成志強(qiáng) 管勤超 臧長江 陳開旭 劉建成 焦毅靈 李鳳鳴 李曉斌 楊開倫 雒秋江

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052)

煙酸屬于B族維生素,主要有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)2種形式[1-2]。這2種輔酶在機(jī)體中參與脂肪酸、碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝。反芻動(dòng)物飼糧中的碳水化合物經(jīng)過瘤胃微生物發(fā)酵降解為葡萄糖,葡萄糖進(jìn)一步生成丙酮酸。一方面,丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下通過“丙酮酸+還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)+氫離子(H+)?乳酸+氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)”反應(yīng)生成乳酸[3-4];另一方面,丙酮酸通過丙酮酸羧化酶進(jìn)一步生成草酰乙酸,再經(jīng)蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶作用下生成相對(duì)應(yīng)的蘋果酸和琥珀酸,最終生成丙酸,為機(jī)體提供能量[5-6]。在正常生理?xiàng)l件下,反芻動(dòng)物機(jī)體合成的煙酸可以滿足自身的需求,然而,在高精料飼糧條件下,反芻動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生乳酸,由于NAD+的缺乏,使反芻動(dòng)物對(duì)煙酸的需要量增加,動(dòng)物機(jī)體合成的煙酸不能滿足自身的需要量,煙酸的缺乏會(huì)導(dǎo)致反芻動(dòng)物瘤胃乳酸蓄積,造成瘤胃酸中毒[7-9]。

飼糧中精料比例過高,奶牛瘤胃內(nèi)D-乳酸濃度顯著增加[10]。煙酸作為NAD+的前體物質(zhì),參與丙酮酸與乳酸的相互轉(zhuǎn)化,在高精料飼糧條件下,外源性添加的煙酸提供的NAD+可以促使反應(yīng)向生成丙酮酸的方向進(jìn)行,減少乳酸的蓄積,緩解瘤胃酸中毒。已有研究表明,在高精料飼糧中添加800 mg/kg的煙酸可以顯著降低錦江牛瘤胃內(nèi)乳酸濃度,并且抑制乳酸脫氫酶(LDH)的活性[11];在高精料飼糧中添加煙酸能顯著降低黃牛瘤胃內(nèi)乳酸濃度[12]。目前,大多數(shù)研究主要集中在高精料飼糧中添加煙酸對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)乳酸濃度的影響,而對(duì)乳酸代謝相關(guān)酶及碳水化合物代謝途徑中間代謝產(chǎn)物的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬從NAD+的前體物質(zhì)煙酸的角度出發(fā),探究高精料飼糧條件下添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃內(nèi)乳酸代謝相關(guān)酶和能量代謝途徑中間代謝產(chǎn)物的影響,為煙酸在反芻動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重[(36.04±1.81) kg]、體況相近且健康的8月齡哈薩克公羊24只,試驗(yàn)前安裝好永久性瘤胃瘺管,隨機(jī)分為4組,每組6只。對(duì)照組飼喂精粗比為70∶30的基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在對(duì)照組飼糧的基礎(chǔ)上添加100、130和160 mg/d煙酸(煙酸購自上海源葉生物科技有限公司,分析純,純度≥99%)。試驗(yàn)期共18 d,其中預(yù)試期14 d,正試期4 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004),以日增重200 g營養(yǎng)需求的1.2倍水平進(jìn)行配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)綿羊采用單欄飼養(yǎng),試驗(yàn)前進(jìn)行統(tǒng)一驅(qū)蟲,對(duì)圈舍進(jìn)行消毒處理。每日分別于07:00和19:00進(jìn)行飼喂,每次飼喂量為當(dāng)日飼喂總量的1/2,自由采食,自由飲水,保持圈舍光照、干燥和通風(fēng)。

1.4 樣品采集

于正試期每天07:00飼喂前0 h以及飼喂后1、3、5 h采集血液樣品。使用肝素鈉抗凝管采集頸靜脈血樣9 mL,在4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min分離血清,分裝于1.5 mL的Eppendorf管中,-20 ℃冷凍保存。

于正試期每天07:00飼喂前0 h以及飼喂后1、3、5 h采集瘤胃液樣品。為了避免瘤胃液污染,丟棄前50 mL瘤胃液樣品,將采集的80 mL瘤胃液通過4層尼龍布過濾,分裝在凍存管中于-20 ℃冷凍保存。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸濃度的測定

丙酮酸(PA)、蘋果酸(MA)和琥珀酸(SA)濃度的測定參考張艷艷等[13]的方法,使用高效液相色譜儀(島津,日本)測定。取瘤胃液1 mL至離心管,靜置10 min后,12 000 r/min離心20 min;取500 μL上清至另一離心管,再加入500 μL10%三氯乙酸(TCA),靜置5 min后12 000 r/min離心10 min,取20 μL上機(jī)測定。測定條件:使用Shim-pack GISTC18-AQ色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長210 nm;一次線性洗脫;進(jìn)樣量20 μL。

1.5.2L-乳酸、D-乳酸濃度及乳酸代謝相關(guān)酶活性的測定

瘤胃液及血清中L-乳酸、D-乳酸濃度分別采用分光光度法和酶聯(lián)免疫吸附測定法進(jìn)行測定,瘤胃液中丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性與NADH、NAD+濃度采用分光光度法測定。以上指標(biāo)測定所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析程序進(jìn)行,多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果均以平均值表示,各組的變異程度用均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05表示差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中L-乳酸、D-乳酸濃度的影響

由表2可知,對(duì)于瘤胃液中L-乳酸濃度,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)Ⅱ組在飼喂后1 h時(shí)顯著降低(P<0.05);試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組在飼喂后3 h時(shí)極顯著降低(P<0.01),試驗(yàn)Ⅰ組在飼喂后3 h時(shí)顯著降低(P<0.05),同時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。對(duì)于瘤胃液中D-乳酸濃度,與對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組相比,試驗(yàn)Ⅱ組在飼喂后1 h時(shí)極顯著降低(P<0.01),試驗(yàn)Ⅱ組在飼喂后5 h時(shí)顯著降低(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)各組間瘤胃液中L-乳酸、D-乳酸濃度差異均不顯著(P>0.05)。

表2 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中L-乳酸、D-乳酸濃度的影響

2.2 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊血清中L-乳酸、D-乳酸濃度的影響

由表3可知,與對(duì)照組相比,在飼喂后3 h時(shí),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血清中L-乳酸濃度極顯著降低(P<0.01),血清中D-乳酸濃度顯著降低(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)各組間血清中L-乳酸、D-乳酸濃度差異均不顯著(P>0.05)。

表3 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊血清中L-乳酸、D-乳酸濃度的影響

2.3 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中NAD+、NADH濃度的影響

由表4可知,在飼喂后3 h時(shí),試驗(yàn)Ⅱ組瘤胃液中NAD+濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05);在飼喂后3h時(shí),對(duì)照組瘤胃液中NADH濃度極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01),顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)瘤胃液中NAD+、NADH濃度各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中NAD+、NADH濃度的影響

2.4 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性的影響

由表5可知,瘤胃液中乳酸脫氫酶活性,在飼喂后1 h時(shí)對(duì)照組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05),在飼喂后3 h時(shí)對(duì)照組極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組(P<0.05),在飼喂后5 h時(shí)對(duì)照組極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05);瘤胃液中丙酮酸激酶活性,在飼喂前0 h和飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05);瘤胃液中蘋果酸脫氫酶活性在飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01),顯著高于試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05);瘤胃液中琥珀酸脫氫酶活性,在飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05),在飼喂后3 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)瘤胃液中乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表5 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性的影響

2.5 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中丙酮酸、蘋果酸和琥珀酸濃度的影響

由表6可知,瘤胃液中丙酮酸濃度,在飼喂前0 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01);瘤胃液中蘋果酸濃度,在飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05);瘤胃液中琥珀酸濃度,在飼喂后1 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在飼喂后3 h時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)瘤胃液中丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸濃度各組間差異均不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液和血清中L-乳酸、D-乳酸濃度的影響

乳酸是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)碳水化合物代謝過程的中間代謝產(chǎn)物[14],瘤胃液中乳酸濃度的高低是衡量瘤胃功能是否正常的重要指標(biāo)。在高精料飼糧條件下發(fā)生瘤胃酸中毒時(shí),隨著乳酸的積累,瘤胃液中L-乳酸濃度較低,D-乳酸濃度逐漸升高[15],這是因?yàn)榱鑫竷?nèi)廣泛存在L-乳酸脫氫酶,L-乳酸脫氫酶催化L-乳酸通過丙烯酸途徑轉(zhuǎn)化為丙酸;而機(jī)體中缺乏D-乳酸脫氫酶,大量D-乳酸蓄積在瘤胃內(nèi),只有少量D-乳酸通過瘤胃上皮細(xì)胞經(jīng)過D-乳酸脫氫酶進(jìn)一步代謝出瘤胃,最終進(jìn)入血液[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在飼喂后1、3 h時(shí),各試驗(yàn)組瘤胃內(nèi)L-乳酸、D-乳酸濃度均低于對(duì)照組,其中試驗(yàn)Ⅱ組最低。這可能是因?yàn)樵囼?yàn)組飼糧添加煙酸后,煙酸作為NAD+的前體物質(zhì),提供大量的NAD+,使乳酸與丙酮酸的可逆反應(yīng)向生成丙酮酸方向進(jìn)行,減少乳酸的產(chǎn)生;另外,煙酸還可能促進(jìn)了瘤胃內(nèi)乳酸利用菌(埃氏巨型球菌和反芻獸新月單胞菌)的生長,維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的平衡,避免乳酸的蓄積。本試驗(yàn)結(jié)果與楊艷[11]的研究結(jié)果一致。血清中乳酸濃度的變化與瘤胃中乳酸濃度變化呈線性相關(guān),隨著瘤胃液中乳酸濃度的升高而升高;此外,血清中L-乳酸、D-乳酸濃度隨煙酸添加量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

3.2 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃液中NAD+、NADH濃度以及乳酸脫氫酶活性的影響

糖酵解的最終產(chǎn)物是丙酮酸。一般情況下,丙酮酸的去路主要有2條:一是丙烯酸途徑,另一個(gè)是琥珀酸途徑[17-19]。丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下還原為乳酸,乳酸在乳酰輔酶A、丙烯酰輔酶A以及丙酰輔酶A的作用下進(jìn)一步生成丙酸。乳酸脫氫酶活性是評(píng)價(jià)瘤胃產(chǎn)乳酸能力的重要指標(biāo)。在丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的代謝途徑中,NAD+能夠抑制乳酸脫氫酶的活性,從而抑制乳酸的生成。在本試驗(yàn)條件下,添加煙酸增加了瘤胃液中NAD+的濃度,降低了NADH的濃度,尤其是試驗(yàn)Ⅱ組,NAD+濃度上升最明顯,達(dá)到1.38 μmol/L,NADH濃度下降最明顯,降至0.90 μmol/L,而試驗(yàn)Ⅱ組瘤胃液中乳酸脫氫酶活性也是最低的,其活性為144.71 U/L,乳酸脫氫酶活性與NAD+濃度密切相關(guān),可能是對(duì)照組高精料飼糧消耗了過多的NAD+,乳酸脫氫酶活性急劇上升,乳酸濃度也驟然增加;而在高精料飼糧中添加煙酸后,瘤胃液中NAD+濃度迅速增加,抑制了乳酸脫氫酶的活性,乳酸濃度減少。本試驗(yàn)結(jié)果與楊艷[11]的研究結(jié)果一致。這一結(jié)果剛好驗(yàn)證了本試驗(yàn)上述研究結(jié)果,即添加煙酸后瘤胃液和血清中乳酸濃度降低。

3.3 高精料飼糧中添加煙酸對(duì)綿羊瘤胃丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸濃度及其相關(guān)酶活性的影響

琥珀酸途徑是反芻動(dòng)物碳水化合物代謝過程中的主要途徑之一,丙酮酸在丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶等酶的催化下生成對(duì)應(yīng)的草酰乙酸、蘋果酸和琥珀酸,最終生成丙酸[6]。蘋果酸是機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的重要有機(jī)酸,也是三羧酸循環(huán)代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,促進(jìn)乳酸利用菌的生長。有研究表明,在生成丙酸的代謝途徑中,蘋果酸可以彌補(bǔ)草酰乙酸的缺乏,刺激反芻獸新月形單胞菌對(duì)乳酸的利用[20]。飼糧中添加蘋果酸可顯著提高瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸中丙酸比例,降低乳酸濃度[21-24]。琥珀酸作為琥珀酸途徑中的另一中間代謝產(chǎn)物,對(duì)改善反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵有重要作用。有研究表明,在奶牛飼糧中添加琥珀酸,瘤胃液中乙酸和丙酸濃度顯著增加,丙酸濃度隨琥珀酸添加量的增加呈線性增加[25]。琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,其活性反映了有氧代謝能力。在本試驗(yàn)條件下,在高精料飼糧中添加煙酸增加了瘤胃液中丙酮酸、蘋果酸和琥珀酸的濃度,提高了瘤胃液中丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性,尤其是試驗(yàn)Ⅱ組。這表明煙酸對(duì)綿羊能量代謝有顯著影響,能增強(qiáng)有氧代謝能力,降低糖酵解代謝能力;另外,煙酸提供的NAD+會(huì)將乳酸持續(xù)轉(zhuǎn)化為丙酮酸,進(jìn)一步增加琥珀酸途徑中間代謝產(chǎn)物,繼續(xù)產(chǎn)生丙酸[26],為機(jī)體提供能量,這與Yu等[27]的研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

① 在本試驗(yàn)條件下,高精料飼糧中添加煙酸提高了綿羊瘤胃內(nèi)乳酸代謝途徑中丙酮酸、蘋果酸以及琥珀酸的濃度,并且降低了瘤胃液和血清中L-乳酸、D-乳酸濃度。

② 高精料飼糧中添加煙酸提高了綿羊瘤胃液中NAD+濃度以及丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶以及琥珀酸脫氫酶活性,降低了NADH濃度以及乳酸脫氫酶活性。

③ 綿羊高精料飼糧中煙酸的推薦添加量為130 mg/d。