例的魚粉使中華鱉稚鱉的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量不同程度降低。F60組的干物質(zhì)、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),F30組的粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉體成分的影響

2.3 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉血清生化指標(biāo)的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉血清生化指標(biāo)的影響如表5所示。各組中華鱉稚鱉血清中TP、ALB、GLB和LD含量,ALB/GLB和GOT/GPT比值,GPT、GOT和AKP活性均無顯著差異(P>0.05)。F45組血清中ACP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但是其他組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表5 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉血清生化指標(biāo)的影響

2.4 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟抗氧化指標(biāo)的影響如表6所示。隨著替代比例的上升,中華鱉稚鱉肝臟MDA含量逐漸降低,4個(gè)替代組(F15、F30、F45和F60組)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4個(gè)替代組的肝臟T-AOC與對(duì)照組沒有顯著差異(P>0.05)。肝臟CAT和SOD活性隨著替代比例的上升呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),雖然在各組之間沒有顯著差異(P>0.05),但是4個(gè)替代組的肝臟CAT和SOD活性均高于對(duì)照組。F30組肝臟T-AOC、CAT和SOD活性最高。

表6 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟和腸道消化酶活性以及腸道組織形態(tài)的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟和腸道消化酶活性的影響如表7所示。隨著替代比例的上升,中華鱉稚鱉肝臟胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性有先上升后下降的趨勢(shì),均在F30組達(dá)到最高。與對(duì)照組相比,各替代組肝臟胰蛋白酶和α-淀粉酶活性沒有顯著變化(P>0.05),但F30組肝臟α-淀粉酶活性顯著高于F45和F60組(P<0.05);F30組肝臟脂肪酶活性較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。腸道胰蛋白酶活性在各組之間沒有顯著差異(P>0.05);當(dāng)脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例為45%時(shí),腸道的α-淀粉酶和脂肪酶活性最高,其中α-淀粉酶顯著高于F15組(P<0.05),脂肪酶活性顯著高于F30組(P<0.05)。

表7 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟和腸道消化酶活性的影響

中華鱉稚鱉腸道組織切片見圖1,脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道形態(tài)的影響如表8所示。中華鱉稚鱉腸道的隱窩深度在各組之間沒有顯著差異(P>0.05),但是當(dāng)脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例為45%時(shí),腸道的絨毛高度和黏膜厚度是最大的,而隱窩深度是最小的。F45組腸道的絨毛高度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),黏膜厚度顯著高于F15組(P<0.05)。各替代組腸道的黏膜厚度與對(duì)照組相比沒有顯著變化(P>0.05)。

2.6 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群alpha多樣性的影響如表9所示。所有樣品的覆蓋率(Goods coverage)均在99.96%以上,證明本次樣品中存在的微生物種類在測(cè)序過程中均被檢測(cè)到。與對(duì)照組相比,脫脂黑水虻幼蟲粉替代不同比例魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群alpha多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))沒有顯著影響(P>0.05)。

VH:絨毛高度 villus height;CD:隱窩深度 crypt depth;MT:黏膜厚度 mucosa thickness。

表8 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道組織形態(tài)的影響

表9 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群alpha多樣性的影響

圖2為各組中華鱉稚鱉腸道菌群在門和屬水平上的組成。在門水平上,5組中華鱉稚鱉腸道菌群中排在前10的菌門為變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、衣原體門(Chlamydiae)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)。雖然各組替代魚粉的比例不同,但是各組腸道菌群在相對(duì)豐度排在前3的優(yōu)勢(shì)菌門是相同的,均是變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門,其中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門,在F0～F60組中的相對(duì)豐度分別為59.79%、73.97%、64.22%、83.52%、61.32%。在屬水平上,5組中華鱉稚鱉腸道菌群中排在前10的菌屬為鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、鯨桿菌屬(Cetobacteriu)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、副梭菌屬(Paraclostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、螺桿菌屬(Helicobacter)、阿克曼菌屬(Akkermansia)。5組中華鱉稚鱉腸道菌群中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬是不相同的,F0組是鯨桿菌屬,占比32.31%,F15組是鄰單胞菌屬,占比55.28%,F30組是鯨桿菌屬,占比22.73%,F45組是鄰單胞菌屬,占比33.78%,F60組是鄰單胞菌屬,占比31.68%,其中F0和F30組的優(yōu)勢(shì)菌屬相同,F15、F45和F60組的優(yōu)勢(shì)菌屬相同。

Proteobacteria:變形菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Epsilonbacteraeota:埃普西隆桿菌門;Verrucomicrobia:疣微菌門;Chlamydiae:衣原體門;Actinobacteria:放線菌門;Chloroflexi:綠彎菌門;Planctomycetes:浮霉菌門;Plesiomonas:鄰單胞菌屬;Cetobacteriu:鯨桿菌屬;Acinetobacter:不動(dòng)桿菌屬;Vibrio:弧菌屬;Aeromonas:氣單胞菌屬;Bacillus:芽孢桿菌屬;Paraclostridium:副梭菌屬;Bacteroides:擬桿菌屬;Helicobacter:螺桿菌屬;Akkermansia:阿克曼菌屬;Other:其他;Unclassified:未分類。

分別對(duì)中華鱉稚鱉腸道中主要菌群在門、屬和種水平上的相對(duì)豐度進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)整理后得到表10。由表10可知,各組中華鱉稚鱉腸道菌群的相對(duì)豐度在門水平上無顯著差異(P>0.05);脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉后變形菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì),梭桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度有降低的趨勢(shì)。在屬水平上,F15組鄰單胞菌屬的相對(duì)豐度顯著高于F0和F30組(P<0.05),與F45和F60組無顯著差異(P>0.05);脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉后鯨桿菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度有降低的趨勢(shì),不動(dòng)桿菌屬和弧菌屬的相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì),但是變化均不顯著(P>0.05)。在種水平上,F15組類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)的相對(duì)豐度顯著高于F0和F30組(P<0.05),與F45和F60組無顯著差異(P>0.05);霍亂弧菌(Vibriocholerae)和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronir)的相對(duì)豐度各組間無顯著差異(P>0.05)。

表10 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道主要菌群相對(duì)豐度的影響

脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道梭桿菌門/變形菌門比值和穩(wěn)態(tài)指數(shù)[(梭桿菌門+厚壁菌門+擬桿菌門)/變形菌門]的影響如圖3所示。從圖中可以看出,各替代組腸道梭桿菌門/變形菌門比值和穩(wěn)態(tài)指數(shù)都低于對(duì)照組,但是差異均不顯著(P>0.05),且各替代組間也沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉生長性能、形體指標(biāo)和體成分的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中魚粉比例的上升,中華鱉稚鱉的攝食量、體比系數(shù)和肝體指數(shù)均沒有發(fā)生顯著變化,且替代比例為45%時(shí)對(duì)中華鱉稚鱉的增重率、成活率、特定生長率、飼料系數(shù)也沒有產(chǎn)生顯著影響,但替代比例為60%時(shí),增重率、特定生長率、成活率和脂體指數(shù)顯著降低,飼料系數(shù)顯著升高,這說明飼料中適量添加脫脂黑水虻幼蟲粉不會(huì)影響中華鱉的生長。韓星星[14]利用脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉飼喂大黃魚幼魚的研究發(fā)現(xiàn),40%的替代比例能夠顯著提高大黃魚幼魚的增重率和特定生長率,但是替代比例超過40%會(huì)影響大黃魚幼魚的生長。在遺傳背景與試驗(yàn)環(huán)境一致的情況下,中華鱉稚鱉的生長主要受攝食情況和飼料營養(yǎng)成分的影響。黑水虻幼蟲含有幾丁質(zhì)成分,幾丁質(zhì)能夠抑制機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,從而降低生長性能[24]。因此,本研究中,當(dāng)脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例達(dá)到60%時(shí)會(huì)降低中華鱉稚鱉的生長,其原因可能與飼料中幾丁質(zhì)含量升高有關(guān)。

數(shù)據(jù)柱未標(biāo)注字母表示差異不顯著(P>0.05)。

體成分是評(píng)價(jià)魚類生長和營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中不同比例的魚粉使中華鱉稚鱉的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量不同程度降低。在大口黑鱸中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,即脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉影響了蛋白質(zhì)和脂肪在大口黑鱸體內(nèi)的沉積,降低了大口黑鱸全魚粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量[25]。Wang等[26]對(duì)七星鱸(Lateolabraxjaponicus)的研究結(jié)果顯示,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代比例的上升,全魚粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量逐漸降低,其中48%替代組與對(duì)照組差異顯著。Xiao等[11]的試驗(yàn)結(jié)果也表明,隨著脫脂黑水虻粉添加量的增加,黃顙魚全魚粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量逐漸下降。但是對(duì)建鯉的研究則顯示,脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉不會(huì)影響魚體蛋白質(zhì)的沉積[15]。出現(xiàn)上述不同研究結(jié)果可能與飼料配方組成不同以及飼糧中脫脂黑水虻幼蟲粉的添加量不同有關(guān)。

3.2 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉血清生化指標(biāo)的影響

魚類的血清生化指標(biāo)與其營養(yǎng)狀態(tài)和代謝狀況有著密切的聯(lián)系,同時(shí)也是評(píng)價(jià)健康狀況和應(yīng)激狀況的關(guān)鍵指標(biāo)[27]。血清中GPT和GOT的活性是反映動(dòng)物肝細(xì)胞受損傷的主要標(biāo)志[28-29]。一般而言,這2種轉(zhuǎn)氨酶在機(jī)體肝臟中的活性最高,在血清中的活性偏低,但是當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí),血液中GOT和GPT的活性就會(huì)增強(qiáng)[30]。ACP和AKP在水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫過程中發(fā)揮著重要作用,血清中ACP和AKP的活性可反映動(dòng)物機(jī)體的免疫功能[31]。本研究中,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的增加,血清中GPT、GOT和AKP的活性無顯著變化,ACP活性有所升高,45%替代組的ACP活性與對(duì)照組相比有顯著差異,這表明45%的替代比例會(huì)提高中華鱉稚鱉的非特異性免疫能力。當(dāng)血清中ALB含量下降、GLB含量上升,即ALB/GLB比值下降,會(huì)造成機(jī)體免疫紊亂[32]。本試驗(yàn)中,脫脂蟲粉替代不同比例魚粉對(duì)中華鱉稚鱉血清ALB、GLB、TP含量及ALB/GLB比值沒有顯著影響,說明脫脂蟲粉代替部分魚粉后未造成中華鱉稚鱉免疫紊亂,這與脫脂黑水虻蟲粉替代魚粉在黃顙魚[33]和建鯉[15]上所得的結(jié)果一致。

3.3 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟抗氧化能力的影響

T-AOC是反映機(jī)體內(nèi)各種抗氧化酶的總活性,具有清除活性氧、判斷機(jī)體健康狀況的重要作用;CAT和SOD可以有效地清除氧自由基,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[14]。MDA是一種重要的膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,可間接反映機(jī)體受損傷程度,其含量越高損傷程度越大[34]。因此,T-AOC、SOD與CAT活性以及MDA含量是檢測(cè)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究顯示,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的上升,中華鱉稚鱉肝臟CAT和SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),但各組之間沒有顯著差異;肝臟MDA含量逐漸降低,4個(gè)替代組均顯著低于對(duì)照組;4個(gè)替代組肝臟T-AOC與對(duì)照組沒有顯著差異,以30%替代組肝臟T-AOC最高。陳永康等[35]對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究發(fā)現(xiàn),隨著黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的上升,肝胰腺T-AOC和SOD活性先升高后降低,替代比例為20%時(shí)抗氧化能力最高。在對(duì)大黃魚幼魚的研究中,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的上升,肝臟T-AOC和CAT活性先上升后降低,肝臟MDA含量下降,替代比例為40%時(shí)抗氧化酶活性最高[14]。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致,說明脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中部分魚粉可以提高中華鱉稚鱉肝臟抗氧化能力。

3.4 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉肝臟和腸道消化酶活性以及腸道組織形態(tài)的影響

肝臟和腸道是機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,完整的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)是水產(chǎn)動(dòng)物健康生長的基礎(chǔ)[26]。Lu等[36]研究發(fā)現(xiàn),提高飼料中脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉的比例會(huì)降低草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性。Li等[13]對(duì)半滑舌鰨的研究也有相似的結(jié)果,即脫脂黑水虻幼蟲粉替代超過25%的魚粉會(huì)降低腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。本試驗(yàn)中,隨著脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的上升,中華鱉稚鱉肝臟胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性均有先上升后下降的趨勢(shì),在F30組達(dá)到最高;腸道胰蛋白酶活性在各組之間沒有顯著差異;腸道α-淀粉酶和脂肪酶活性以及絨毛高度和黏膜厚度在45%替代組最高。在本試驗(yàn)條件下,脫脂黑水虻幼蟲粉替代60%的魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道組織結(jié)構(gòu)沒有造成損傷。但是,Li等[15]報(bào)道,當(dāng)建鯉飼料中黑水虻幼蟲粉替代魚粉的比例超過75%時(shí)會(huì)對(duì)腸道造成損傷,其腸道炎癥可能與飼料中幾丁質(zhì)含量有關(guān)[37]。上述研究結(jié)果表明,脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉的比例過高會(huì)導(dǎo)致魚體腸道功能受損,所以要注意脫脂黑水虻幼蟲粉在飼料中的添加量。

3.5 脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群的影響

水產(chǎn)動(dòng)物腸道中有豐富而復(fù)雜的微生物群落,腸道菌群對(duì)腸道發(fā)育、抵御病原微生物入侵至關(guān)重要,同時(shí)還參與機(jī)體營養(yǎng)代謝,在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用[38-39]。因此,健康的腸道菌群對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn),飼料中添加脫脂黑水虻幼蟲粉會(huì)增加虹鱒腸道菌群多樣性[40]。但是,Lu等[36]的研究發(fā)現(xiàn),脫脂黑水虻幼蟲粉替代魚粉對(duì)草魚幼魚腸道菌群多樣性沒有顯著影響。陳延娜等[41]研究表明,飼料中添加黑水虻蟲油能夠改變草魚腸道菌群組成,隨著黑水虻蟲油添加量的提高,草魚腸道菌群的豐度和多樣性也會(huì)提高。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),脫脂黑水虻幼蟲粉替代不同比例的魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道菌群多樣性沒有顯著影響,但是對(duì)不同菌群的相對(duì)豐度有一些改變。有研究發(fā)現(xiàn),穩(wěn)態(tài)指數(shù)與魚體健康有關(guān),梭桿菌門/變形菌門比值越高,腸道微生物群落越穩(wěn)定[42-43]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),脫脂黑水虻幼蟲粉替代不同比例的魚粉對(duì)中華鱉稚鱉腸道梭桿菌門/變形菌門比值和穩(wěn)態(tài)指數(shù)沒有顯著影響。鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬屬于有害菌屬,鯨桿菌屬屬于有益菌屬[44-45]。本研究中,30%替代組鄰單胞菌屬的相對(duì)豐度最低,鯨桿菌屬的相對(duì)豐度較高;隨著替代比例的上升,霍亂弧菌和維氏氣單胞菌的相對(duì)豐度有先降低后升高的趨勢(shì),以30%替代組最低;類志賀鄰單胞菌的相對(duì)豐度在30%替代組最低,與對(duì)照組差異不顯著,表明脫脂黑水虻幼蟲粉替代30%的魚粉可以改善中華鱉稚鱉的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下,脫脂黑水虻幼蟲粉替代飼料中30%～45%的魚粉不會(huì)對(duì)中華鱉稚鱉的生長性能產(chǎn)生負(fù)面影響,并能夠改善肝臟抗氧化能力與腸道菌群結(jié)構(gòu)。