張國(guó)華 呂思文 李亞南 邢思毅 張 備 王麗坤 薛沾枚 張 艷 李 燁 沈思思 張建勝 朱啟濤 鐘 鵬 史同瑞* 金振華*

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,齊齊哈爾 161005;2.齊齊哈爾市龍沙區(qū)農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì),齊齊哈爾 161005;3.山東信得科技股份有限公司,青島 266101;4.內(nèi)蒙古圣牧高科牧業(yè)有限公司,呼和浩特 010000)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又稱(chēng)藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)引起的,是一種可導(dǎo)致母豬出現(xiàn)流產(chǎn)等癥狀并且會(huì)導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病的傳染病,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展,降低養(yǎng)殖戶(hù)(場(chǎng))的經(jīng)濟(jì)效益[1]。1987年,PRRS首先由美國(guó)學(xué)者進(jìn)行報(bào)道,隨后在世界多地均有豬類(lèi)似疾病癥狀的報(bào)道,我國(guó)于1995年首次爆發(fā)這種疾病[2]。由于PRRS的傳染性高、病豬長(zhǎng)期帶毒、持續(xù)感染等特點(diǎn)導(dǎo)致該病難以根除,目前對(duì)于PRRS的防控主要以豬群臨床穩(wěn)定和控制繼發(fā)感染為主[3]。

在我國(guó)畜禽飼料全面禁抗的大環(huán)境下,毒副作用小、療效顯著、兼具藥效和營(yíng)養(yǎng)功能的中藥添加劑越來(lái)越受到人們的重視,多糖作為中藥的主要成分起到至關(guān)重要的作用[4]。香菇多糖其主要作用成分是從香菇子中提取的β-葡聚糖,生產(chǎn)應(yīng)用中具有營(yíng)養(yǎng)和藥物的雙重作用,其有效成分可增加動(dòng)物的免疫力,降低應(yīng)激反應(yīng),提高動(dòng)物的抗疾病能力[5]。研究顯示,香菇多糖在機(jī)體抗氧化、降低應(yīng)激反應(yīng)、抗菌、抗腫瘤等多個(gè)方面都表現(xiàn)出良好的效果,并且其作為一種免疫調(diào)節(jié)劑,可以有效地增加感染細(xì)胞的免疫能力,對(duì)于抑制病毒起到了一定的作用,尤其是對(duì)于流感病毒、腺病毒等具有很好的防控作用[6-8]。七清敗毒顆粒由黃芩、虎杖、苦參、白頭翁、板藍(lán)根、大青葉、綿馬貫眾7味中藥組成,其主要成分為黃芩苷,有研究顯示黃芪苷具有調(diào)整動(dòng)物機(jī)體代謝的功效,同時(shí)還可以起到控制病毒復(fù)制、殺滅病毒的作用,對(duì)PRRS具有很好的防控作用[9-10]。

集約化養(yǎng)殖環(huán)境下,為了追求生產(chǎn)效益,豬群高密度飼養(yǎng)且大量使用抗生素等藥物,豬群肝腎損傷嚴(yán)重,亞健康問(wèn)題普遍,仔豬帶毒情況突出。按照中獸醫(yī)辯證思維,正氣受損導(dǎo)致免疫力下降,邪氣轉(zhuǎn)盛導(dǎo)致病原侵入,豬群帶毒是豬群疾病高發(fā)的主要因素。扶正祛邪,增免排毒,是中獸醫(yī)防控疾病的思路。因此,本研究將香菇多糖和七清敗毒顆粒在某集團(tuán)化豬場(chǎng)進(jìn)行應(yīng)用,監(jiān)測(cè)應(yīng)用后對(duì)母豬繁殖性能、血清生化指標(biāo)、PRRSV抗體水平、仔豬臍帶血中PRRSV載量的影響,以期可以更好地了解香菇多糖等中藥添加劑對(duì)豬場(chǎng)母豬繁殖性能、血清生化指標(biāo)及PRRS的防控效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

香菇多糖:含有2.50%香菇多糖,0.15%低聚葡聚糖、0.10%低聚木糖、0.03%低聚半乳糖等。

七清敗毒顆粒:主要由黃芩、虎杖、苦參、白頭翁、板藍(lán)根、大青葉、綿馬貫眾組成,主要成分和含量為1.0%黃芩苷、0.1%大黃素、0.1%虎杖苷等。

主要試劑:HerdCheck PRRS X3抗體檢測(cè)試劑盒、RealPCR NA PRRS Type 1 and Type 2 Multiplex RNA TestPRRS試劑盒購(gòu)自愛(ài)德士生物科技有限公司。QIAamp?Viral RNA Mini Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)凱杰試劑有限公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、尿素(UN)等測(cè)定試劑盒購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

試驗(yàn)設(shè)備:全自動(dòng)生化分析儀(BS220,深圳邁瑞醫(yī)療器械有限公司)、酶標(biāo)儀(ST-360,科華儀器設(shè)備有限公司)、移液器(艾本德儀器設(shè)備有限公司)、熒光定量PCR儀(ABI7500,美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000,賽默飛儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動(dòng)物選自某集團(tuán)豬場(chǎng)的美系二元雜交母豬(豬場(chǎng)存在PRRS感染)。選取3～4胎次、體重為(268.00±33.59) kg的母豬100頭,隨機(jī)分為2組(每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭母豬),分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加2.5 g/(頭·d)香菇多糖+5.0 g/(頭·d)七清敗毒顆粒,試驗(yàn)期間每使用15 d,間隔15 d,試驗(yàn)期為90 d?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 母豬繁殖性能測(cè)定

試驗(yàn)期間記錄母豬繁殖數(shù)據(jù),包括窩均產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)、窩均死胎數(shù)、仔豬出生窩均重、仔豬斷奶窩均重,計(jì)算斷奶窩均增重、平均日增重,計(jì)算公式如下:

斷奶窩增重=仔豬斷奶窩重-仔豬初始窩重;平均日增重=(仔豬斷奶窩重-仔豬初始窩重)/30。

1.4 母豬血清生化指標(biāo)測(cè)定

在試驗(yàn)第0(試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天)、30和90天06:30,每組空腹采集每頭母豬靜脈血5 mL,4 000 r/min離心10 min得到血清。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(BS220)進(jìn)行血清生化指標(biāo)檢測(cè),所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,檢測(cè)項(xiàng)目包括血清ALT、AST活性及TBIL、UN含量。

1.5 母豬PRRSV抗體檢測(cè)

在試驗(yàn)第0、30、90天06:30,每組空腹采集每頭母豬靜脈血5 mL,4 000 r/min離心10 min得到血清。應(yīng)用ST360酶標(biāo)儀檢測(cè)PRRS抗體,所有操作嚴(yán)格按照HerdCheck PRRS X3抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)如下:當(dāng)S/P值<0.4判定為陰性結(jié)果,S/P值>0.4判定為陽(yáng)性結(jié)果。離散度根據(jù)檢測(cè)到的S/P值,用Excel 2019計(jì)算。

1.6 仔豬臍帶血PRRSV抗原檢測(cè)

試驗(yàn)?zāi)肛i產(chǎn)仔后,隨機(jī)抽取試驗(yàn)組仔豬臍帶血10份,對(duì)照組仔豬臍帶血10份,試劑盒提取RNA后Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度,將RNA樣本稀釋至2 ng/mL,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用熒光定量PCR儀(ABI7500)檢測(cè)仔豬臍帶血PRRSV抗原載體情況,所有操作程序嚴(yán)格按照PRRS抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)如下:當(dāng)FAM通道Ct值<38且陰性對(duì)照無(wú)信號(hào),VIC通路有信號(hào)時(shí)判定為感染歐洲型PRRS;當(dāng)Cy5通道Ct值<38且陰性對(duì)照無(wú)信號(hào),VIC通路有信號(hào)時(shí)判定為感染美洲型PRRS;當(dāng)FAM通道、Cy5通道、VIC通路均無(wú)信號(hào)時(shí)判定為無(wú)效結(jié)果,需要重新進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2019進(jìn)行記錄,采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異差異性采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05視為差異顯著,P<0.01視為差異極顯著,P>0.05則視為不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬繁殖性能的影響

如表2所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組窩均產(chǎn)仔數(shù)極顯著提高了4.77%(P<0.01),窩均活仔數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05),窩均死胎數(shù)極顯著降低了34.51%(P<0.01);試驗(yàn)組仔豬出生窩均重?zé)o顯著差異(P>0.05),仔豬斷奶窩均重極顯著提高了6.56%(P<0.01),斷奶窩均增重極顯著提高了6.35%(P<0.01),平均日增重極顯著提高了6.41%(P<0.01)。

表2 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬繁殖性能的影響

2.2 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬血清生化指標(biāo)的影響

如表3所示,第0天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組血清ALT、AST活性及TBIL、UN含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。第30天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組血清AST活性顯著降低了13.22%(P<0.05),血清ALT活性及TBIL、UN含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。第90天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組血清ALT活性顯著降低了17.51%(P<0.05),血清AST活性顯著降低了17.08%(P<0.05),血清TBIL含量顯著降低了22.22%(P<0.05),血清UN含量極顯著降低了42.09%(P<0.01)。

表3 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

如表4所示,第0天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組的S/P均值無(wú)顯著差異(P>0.05);對(duì)照組離散度為35.90%,試驗(yàn)組離散度為37.60%。第30天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組的S/P均值極顯著降低了23.11%(P<0.01);對(duì)照組離散度為40.94%,試驗(yàn)組離散度為28.64%。第90天,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組的S/P均值極顯著降低了23.57%(P<0.01);對(duì)照組離散度為55.90%,試驗(yàn)組離散度為32.90%。

表4 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

續(xù)表4時(shí)間 Time項(xiàng)目Items對(duì)照組Control group 試驗(yàn)組Test groupP值P-value離散度 Dispersion/%40.9428.64S/P≥2.5204第90天0.4≤S/P<2.58096Day 90S/P<0.400S/P均值 Mean value of S/P1.57±0.72a1.20±0.46b0.017 7離散度 Dispersion/%55.9032.90

2.4 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)仔豬臍帶血PRRS抗原檢測(cè)的影響

如圖1、表5所示,對(duì)照組仔豬臍帶血PRRS抗原檢測(cè)結(jié)果1號(hào)樣本Cy5通道的Ct值為27.45,3號(hào)樣本Cy5通道的Ct值為32.19,其余樣本未檢測(cè)到Ct值,仔豬臍帶血PRRS抗原陽(yáng)性率為10%。試驗(yàn)組仔豬臍帶血PRRS抗原檢測(cè)未檢測(cè)到Ct值,抗原陽(yáng)性率為0。

ΔRn為PCR產(chǎn)物量;Cycle為反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

3 討 論

3.1 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬繁殖性能的影響

母豬繁殖性能受到飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)、疾病、環(huán)境等因素的影響。其中營(yíng)養(yǎng)水平和疾病對(duì)母豬的繁殖性能起到了十分重要的影響。仔豬在斷奶前的生長(zhǎng)狀態(tài)與母豬分泌乳汁的情況、環(huán)境以及自身免疫力有著很大的影響。毛湘冰等[11]報(bào)道,在飼糧中添加香菇多糖可以有效提高斷奶大鼠的生產(chǎn)性能、抗氧化能力以及改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)以及菌群結(jié)構(gòu)。胡海燕[12]報(bào)道,飼糧中添加香菇多糖對(duì)攻毒輪狀病毒的仔豬具有提高生長(zhǎng)性能、增加免疫力等作用。Mao等[13]報(bào)道,在飼糧中添加香菇多糖可以改善仔豬的腸道菌群結(jié)構(gòu),增加短鏈脂肪酸的合成,減少感染輪狀病毒仔豬腹瀉。香菇多糖應(yīng)用于仔豬可以有效地提升血清葡萄糖含量,降低血清尿素的含量,說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)狀況和蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物情況良好,可提高仔豬的生長(zhǎng)性能[14]。本研究結(jié)果顯示,將香菇多糖和七清敗毒顆粒添加至飼糧中可以提高窩均產(chǎn)子數(shù)、窩均活子數(shù),降低窩均死胎數(shù),并且可以提高仔豬的平均日增重,與之前的報(bào)道結(jié)果相符,說(shuō)明在飼糧中添加香菇多糖和七清敗毒顆?？梢杂行У靥岣吣肛i的繁殖性能。

3.2 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可以對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝情況以及身體健康狀況起到指示的作用,其中ALT、AST活性及TBIL、UN含量可以在一定程度上反映動(dòng)物的肝腎功能。當(dāng)動(dòng)物肝腎功能受到損傷的時(shí)候,這幾項(xiàng)指標(biāo)可能會(huì)出現(xiàn)快速上升。李建房等[15]研究顯示,應(yīng)用甘草多糖16 d后仔豬的血清堿性磷酸酶(ALP)活性、肌酐(CRE)含量顯著降低。單舒萱等[16]將蒲公英多糖飼喂肉雞,觀察到血清ALP活性及UN、CRE含量極顯著降低。盤(pán)道興等[17]將三七渣飼喂文山牛,觀察到試驗(yàn)組的血清生化指標(biāo)如AST、ALP、乳酸脫氫酶(LDH)活性顯著低于對(duì)照組。這說(shuō)明中藥類(lèi)物質(zhì)可以影響動(dòng)物的部分血清生化指標(biāo),與本研究的結(jié)果相一致。本研究中,第30天,試驗(yàn)組血清AST活性顯著低于對(duì)照組,第90天,試驗(yàn)組血清ALT、AST活性及TBIL、UN含量均顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明試驗(yàn)組在應(yīng)用香菇多糖和七清敗毒顆粒一段時(shí)間后可以對(duì)母豬的部分血清生化指標(biāo)起到調(diào)節(jié)的作用。

表5 仔豬臍帶血PRRSV抗原檢測(cè)結(jié)果(Ct值)

3.3 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)母豬PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

母豬PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)抗體陽(yáng)性率S/P均值、離散度進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)S/P大于2.5時(shí)為抗體強(qiáng)陽(yáng)性,提示可能已經(jīng)感染PRRSV,S/P均值小于2.0,抗體水平相對(duì)整齊,離散度較低時(shí)說(shuō)明豬群的整體健康狀況較好。中藥制劑在營(yíng)養(yǎng)和藥物作用下對(duì)PRRS的預(yù)防和治療起到了重要的作用[18]。繆世東[19]研究表明,七清敗毒顆粒的應(yīng)用可以有效提高存在PRRS感染的養(yǎng)殖場(chǎng)PRRS抗體均勻度,并且可以有效地降低PRRS的發(fā)生,體外試驗(yàn)表明,七清敗毒顆粒主要以直接滅活病毒和阻斷病毒吸附、穿入細(xì)胞的方式起到抗PRRSV的作用。陳曉蘭等[20]研究表明,中藥多糖飼喂蛋雞聯(lián)合PRRS疫苗進(jìn)行免疫,使體內(nèi)B細(xì)胞通過(guò)對(duì)抗原的識(shí)別、活化、增殖,最后分化成漿細(xì)胞并分泌抗體,抗體進(jìn)入血液循環(huán)從輸卵管上皮層分泌濾泡至卵黃內(nèi),從而獲得的卵黃抗體效價(jià)更好。陳天澤[21]研究表明,將板藍(lán)根應(yīng)用于抗體強(qiáng)陽(yáng)性的后備母豬可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)提高免疫細(xì)胞數(shù)量與活性等功能,有效地降低S/P均值,減少陽(yáng)性比值。本研究將香菇多糖和七清敗毒顆粒和母豬PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果相關(guān)聯(lián),在第90天后,試驗(yàn)組S/P均值大于2.5的占比由20%降至4%,S/P均值由1.77降至1.20,離散度由37.6%降至32.9%,抗體的波峰呈正態(tài)分布,說(shuō)明應(yīng)用香菇多糖和七清敗毒顆粒后豬群PRRSV抗體的整體穩(wěn)定性有所提高。PRRSV抗體檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性的豬下降明顯,說(shuō)明應(yīng)用香菇多糖和七清敗毒顆?？梢杂行У馗纳曝i的健康狀況,提高母豬利用率,減少母豬的淘汰。

3.4 香菇多糖和七清敗毒顆粒對(duì)仔豬臍帶血PRRS抗原檢測(cè)的影響

采集臍帶血具有操作方便、不易產(chǎn)生應(yīng)激、經(jīng)濟(jì)損失小的優(yōu)點(diǎn)。患病動(dòng)物的臍帶血中含有母體的病原體,可以對(duì)相關(guān)的疾病進(jìn)行預(yù)測(cè)和監(jiān)控,PRRSV作為一種重要的垂直傳播病毒,檢測(cè)仔豬臍帶血可以在一定程度上反映出母豬PRRSV感染情況,也為仔豬PRRS的防控和凈化提供了更多的科學(xué)依據(jù)[22]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)多種豬傳染病病原,如豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、PRRSV等,通過(guò)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)仔豬臍帶血中的PRRSV可以更準(zhǔn)確地對(duì)仔豬是否載有PRRSV進(jìn)行檢測(cè),其準(zhǔn)確度和靈敏度都高于普通PCR[23-24]。李晨[10]研究表明,七清敗毒顆粒可以降低肺組織PRRSV載量,通過(guò)抑制PRRSV在體內(nèi)的復(fù)制減輕肺臟損傷。袁小陵等[25]研究表明,七清敗毒顆粒免疫增效劑和功能性保肝劑,所含的黃芩、虎杖、白頭翁等具有燥濕止痢、抗菌殺毒、健脾開(kāi)胃的功能,雞飼喂0.23 g/(只·d)七清敗毒顆?？梢詫?duì)新城疫F48E9株具有很好的防控作用。本次檢測(cè)使用的PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒可對(duì)美洲型以及歐洲型進(jìn)行區(qū)分,我們可以針對(duì)檢測(cè)結(jié)果對(duì)該集團(tuán)化豬場(chǎng)PRRS進(jìn)行更好的免疫,提高豬群的PRRS免疫力。本研究中,試驗(yàn)仔豬臍帶血試驗(yàn)組PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR抗原檢出率為0,對(duì)照組檢出率為10%,且對(duì)照組檢出的陽(yáng)性樣本均為美洲型,說(shuō)明該集團(tuán)化豬場(chǎng)存在PRRSV美洲型的感染,需要進(jìn)行有效的防控,通過(guò)應(yīng)用香菇多糖和七清敗毒顆?？梢杂行У亟档妥胸i臍帶血PRRSV陽(yáng)性率,降低經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié) 論

妊娠母豬飼糧中添加香菇多糖和七清敗毒顆粒可以有效提高母豬的繁殖性能,顯著降低血清ALT、AST活性及TBIL、UN含量,降低豬群PRRSV抗體S/P均值,降低仔豬PRRSV攜帶率,在提高豬群生產(chǎn)成績(jī)、防控PRRS方面有著重要意義。