龐 棟 戚常樂(lè) 葉金云

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,水生動(dòng)物繁殖與營(yíng)養(yǎng)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖州 313000)

豆粕是我國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物飼料中最主要的植物蛋白質(zhì)源,但我國(guó)大豆自給率長(zhǎng)期不超過(guò)20%,嚴(yán)重依賴(lài)進(jìn)口[1]。自中美貿(mào)易沖突以來(lái),豆粕貿(mào)易多次被當(dāng)作談判籌碼,導(dǎo)致豆粕價(jià)格不定,供應(yīng)不穩(wěn),給我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成嚴(yán)重影響。因此,水產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)亟需開(kāi)發(fā)能夠替代豆粕的新型植物蛋白質(zhì)源。

我國(guó)是世界第一產(chǎn)棉大國(guó),棉籽粕供應(yīng)穩(wěn)定,價(jià)格相對(duì)低廉,可作為豆粕的潛在替代蛋白質(zhì)源。但棉籽粕中含有較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子,如棉酚、植酸、單寧等,會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化能力、免疫功能下降[2],肝臟、腸道、肌肉等組織器官受到損傷[3],飼料的適口性也會(huì)下降[4-5]。發(fā)酵棉籽粕(fermented cottonseed meal,FCM)是使用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵脫毒后的棉籽粕,其抗?fàn)I養(yǎng)因子含量大幅度降低,營(yíng)養(yǎng)成分含量和適口性增加,更具應(yīng)用前景[6-7]。一些學(xué)者已經(jīng)在青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)[8]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[9]、鯽(Carassiusauratus)[10]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[11]等水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象上進(jìn)行了發(fā)酵棉籽粕替代的應(yīng)用研究,但有關(guān)發(fā)酵棉籽粕替代豆粕在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)飼料中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。中華絨螯蟹屬弓蟹科,絨螯蟹屬,又名河蟹、大閘蟹,是中國(guó)傳統(tǒng)美食珍品,2019年全國(guó)年產(chǎn)量超過(guò)77萬(wàn)t[12]。植物蛋白質(zhì)源對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫功能、抗氧化能力和腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)造成影響[13-15]?；诖?本試驗(yàn)以發(fā)酵棉籽粕替代飼料中不同比例的豆粕,研究其對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能、血淋巴生化指標(biāo)、肝胰腺抗氧化指標(biāo)、腸道組織結(jié)構(gòu)與菌群的影響,以期為發(fā)酵棉籽粕在中華絨螯蟹配合飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚(yú)粉、豆粕、棉籽粕、發(fā)酵棉籽粕、菜籽粕為蛋白質(zhì)源,魚(yú)油、豆油、大豆卵磷脂為脂肪源,糊化淀粉為糖源,配制5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。5種試驗(yàn)飼料中發(fā)酵棉籽粕替代豆粕的比例分別為0(FCM0,作為對(duì)照)、20%(FCM20)、40%(FCM40)、60%(FCM60)和80%(FCM80)。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩,按照飼料配方稱(chēng)重混勻,加水混合攪拌至適當(dāng)濕度后,用雙螺桿壓條機(jī)壓制、粉碎,制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料,至烘箱40 ℃烘12～24 h,直至水分含量小于10%,保存于-20 ℃冰柜中備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items試驗(yàn)飼料 Experimental dietsFCM0FCM20FCM40FCM60FCM80粗灰分 Ash6.886.846.816.756.76游離棉酚 Free gossypol/(mg/kg)144.00175.03206.05238.80270.69

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在湖州師范學(xué)院水生生物養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)進(jìn)行,中華絨螯蟹苗購(gòu)于上海崇明某苗種廠(chǎng)。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)前,所購(gòu)中華絨螯蟹苗先在300 L水桶中暫養(yǎng)7 d,暫養(yǎng)期間投喂商業(yè)配合飼料。將附肢完整的中華絨螯幼蟹[(0.38±0.01) g]隨機(jī)分配到20個(gè)水桶中,每桶30只,每5桶為1組,共分成5組,分別飼喂1種試驗(yàn)飼料,飼喂期為8周。每個(gè)水桶中放置5捆藍(lán)色聚氯乙烯(PVC)軟管(長(zhǎng)10 cm,直徑2.5 cm,每捆5根,用扎帶固定)和4塊拱形瓦片作為遮蔽物,以減少幼蟹間相互殘殺。飼養(yǎng)前加水至水桶4/5高處,充分曝氣。養(yǎng)殖期間初始投喂量為每桶幼蟹總重的4%,每日在06:00和18:00投喂,每次投喂量相同。投喂5 h后吸除糞便和殘餌,每天更換1/3的養(yǎng)殖用水。在養(yǎng)殖期間,每天檢查死蟹情況并稱(chēng)重記錄。養(yǎng)殖水溫25.0～28.0 ℃,氨氮濃度<0.05 mg/L。

1.3 樣品采集

在為期8周的養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí),饑餓24 h,然后分別對(duì)每桶幼蟹進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱(chēng)重。所有幼蟹均在冰上麻醉。每桶隨機(jī)取2只幼蟹保存于-20 ℃,用于體成分分析。每桶隨機(jī)取8只幼蟹,在幼蟹的第3附肢基部處取血淋巴,總共吸取約3 mL血淋巴,4 ℃保存過(guò)夜,經(jīng)高速冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心后吸出血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?取出肝胰腺,稱(chēng)重后-80 ℃保存用于備用。每桶另隨機(jī)取5只幼蟹,取出腸道,保存在4%多聚甲醛溶液中,用于切片制作和組織學(xué)觀察。每組隨機(jī)取5只幼蟹,取出腸道,保存在-80 ℃用于腸道菌群測(cè)序。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算

使用如下公式計(jì)算成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)和肝胰腺指數(shù)(HSI):

成活率(%)=100×(終末蟹數(shù)/初始蟹數(shù));
增重率(%)=100×(終末體重-
初始體重)/初始體重;
特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(ln終末體重-
ln初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù);
肝胰腺指數(shù)(%)=100×(肝胰腺重/蟹體重)。

1.4.2 飼料和全蟹營(yíng)養(yǎng)成分分析

飼料和全蟹的水分含量采用105 ℃干燥法測(cè)定,粗蛋白質(zhì)含量采用燃燒法(杜馬斯定氮儀)測(cè)定,粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定,粗灰分含量采用馬弗爐灼燒法測(cè)定,游離棉酚含量參照GB/T 13086—2020測(cè)定。

1.4.3 血淋巴生化指標(biāo)和肝胰腺抗氧化指標(biāo)測(cè)定

稱(chēng)量肝胰腺樣品0.1 g左右,按1∶9的比例加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS),加入組織研磨珠2粒進(jìn)行勻漿,然后在4 ℃下1 500×g離心30 min,吸取上清液,并等分保存在-80 ℃超低溫冰箱中。使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性以及肝胰腺中還原性谷胱甘肽(GSH)含量、總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽過(guò)氧化物氧化酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。

1.4.4 腸道組織結(jié)構(gòu)觀察

將使用4%多聚甲醛固定的腸道組織送至武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行石蠟包埋,制作切片。腸道組織切片采用蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)觀察并拍照。

1.4.5 腸道菌群分析

將采集的腸道樣本(每組5個(gè)重復(fù))送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行腸道菌群DNA提取、建庫(kù)和16S rDNA測(cè)序分析。進(jìn)行物種注釋分析的數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA。鑒定結(jié)果已上傳至NCBI,SRA登錄號(hào):SRX19302757-SRX19302766。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)通過(guò)Shapiro-Wilk和Levene方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差同質(zhì)性檢驗(yàn)。通過(guò)檢驗(yàn)后的數(shù)據(jù)再進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD)表示,各組平均值之間的差異顯著性采用Turkey法檢驗(yàn)。腸道菌群數(shù)據(jù)使用成對(duì)樣品t檢驗(yàn)(t-test)方法進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,在中華絨螯蟹幼蟹飼料中使用發(fā)酵棉籽粕替代不同比例豆粕,各組幼蟹的終末體重、特定生長(zhǎng)率、增重率以及成活率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著替代比例的增加,肝胰腺指數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì),以FCM40組的肝胰腺指數(shù)最高,顯著高于FCM0和FCM80組(P<0.05)。

表2 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能的影響

2.2 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體成分的影響

由表3可知,在中華絨螯蟹幼蟹飼料中使用發(fā)酵棉籽粕替代不同比例豆粕對(duì)全蟹水分、粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。FCM20、FCM40和FCM80組全蟹粗灰分含量顯著低于FCM0和FCM60組(P<0.05)。

表3 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體成分的影響(鮮重基礎(chǔ))

2.3 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴生化指標(biāo)的影響

由表4可知,隨著替代比例的增加,血淋巴ACP和AKP活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),且以FCM60組最高,顯著高于其他各組(P<0.05)。FCM60組血淋巴ALT活性顯著低于其他各組(P<0.05)。隨著替代比例的增加,血淋巴中AST活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),且以FCM40組最低,顯著低于其他各組(P<0.05)。

表4 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴生化指標(biāo)的影響

2.4 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知,FCM40組肝胰腺CAT活性顯著高于FCM0組(P<0.05),FCM60和FCM80組則顯著低于FCM0組(P<0.05)。與FCM0組相比,各替代組(FCM20、FCM40、FCM60和FCM80組)肝胰腺T-SOD活性顯著降低(P<0.05),但在5個(gè)替代組中以FCM40組最高。FCM60和FCM80組肝胰腺T-AOC與FCM0組相比顯著升高(P<0.05)。各替代組肝胰腺中GSH含量與FCM0組相比均顯著升高(P<0.05)。與FCM0組相比,FCM20、FCM40和FCM80組肝胰腺GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。

表5 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)生長(zhǎng)性能和肝臟抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果,選取FCM0、FCM40和FCM80組進(jìn)行腸道組織結(jié)構(gòu)觀察。由圖1可知,FCM0組腸絨毛前部圍食膜與上皮細(xì)胞結(jié)合,未見(jiàn)明顯脫落情況,上皮細(xì)胞排列緊密,未見(jiàn)明顯損傷;FCM40組未見(jiàn)圍食膜與上皮細(xì)胞脫落,個(gè)別腸絨毛可見(jiàn)上皮細(xì)胞缺損;FCM80組圍食膜與上皮細(xì)胞脫落,上皮細(xì)胞可見(jiàn)明顯缺損。

2.6 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群的影響

基于生長(zhǎng)性能、肝胰腺抗氧化指標(biāo)及腸道組織學(xué)結(jié)果,選取FCM0和FCM40組進(jìn)行腸道菌群分析。根據(jù)加權(quán)Unifrac距離,使用主坐標(biāo)分析(PCoA)圖顯示FCM0和FCM40組中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群的差異。由圖2可知,代表2個(gè)組樣本的色點(diǎn)區(qū)域重合,這表明從主坐標(biāo)分析來(lái)看FCM0和FCM40組的腸道菌群組成無(wú)顯著差異。

A:FCM0組;B:FCM40組;C:FCM80組。切片觀察放大倍數(shù)為100×,比例尺長(zhǎng)度為100 μm。箭頭a顯示圍食膜從腸道上皮細(xì)胞表面脫落;箭頭b顯示腸道上皮細(xì)胞損傷。

由表6可知,FCM0和FCM40組的腸道菌群覆蓋率(Goods coverage)都在99.99%以上,說(shuō)明這2個(gè)組的腸道物種均已檢測(cè)到。2組間腸道菌群操作分類(lèi)單元(OTUs)數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。pielou_e指數(shù)和Chao1指數(shù)表現(xiàn)為FCM40組大于FCM0組,表明FCM40組腸道菌群均勻度更大,包含的物種數(shù)更多。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表現(xiàn)為FCM40組大于FCM0組。但2組間的上述各項(xiàng)指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明FCM40組中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群的α多樣性與FCM40組無(wú)顯著差異。

圖2 FCM0和FCM40組中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群主坐標(biāo)分析圖

圖3為FCM0和FCM40組中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群門(mén)水平組成,對(duì)FCM0和FCM40幼蟹腸道主要菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果列于表7。在門(mén)水平下,中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群中相對(duì)豐度排在前面的3個(gè)門(mén)分別是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén),它們是中華絨螯蟹幼蟹腸道內(nèi)的核心菌群。FCM0和FCM40組變形菌門(mén)相對(duì)豐度分別為47.28%、43.77%,厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別為31.74%和32.82%,擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度分別為17.80%和11.61%,2組間均不存在顯著差異(P>0.05);FCM0和FCM40組放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度分別為1.13%和4.17%,浮霉菌門(mén)相對(duì)豐度分別為0.97%和2.96%,均以FCM40組相對(duì)豐度更高,但2組間差異均不顯著(P>0.05);FCM0和FCM40組藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度分別為0.05%和1.92%,FCM40組顯著高于FCM0組(P<0.05);FCM0和FCM40組髕骨細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度分別為0.15%和1.08%,FCM40組相對(duì)豐度更高,但2組間差異不顯著(P>0.05)。在屬水平下,中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群主要為ZOR0006(屬于厚壁菌門(mén),無(wú)屬名)、Candidatus_Bacilloplasma、營(yíng)發(fā)酵單細(xì)胞屬、希瓦氏菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和α-變形菌綱未分類(lèi)屬,這些菌屬在FCM0和FCM40組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群α多樣性的影響

Proteobacteria:變形菌門(mén);Firmicutes:厚壁菌門(mén);Bacteroidota:擬桿菌門(mén);Actinobacteriota:放線(xiàn)菌門(mén);Planctomycetota:浮霉菌門(mén);Cyanobacteria:藍(lán)藻門(mén); Patescibacteria:髕骨細(xì)菌門(mén);Verrucomicrobiota:疣微菌門(mén);Bdellovibrionota:蛭弧菌門(mén);Desulfobacterota:脫硫桿菌門(mén);Myxococcota:黏菌門(mén);Campylobacterota:彎曲菌門(mén);Chloroflexi:綠彎菌門(mén);Acidobacteriota:酸桿菌門(mén);Deferribacterota:鐵脫桿菌門(mén);Armatimonadota:裝甲菌門(mén);Nitrospirota:硝化螺旋菌門(mén);Gemmatimonadota:芽單胞菌門(mén);Deinococcota:異常球菌門(mén);Fusobacteriota:梭桿菌門(mén);Chlamydiae:衣原體門(mén);Unclassified:未分類(lèi)。

表7 FCM0和FCM40中華絨螯蟹幼蟹腸道主要菌群的相對(duì)豐度

續(xù)表7分類(lèi)水平Taxonomic levels主要菌群Main flora組別 GroupsFCM0FCM40ZOR00069.39±12.0719.19±17.90Candidatus_Bacilloplasma13.42±19.547.76±7.05營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬 Dysgonomonas13.80±15.567.29±12.92希瓦氏菌屬 Shewanella3.45±5.1710.49±12.95屬 Genus氣單胞菌屬 Aeromonas8.62±11.794.24±7.93芽孢桿菌屬 Gemmobacter1.06±0.638.37±13.59不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter6.96±11.551.27±2.25α變形菌綱未分類(lèi)屬 Alphaproteobacteria_unclassified4.46±4.383.44±4.28

3 討 論

3.1 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能和體成分的影響

生長(zhǎng)性能是評(píng)價(jià)飼料或飼料原料對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物影響的重要指標(biāo)。飼料中添加過(guò)量的植物蛋白質(zhì)源會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)造成負(fù)面的影響。例如,楊霞等[16]研究發(fā)現(xiàn),飼料中發(fā)酵棉籽粕添加量超過(guò)24%時(shí)會(huì)降低中華絨螯蟹的生長(zhǎng)性能和成活率;Sun等[17]的研究指出,使用發(fā)酵棉籽粕替代75%的魚(yú)粉會(huì)顯著降低凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能;Sun等[18]研究顯示,在黑鯛飼料使用24%的發(fā)酵棉籽粕替代魚(yú)粉會(huì)降低黑鯛的生長(zhǎng)性能和飼料轉(zhuǎn)化率。飼料中不同的植物蛋白質(zhì)源會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能,但受養(yǎng)殖物種以及替代比例等諸多因素的影響。陳道仁等[9]使用23%的發(fā)酵棉籽粕替代9%的豆粕和全部棉籽粕后發(fā)現(xiàn),草魚(yú)的增重率顯著提升,飼料系數(shù)顯著下降。楊景豐等[19]的研究指出,在飼料中使用發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉,羅氏沼蝦的生長(zhǎng)性能隨著替代比例的升高總體呈先升高再下降的趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示,飼料中使用發(fā)酵棉籽粕替代不同比例豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的生長(zhǎng)性能未產(chǎn)生顯著影響,但以發(fā)酵棉籽粕替代20%的豆粕(FCM20組)中華絨螯蟹幼蟹的特定生長(zhǎng)率、增重率最高。

不同的植物蛋白質(zhì)源對(duì)甲殼動(dòng)物體成分也有一定影響。Han等[11]研究表明,在低魚(yú)粉飼料中使用發(fā)酵棉籽粕部分替代豆粕,凡納濱對(duì)蝦的粗脂肪含量顯著下降,其粗蛋白質(zhì)含量隨著替代比例的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。楊霞等[16]研究發(fā)現(xiàn),飼料中使用棉籽粕和發(fā)酵棉籽粕替代魚(yú)粉均未對(duì)中華絨螯蟹的體成分產(chǎn)生顯著影響。本研究中,發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和水分含量均未產(chǎn)生顯著影響,粗灰分含量隨著替代比例的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。粗灰分含量變化可能與蟹體內(nèi)微量元素和無(wú)機(jī)鹽含量有關(guān)[20],此結(jié)果也與Han等[11]在凡納濱對(duì)蝦飼料中使用發(fā)酵棉籽粕替代豆粕的試驗(yàn)結(jié)果相似。

3.2 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴生化指標(biāo)的影響

蝦蟹類(lèi)不具有特異性免疫球蛋白,體液免疫是其重要的免疫方式[21]。ACP和AKP是中華絨螯蟹體內(nèi)重要的非特異性免疫因子[22]。ALT和AST是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[23]。本試驗(yàn)中,使用發(fā)酵棉籽粕替代不同比例豆粕后,血淋巴中ACP和AKP活性隨替代比例的增加呈先上升后下降趨勢(shì),并在FCM60組達(dá)到最大值,這表明飼料中添加發(fā)酵棉籽粕可使幼蟹血淋巴中體液免疫物質(zhì)ACP和AKP的活性升高;血淋巴中ALT和AST活性則隨替代比例的增加呈下降趨勢(shì),這與Cheng等[24]在中華絨螯蟹飼料中添加棉籽粕蛋白水解物所得試驗(yàn)結(jié)果相似,表明本試驗(yàn)設(shè)定的發(fā)酵棉籽粕替代豆粕比例會(huì)對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺造成影響。

3.3 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

3.4 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

圍食膜是附于中華絨螯蟹消化道內(nèi)的多功能薄膜,主要由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成,具有選擇透過(guò)性,可以將腸上皮細(xì)胞和內(nèi)容物分開(kāi),其還是腸道菌群的主要共生場(chǎng)所[31]。本試驗(yàn)中,發(fā)酵棉籽粕替代40%的豆粕時(shí),個(gè)別腸絨毛上皮細(xì)胞可見(jiàn)損傷;發(fā)酵棉籽粕替代80%的豆粕時(shí),腸道圍食膜出現(xiàn)明顯的脫落,腸道上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷。植物蛋白質(zhì)源對(duì)腸道造成損傷的原因主要是植物蛋白質(zhì)源中通常包含多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[32],其中單寧可與圍食膜中的蛋白質(zhì)結(jié)合,植酸可以改變腸道內(nèi)pH導(dǎo)致幾丁質(zhì)溶解。Han等[33]的研究也指出飼料中的植物抗原蛋白會(huì)造成幼蟹腸道出現(xiàn)類(lèi)似損傷。

3.5 發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群的影響

腸道菌群在中華絨螯蟹營(yíng)養(yǎng)吸收過(guò)程中起重要作用,腸道菌群中的芽孢桿菌可以促進(jìn)多糖和纖維素分解,提高飼料利用率[34]。因此,本試驗(yàn)探究了發(fā)酵棉籽粕替代豆粕對(duì)幼蟹腸道菌群的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明,FCM0和FCM40組中華絨螯蟹幼蟹腸道菌群的均勻度(pielou_e指數(shù))、豐富度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))均無(wú)顯著差異。此外,測(cè)序結(jié)果顯示,這2個(gè)組腸道菌群在門(mén)水平上變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為47.28%和43.77%、31.74%和32.82、17.80%和11.61%,變形菌門(mén)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群,其次是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén);FCM0和FCM40組藍(lán)藻門(mén)的相對(duì)豐度均較低,分別為0.05%和1.92%,但FCM40組的相對(duì)豐度顯著高于FCM0組。變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的一門(mén)。有研究指出,變形菌門(mén)相對(duì)豐度的增加可以改善魚(yú)體的健康狀況[35]。在屬水平上,FCM0和FCM40組腸道主要菌群的相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異,其中主要益生菌是芽孢桿菌屬,FCM40組的相對(duì)豐度高于FCM0組。ZOR0006屬于厚壁菌門(mén),尚無(wú)屬名,其相對(duì)豐度在FCM40組要高于FCM0組。陸宏達(dá)等[36]的研究發(fā)現(xiàn),較低品質(zhì)的池塘養(yǎng)殖中華絨螯蟹腸道菌群中,ZOR0006的相對(duì)豐度較高,但并未說(shuō)明該菌對(duì)華絨螯蟹生長(zhǎng)及免疫和抗氧化性能的影響。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下,發(fā)酵棉籽粕替代20%的豆粕可提高中華絨螯蟹幼蟹的生長(zhǎng)性能,但未達(dá)到顯著水平;發(fā)酵棉籽粕替代80%的豆粕顯著提升了中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺抗氧化能力;發(fā)酵棉籽粕替代40%的豆粕不會(huì)改變中華絨螯蟹幼蟹腸道主要菌群結(jié)構(gòu)。因此,以生長(zhǎng)性能作為評(píng)價(jià)指標(biāo),建議發(fā)酵棉籽粕替代豆粕的比例為20%;以肝胰腺和腸道健康為評(píng)價(jià)指標(biāo),發(fā)酵棉籽粕替代豆粕比例不宜超過(guò)40%。