韓瑞玲 王珊珊 宋俊英 王丹玉 汪 攀* 易敢峰* 周志剛

(1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司,福建省水產(chǎn)功能性飼料及養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,漳州 363500;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,中國(guó)-挪威魚(yú)類消化道微生物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又名南美白對(duì)蝦,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一。因其殼薄體肥,肉質(zhì)鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,市場(chǎng)需求日益增加,養(yǎng)殖業(yè)得以蓬勃發(fā)展,2021年我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)127萬(wàn)t[1]。然而,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的提高,養(yǎng)殖水體環(huán)境失調(diào),養(yǎng)殖動(dòng)物疾病頻發(fā),這嚴(yán)重阻礙了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2-3]。養(yǎng)殖過(guò)程使用抗生素是防控疾病較為常見(jiàn)的手段,但隨著病原菌抗藥性的增強(qiáng)和藥物殘留等問(wèn)題的日趨嚴(yán)重,尋找藥物防控的替代手段已成為當(dāng)務(wù)之急[4]。益生菌可改善腸道菌群平衡、生長(zhǎng)性能、飼料轉(zhuǎn)化、免疫狀態(tài)、疾病防御和抗應(yīng)激能力,進(jìn)而促進(jìn)宿主健康,是抗生素的有效替代品[5]。但是對(duì)蝦飼料加工過(guò)程中的高溫熟化過(guò)程會(huì)使益生菌失活,因此益生菌在對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用受到一定的限制。

發(fā)酵軟顆粒飼料是指利用一些特種功能性微生物對(duì)全價(jià)顆粒飼料進(jìn)行發(fā)酵,最終制成的含有特定量活性益生菌及其代謝產(chǎn)物的濕顆粒飼料。發(fā)酵軟顆粒飼料采用先造粒后發(fā)酵的生產(chǎn)工藝,具有全價(jià)配合飼料和益生菌的雙重優(yōu)勢(shì)。首先,其具有常規(guī)顆粒飼料的營(yíng)養(yǎng)組成與形狀,在滿足動(dòng)物生長(zhǎng)需求的同時(shí)還便于投喂與采食;其次,發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)常規(guī)飼料進(jìn)行了預(yù)消化,營(yíng)養(yǎng)成分更有利于吸收,抗?fàn)I養(yǎng)因子被降解;最后,發(fā)酵軟顆粒飼料中含有活性益生菌及其全部代謝產(chǎn)物,它們可增加常規(guī)顆粒飼料的益生功能。劉志云等[6]用發(fā)酵全價(jià)飼料階段性飼喂生長(zhǎng)豬30 d,結(jié)果表明發(fā)酵全價(jià)飼料可提高平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和飼料轉(zhuǎn)化率,降低死淘率及糞便臭味物質(zhì)含量,具有很好的抗生素替代效果;陳志敏等[7]研究發(fā)現(xiàn),10%的發(fā)酵全價(jià)飼料替代肉雞飼糧可降低料重比,提高平均日增重,10%和20%發(fā)酵全價(jià)飼料替代組肉雞十二指腸絨毛高度以及十二指腸和空腸絨毛高度/隱窩深度值顯著高于對(duì)照組;何如芳[8]在斷奶仔豬飼糧中添加30%的發(fā)酵全價(jià)飼料,飼喂28 d,結(jié)果表明發(fā)酵全價(jià)飼料可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能,改善腸道健康,提高斷奶仔豬的抗病力;胡新旭等[9]用含20%固態(tài)發(fā)酵全價(jià)飼料的飼糧飼喂生長(zhǎng)育肥豬154 d,可提高生長(zhǎng)育肥豬的生長(zhǎng)性能,增強(qiáng)免疫力,改善肉品質(zhì),實(shí)現(xiàn)無(wú)抗飼養(yǎng);Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn),混合菌株發(fā)酵全價(jià)飼料可通過(guò)改善凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)、抗氧化能力、消化以及腸道菌群,進(jìn)而維持其健康狀態(tài),促進(jìn)其生長(zhǎng),其混合菌株組成為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis),添加水平為1×108CFU/g。目前,發(fā)酵全價(jià)飼料的研究主要集中在豬、雞等動(dòng)物上,在水產(chǎn)動(dòng)物凡納濱對(duì)蝦上的研究較少。因此,本試驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦配合顆粒飼料為發(fā)酵底物,利用由鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母和索氏鯨桿菌(Cetobacteriumsomerae)復(fù)配的發(fā)酵菌劑進(jìn)行發(fā)酵,制備凡納濱對(duì)蝦發(fā)酵軟顆粒飼料,并按一定比例替代常規(guī)配合飼料投喂凡納濱對(duì)蝦,從生長(zhǎng)性能、血清指標(biāo)、肝胰腺和腸道形態(tài)以及腸道菌群等多方面入手,探討發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響,以期為發(fā)酵軟顆粒飼料在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵軟顆粒飼料的制備

以魚(yú)粉和豆粕為蛋白質(zhì)源,大豆油、魚(yú)油和卵磷脂為脂肪源配制成粗蛋白質(zhì)約為42.0%、粗脂肪約為7.0%的基礎(chǔ)飼料(粒徑1.0 mm),其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。將5 kg復(fù)合菌發(fā)酵劑(購(gòu)自北京某水產(chǎn)科技有限公司,主要成分為鼠李糖乳桿菌、枯草芽孢桿菌及釀酒酵母等益生菌,活菌數(shù)量為1010CFU/g)溶于200 kg、37 ℃溫水中,再與800 kg基礎(chǔ)飼料混合,隨后將混合均勻的物料裝入帶有出氣閥的發(fā)酵袋中(5 kg/袋),加熱密封,28 ℃靜置發(fā)酵7 d,發(fā)酵結(jié)束后將其保存于4 ℃冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 發(fā)酵軟顆粒飼料成分測(cè)定

發(fā)酵軟顆粒飼料粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018測(cè)定,粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006測(cè)定,粗纖維含量參照GB/T 6434—2006測(cè)定,酸溶蛋白質(zhì)含量參照NY/T 3801—2020測(cè)定。發(fā)酵軟顆粒飼料益生菌數(shù)量采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定;其中,乳酸菌計(jì)數(shù)采用MRS瓊脂培養(yǎng)基,芽孢桿菌計(jì)數(shù)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,酵母菌計(jì)數(shù)采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基,均在37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。上述培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content玉米蛋白粉 Corn gluten meal3.00米糠 Rice bran2.00維生素C酯 Vitamin C ester0.15氯化膽堿 Choline chloride0.25維生素預(yù)混料 Vitamin premix1)0.10礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)0.50磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50膨潤(rùn)土 Bentonite2.00合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)水分 Moisture9.90粗蛋白質(zhì) CP42.00粗脂肪 EE7.00

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

預(yù)試驗(yàn)在福建省詔安縣梅嶺鎮(zhèn)南門(mén)村大北農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗(yàn)基地進(jìn)行。對(duì)蝦在循環(huán)水桶馴化2周后,選用450只健康、規(guī)格一致[(3.24±0.10) g]的個(gè)體,將其隨機(jī)分到9個(gè)500 L的循環(huán)水養(yǎng)殖桶中,每桶50只。將9個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)分為3組,每組3個(gè)重復(fù),每天飽食投喂3次(08:00、14:00和19:00),3組對(duì)蝦分別用發(fā)酵軟顆粒飼料按2.5%、5.0%和10.0%的比例替代基礎(chǔ)飼料,進(jìn)行為期2周的預(yù)試驗(yàn)。期間觀察對(duì)蝦的采食速度、采食量、腸道健康狀況和對(duì)蝦糞便形態(tài)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇按5.0%比例替代基礎(chǔ)飼料進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。

養(yǎng)殖試驗(yàn)在福建省詔安縣梅嶺鎮(zhèn)南門(mén)村大北農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗(yàn)基地進(jìn)行。對(duì)蝦在循環(huán)水桶用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周后,選用300只健康、規(guī)格一致[(3.35±0.08) g]的個(gè)體,將其隨機(jī)分到6個(gè)500 L的循環(huán)水養(yǎng)殖桶中,每桶50只。將6個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)分為2組,每組3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組和試驗(yàn)組對(duì)蝦分別投喂基礎(chǔ)飼料和試驗(yàn)飼料,其中試驗(yàn)飼料現(xiàn)用現(xiàn)配,每次將5%的發(fā)酵軟顆粒飼料和95%的基礎(chǔ)飼料混合均勻即為試驗(yàn)飼料,開(kāi)袋后剩余的發(fā)酵軟顆粒飼料封口后繼續(xù)存放于4 ℃冰箱中。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)6周,每天08:00、14:00和19:00進(jìn)行投喂,根據(jù)對(duì)蝦進(jìn)食情況和天氣變化調(diào)整具體投喂量,總投喂量為對(duì)蝦體質(zhì)量的4%～5%。養(yǎng)殖期間,每天換水1次,每次換水量為養(yǎng)殖水體的1/4,并記錄每個(gè)試驗(yàn)桶中對(duì)蝦的攝食和死亡情況。養(yǎng)殖用水采用經(jīng)過(guò)濾和紫外消毒的天然海水,水溫22～28 ℃,鹽度28‰～32‰,pH為8.4～8.6,通過(guò)底部曝氣保證水中溶解氧含量在5 mg/L以上。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,凡納濱對(duì)蝦禁食24 h,稱重并記錄每桶總數(shù),計(jì)算生長(zhǎng)性能。從每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)抽取10尾對(duì)蝦取血,放于4 ℃冰箱中靜置12 h,3 500 r/min 離心10 min,取上清液,保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)血清指標(biāo)的測(cè)定;采集3尾蝦中腸和肝胰腺用Bouin’s固定液進(jìn)行固定,于4 ℃冰箱保存用于后期組織切片的制作;另取3尾蝦腸道(不含內(nèi)容物),放置于滅菌的凍存管內(nèi),轉(zhuǎn)移至液氮罐中,之后保存于-80 ℃冰箱,用于腸道菌群的測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能相關(guān)指標(biāo)增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和成活率(SR)計(jì)算公式如下:

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0;
SGR(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;
FCR=Wf/(Wm-Wn);
SR(%)=100×Nt/N0。

式中:Wt為終末均重(g);W0為初始均重(g);Wf為攝入飼料量(干重,g);Wm和Wn分別為終末總重和初始總重(g);Nt和N0分別為終末尾數(shù)和初始尾數(shù);t為養(yǎng)殖天數(shù)(d)。

1.5.2 血清指標(biāo)

血清酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和酚氧化酶(PO)活性以及丙二醛(MDA)含量采用購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 肝胰腺和腸道形態(tài)

將采集的對(duì)蝦肝胰腺和中腸組織用Bouin’s固定液固定24 h后,制備腸道組織切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染液進(jìn)行染色,中性樹(shù)膠封片,并在光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下進(jìn)行觀察;最后用MShot數(shù)字成像系統(tǒng)軟件(廣州明美科技有限公司)評(píng)估不同組對(duì)蝦肝胰腺和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異。

1.5.4 腸道菌群

腸道菌群總DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)試:采用FastDNA?Spin Kit試劑盒提取總DNA,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作;采用通用引物338F(5′-ACTCCGGGAGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增凡納濱對(duì)蝦腸道菌群16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域[11];利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,NEXTflexTMRapid DNA-Seq Kit(Bio Scientific)進(jìn)行建庫(kù),按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作;最后,在Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

生物信息分析在美吉生信云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com)完成。數(shù)據(jù)優(yōu)化:使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控,使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash,version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接。操作分類單元(OTU)聚類:使用UPARSE軟件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1),根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類。分析軟件及算法使用Qiime平臺(tái)(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(v138),設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

凡納濱對(duì)蝦腸道菌群測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為PRJNA954170。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)(t-test),P<0.05為差異顯著,結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)飼料發(fā)酵前后成分變化

由表2可知,基礎(chǔ)飼料經(jīng)過(guò)復(fù)合菌發(fā)酵劑發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗纖維含量分別提高了8.49%、42.54%、3.71%和3.97%。發(fā)酵軟顆粒飼料中乳酸菌、芽孢桿菌數(shù)和酵母菌數(shù)量分別為7.64×109、6.32×107和3.41×107CFU/g。

表2 基礎(chǔ)飼料發(fā)酵前后成分變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.2 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知,試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦WGR、SGR和SR均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),FCR顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.3 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清指標(biāo)的影響

發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響如圖1所示,試驗(yàn)組血清酸性磷酸酶和溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);血清堿性磷酸酶和酚氧化酶活性與對(duì)照組相比有所提升,但差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清抗氧化指標(biāo)的影響如圖2所示,試驗(yàn)組血清丙二醛含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05);血清總超氧化物歧化酶活性高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

圖2 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦的血清抗氧化指標(biāo)影響

2.4 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和腸道形態(tài)的影響

發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺形態(tài)的影響如圖3所示,試驗(yàn)組肝小體排列緊密,肝小體之間基底膜完整,B細(xì)胞和R細(xì)胞數(shù)量較為豐富;而對(duì)照組肝小體排列松散,基底膜脫落,B細(xì)胞有損傷,R細(xì)胞和E細(xì)胞數(shù)量減少。發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道形態(tài)的影響如圖4所示,對(duì)照組腸上皮細(xì)胞與基底膜分離(箭頭X),腸上皮細(xì)胞輕度損傷(箭頭Z);試驗(yàn)組腸上皮細(xì)胞與基底膜緊密相連(箭頭Y),腸道未見(jiàn)明顯損傷;試驗(yàn)組腸道絨毛高度高于對(duì)照組,而腸肌厚度2組之間差異不明顯。

B:B細(xì)胞 B cell;E:E細(xì)胞 E cell;R:R細(xì)胞 R cell。

MT、VH和VW箭頭分別代表腸肌厚度、絨毛高度和絨毛寬度。箭頭X顯示腸上皮細(xì)胞完全脫離基底膜,箭頭Y顯示腸上皮細(xì)胞與基底膜緊密結(jié)合,箭頭Z顯示腸上皮細(xì)胞輕度損傷。

2.5 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響

2.5.1 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群alpha多樣性分析

由表4可知,試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)與對(duì)照組相比有所降低,但差異不顯著(P>0.05);腸道菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在2組之間亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5.2 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群beta多樣性分析

凡納濱對(duì)蝦腸道菌群主坐標(biāo)分析(PCoA)如圖5所示,試驗(yàn)組腸道樣品點(diǎn)與對(duì)照組樣品點(diǎn)距離較遠(yuǎn),且各自形成明顯的團(tuán)簇,說(shuō)明試驗(yàn)組與對(duì)照組的微生物群落有顯著差異(P<0.05)。凡納濱對(duì)蝦腸道菌群非度量多維尺度(NMDS)分析如圖6所示,結(jié)果與PCoA結(jié)果相一致。

2.5.3 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群組成分析

凡納濱對(duì)蝦腸道菌群組成如圖7所示。在門(mén)水平上,變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota)是對(duì)蝦腸道中最主要的門(mén),但各門(mén)相對(duì)豐度在2組間存在一定差異。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均有所提高(變形菌門(mén)的相對(duì)豐度從54.83%提高到65.60%,擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度從13.96%提高到21.39%),而厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobiota)的相對(duì)豐度有所降低(厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度從8.99%降低到2.67%,疣微菌門(mén)的相對(duì)豐度從8.22%降低到1.74%)。在屬水平上,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組未分類_f_紅桿菌科(unclassified_f_Rhodobacteraceae)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、噬冷菌屬(Algoriphagus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、Nautella、Marinovum和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)的相對(duì)豐度有所提高,Psedoruegeria、未分類_f_黃桿菌科(unclassified_f_Flavobacteriaceae)、脫甲基醌菌屬(Demequina)、運(yùn)動(dòng)單胞菌屬(Motilimonas)、玫瑰色小桿菌屬(Roseibacillus)、未定級(jí)_f_丙酸桿菌科(norank_f_Propionibacteriaceae)、Haloferula、狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、未定級(jí)_f_紅桿菌科(norank_f_Rhodobacteraceae)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和節(jié)旋藻屬PCC-7345(Arthrospira_PCC-7345)相對(duì)豐度有所降低。

表4 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群alpha多樣性

圖5 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群主坐標(biāo)分析

圖6 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群非度量多維尺度分析

圖7 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群在門(mén)(左)和屬(右)水平上的組成

3 討 論

3.1 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)所用發(fā)酵軟顆粒飼料主要是以乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌為主的復(fù)合功能性菌種對(duì)全價(jià)顆粒飼料進(jìn)行發(fā)酵而得,兼具營(yíng)養(yǎng)性和功能性雙重功效。乳酸菌作為應(yīng)用最為廣泛的一種益生菌添加劑,無(wú)論是對(duì)人類的消化系統(tǒng)還是對(duì)動(dòng)物胃腸道消化系統(tǒng)均有著積極的作用[12]。因此,微生物發(fā)酵飼料相比于普通飼料而言,不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,并且可以有效促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收,從而起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。王軍等[13]研究發(fā)現(xiàn),在養(yǎng)殖過(guò)程中持續(xù)投喂適宜比例的發(fā)酵飼料,能顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦幼蝦的生長(zhǎng),提高蝦苗SR及餌料效率,且與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組蝦苗體色透明,攝食時(shí)間縮短;孟陽(yáng)[14]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、植物乳桿菌發(fā)酵飼料能顯著提高凡納濱對(duì)蝦的SR和SGR,且SR相較于對(duì)照飼料組提高了8.34%。本研究結(jié)果顯示,發(fā)酵軟顆粒飼料按5%比例替代基礎(chǔ)飼料相比于直接投喂基礎(chǔ)飼料而言,凡納濱對(duì)蝦的WGR、SGR和SR均顯著提高,分別提高了30.10%、16.46%和5.12%,而FCR同對(duì)照組相比顯著降低,降低了11.94%。這說(shuō)明發(fā)酵軟顆粒飼料相比于基礎(chǔ)飼料而言,能促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)。

3.2 飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清指標(biāo)的影響

凡納濱對(duì)蝦作為一種無(wú)脊椎動(dòng)物,其免疫系統(tǒng)不完善,主要依靠其有效的細(xì)胞和體液固有免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗傳染源[15];其中,溶菌酶是對(duì)蝦先天免疫系統(tǒng)中的重要防御物質(zhì),可通過(guò)溶解細(xì)胞壁來(lái)抵抗外界病原菌的入侵[16]。張盛靜等[17]研究發(fā)現(xiàn),凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌后,飼料中添加芽孢桿菌可提高溶菌酶的mRNA相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)中,投喂發(fā)酵軟顆粒飼料可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清溶菌酶活性,這與他人關(guān)于在對(duì)蝦上飼喂凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)等益生菌研究結(jié)果[18-20]一致。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是對(duì)蝦抗疾病系統(tǒng)的重要組成部分[21]。酸性磷酸酶是溶酶體酶的關(guān)鍵成分,可抵御無(wú)脊椎動(dòng)物的入侵生物體[22];堿性磷酸酶是一種參與免疫系統(tǒng)催化和代謝的金屬酶[23]。研究表明,使用益生菌可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物這2種酶的活性。Yi等[24]研究發(fā)現(xiàn)鯽魚(yú)(Carassiusauratus)攝食添加了芽孢桿菌的飼料,其血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著提高;Li等[25]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌能顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶活性。在本試驗(yàn)中,試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均高于對(duì)照組,且血清酸性磷酸酶活性顯著提高。

丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化分解代謝的產(chǎn)物,與機(jī)體自由基產(chǎn)生量成正比。當(dāng)機(jī)體內(nèi)存在的過(guò)量自由基不能被及時(shí)清除時(shí),即可攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、丙二醛含量增加,故丙二醛的含量常常可以反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊和脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,從而間接地反映出細(xì)胞損傷程度的嚴(yán)重性[26-27]。本試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦血清丙二醛含量顯著降低,這說(shuō)明發(fā)酵軟顆粒飼料可降低對(duì)蝦體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物和氧自由基的積累,抵抗氧化損傷。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,可以將生物體內(nèi)的超氧陰離子轉(zhuǎn)變成過(guò)氧根離子,超氧化物歧化酶常與丙二醛一起作為評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[28]。研究表明,芽孢桿菌可以提高凡納濱對(duì)蝦和草魚(yú)血清超氧化物歧化酶活性[29]。但在本試驗(yàn)中,試驗(yàn)組血清總超氧化物歧化酶活性相比于對(duì)照組有所提高,但差異不顯著。以上結(jié)果表明,發(fā)酵軟顆粒飼料可提高凡納濱對(duì)蝦的非特異免疫酶活性,進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)對(duì)蝦免疫力、維護(hù)機(jī)體健康生長(zhǎng)狀態(tài)的作用。

3.3 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和腸道形態(tài)的影響

肝胰腺是凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)重要的免疫器官[30],也是甲殼動(dòng)物重要的消化器官,能分泌消化酶,促進(jìn)消化吸收,儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),此外還兼具解毒功能[31]。E細(xì)胞為肝胰腺干細(xì)胞,可通過(guò)分裂和分化產(chǎn)生其他類型的肝細(xì)胞,從而補(bǔ)充一些退化損耗的細(xì)胞;R細(xì)胞的功能是吸收儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)和參與脂蛋白的代謝;B細(xì)胞負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)吸收,是消化酶合成的主要場(chǎng)所[32]。有研究表明,飼料中添加復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑時(shí),凡納濱對(duì)蝦的肝小管排列整齊、緊密,B細(xì)胞和R細(xì)胞數(shù)量均較為豐富[33]。本研究結(jié)果顯示,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料與飼喂基礎(chǔ)飼料的凡納濱對(duì)蝦相比,肝小體排列緊密,肝小體之間基底膜完整,B細(xì)胞、R細(xì)胞和E細(xì)胞數(shù)量均較為豐富,說(shuō)明發(fā)酵軟顆粒飼料有利于維持凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺健康狀態(tài),改善其生長(zhǎng)性能。

腸道不僅是對(duì)蝦消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,還是病原菌入侵機(jī)體的門(mén)戶,因此腸道的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和健康水平密切相關(guān)[34]。研究表明,腸道微絨毛與腸道吸收面積密不可分,提高腸道微絨毛高度和密度可以使消化酶與食糜更充分地接觸,增大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸面積,提高腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[35]。本研究結(jié)果顯示,與飼喂基礎(chǔ)飼料相比,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料可明顯提高凡納濱對(duì)蝦的腸絨毛高度,說(shuō)明發(fā)酵軟顆粒飼料可以促進(jìn)對(duì)蝦腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,進(jìn)而維持腸道的發(fā)育和健康。

3.4 發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響

腸道益生菌可通過(guò)促進(jìn)機(jī)體對(duì)食物的消化吸收以及競(jìng)爭(zhēng)性的抑制腸道有害微生物生長(zhǎng),進(jìn)而維持機(jī)體腸道內(nèi)生態(tài)平衡,促進(jìn)機(jī)體健康生長(zhǎng)[36]。本試驗(yàn)研究了發(fā)酵軟顆粒飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響,PCoA和NMDS分析結(jié)果顯示,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料的凡納濱對(duì)蝦與對(duì)照組相比,腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯的變化,說(shuō)明發(fā)酵軟顆?？梢哉{(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群,改變腸道微生物組成。大量研究表明,變形菌門(mén)是對(duì)蝦腸道中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[37-38],該門(mén)的一些成員參與了氮循環(huán)和有機(jī)化合物的礦化過(guò)程[39-40]。在本研究中,凡納濱對(duì)蝦腸道變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高,其次是擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén),這與Wang等[5]的研究結(jié)果一致。在屬水平上,凡納濱對(duì)蝦腸道以未分類_f_紅桿菌科、Psedoruegeria和未分類_f_黃桿菌科為主。紅桿菌科細(xì)菌在健康對(duì)蝦腸道中具有較高的相對(duì)豐度,是指示對(duì)蝦健康的關(guān)鍵微生物類群,被認(rèn)為是抗逆防病的益生菌資源[41]。研究表明,魯杰氏菌屬與對(duì)蝦SR呈顯著正相關(guān)[42]。黃桿菌科包括多種致病菌,可導(dǎo)致魚(yú)和蝦的腮部病變[43-44],對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物是有害的微生物類群。本研究發(fā)現(xiàn),飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料的凡納濱對(duì)蝦腸道中未分類_f_紅桿菌科和魯杰氏菌屬的相對(duì)豐度提高,未分類_f_黃桿菌科的相對(duì)豐度降低,這表明飼喂發(fā)酵軟顆可使等對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)向有利于健康的方向調(diào)整,這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)酵軟顆飼料對(duì)凡納濱對(duì)蝦健康的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

飼料中添加5%發(fā)酵軟顆粒飼料可提高凡納濱對(duì)蝦WGR、SRG和SR,降低FCR,增強(qiáng)非特異性免疫力,改善肝胰腺健康,調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)并改善腸道形態(tài)。