任文義 程雨辰 何金童 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,銀川 750021)

青貯飼料在收割、制作及使用過(guò)程中易受霉菌毒素的污染,對(duì)動(dòng)物和人類健康帶來(lái)很大危害,已經(jīng)成為行業(yè)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種具有高度生物技術(shù)意義的革蘭氏陽(yáng)性內(nèi)生孢子菌,具有許多潛在的用途,包括生產(chǎn)生物活性化合物(多糖類物質(zhì)、酶類活性物質(zhì)、脂肽類生物表面活性劑、桿菌肽以及小分子活性物質(zhì)等),這些化合物被應(yīng)用于廣泛的領(lǐng)域,如水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)、食品、生物醫(yī)學(xué)和制藥業(yè)[1-5]。由于新型基因操作工具的可行性,地衣芽孢桿菌作為生產(chǎn)酶和其他生物產(chǎn)品的表達(dá)載體也越來(lái)越受到關(guān)注[6]。此外,除了作為益生菌,對(duì)地衣芽孢桿菌的生物技術(shù)應(yīng)用還包括生物絮凝、生物礦化和抗生物膜活性等[7-9]。研究表明,飼喂經(jīng)地衣芽孢桿菌處理青貯飼料的動(dòng)物產(chǎn)品對(duì)人類和環(huán)境安全[10]。地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性,能促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的降解,使動(dòng)物更充分地吸收和利用飼料。此外,地衣芽孢桿菌具有很強(qiáng)的降解纖維的能力,可顯著提高飼料中中性洗滌纖維(NDF)和淀粉的消化率,進(jìn)而提高飼料利用率[11-12]。目前,地衣芽孢桿菌在青貯飼料中應(yīng)用的研究較少,其對(duì)青貯飼料的影響有待進(jìn)一步研究?；诖?本文將主要介紹地衣芽孢桿菌改善青貯發(fā)酵、抑制微生物腐敗和霉菌毒素產(chǎn)生的潛在途徑,以期為地衣芽孢桿菌在青貯發(fā)酵中的合理利用提供參考依據(jù)。

1 地衣芽孢桿菌的生理學(xué)功能及其在青貯發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用潛力

青貯的主要原理是通過(guò)乳酸菌厭氧發(fā)酵快速達(dá)到低pH和維持厭氧條件。青貯過(guò)程可分為好氧階段、發(fā)酵階段、穩(wěn)定階段和飼喂階段(圖1)。好氧階段植物細(xì)胞和需氧(兼性)微生物的呼吸活動(dòng)會(huì)使青貯環(huán)境中的氧氣迅速減少;發(fā)酵階段開始時(shí)已是厭氧環(huán)境,不同種類的微生物(乳酸菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌和酵母菌)能夠厭氧生長(zhǎng),競(jìng)爭(zhēng)可用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在保存良好的青貯飼料中,乳酸菌迅速主導(dǎo)發(fā)酵,乳酸的積累以及在較小程度上由糖(主要是葡萄糖、果糖和蔗糖)形成的乙酸的積累而導(dǎo)致pH降低;穩(wěn)定階段存活的微生物數(shù)量開始減少,一些耐酸微生物(如一些酵母菌)在此期間幾乎處于非活性狀態(tài),其他微生物(如梭菌和桿菌)以孢子形式存活;飼喂階段在青貯飼料暴露于空氣時(shí)開始,青貯窖打開后暴露在空氣中是不可避免的,此時(shí)極易由耐酸酵母菌引起有氧變質(zhì)。

圖1 青貯發(fā)酵階段圖

1.1 地衣芽孢桿菌的無(wú)氧代謝

地衣芽孢桿菌作為兼性厭氧菌,可以通過(guò)感知環(huán)境中氧濃度來(lái)改變細(xì)胞代謝,其分泌的地衣素在有氧狀態(tài)下能迅速消耗環(huán)境中的游離氧,產(chǎn)生強(qiáng)大的生物奪氧作用,快速創(chuàng)造厭氧環(huán)境[13]。在好氧微生物的有氧呼吸中,氧氣通常作為電子傳遞鏈的最終受體。地衣芽孢桿菌盡管喜歡有氧生長(zhǎng),但其在厭氧條件下也能顯示出很強(qiáng)的適應(yīng)性[14]。厭氧呼吸過(guò)程中,硝酸鹽或亞硝酸鹽都可以作為地衣芽孢桿菌的電子受體[15-16],許多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,如ArcR、Fnr,參與調(diào)控厭氧呼吸的關(guān)鍵途徑[17-18]。地衣芽孢桿菌在厭氧環(huán)境中表現(xiàn)出較好適應(yīng)性的原因可能是由于其基因組中存在編碼非氧依賴性核糖核苷酸還原酶的基因,該酶可將核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸(DNA合成所需的前體)。此外,地衣芽孢桿菌具有很強(qiáng)的通過(guò)一氧化氮還原酶途徑進(jìn)行無(wú)氧呼吸的能力。Shariat等[19]發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可利用葡萄糖在厭氧發(fā)酵下生成乙酸、2,3-丁二醇、乙醇、甲酸、乳酸、琥珀酸和丙酮酸等代謝產(chǎn)物;當(dāng)硝酸鹽存在時(shí),地衣芽孢桿菌可利用葡萄糖在厭氧發(fā)酵下主要生成乙酸,也可以誘導(dǎo)甲酸鹽-硝酸鹽氧化還原酶系統(tǒng)生成甲酸,并且在加入硝酸鹽時(shí)活性增加。然而,在有氧條件下,地衣芽孢桿菌沒(méi)有這種活性。地衣芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中,乙酸、乙醇、乳酸和甲酸都可以改善青貯飼料的質(zhì)量和有氧穩(wěn)定性,2,3-丁二醇和琥珀酸不僅是發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味成分,而且琥珀酸對(duì)人體健康有許多益處[20-23]。

1.2 地衣芽孢桿菌的反硝化能力

1.3 地衣芽孢桿菌的功能酶和胞外多糖

酶制劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用已經(jīng)得到普及,可以提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率,同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的不利影響[32-33]。研究表明,地衣芽孢桿菌可以提高植酸酶活性,植酸酶可以有效降解植酸,進(jìn)而釋放被螯合的金屬元素,改善礦物元素的生物利用率[34]。地衣芽孢桿菌能夠生產(chǎn)非常廣泛的酶,例如桿菌肽和地衣素,能夠在食品制造等行業(yè)中充分發(fā)揮其生物催化功能。地衣芽孢桿菌的分泌組涉及大量不同化合物,包括脂質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì),因此可以產(chǎn)生極高數(shù)量的不同酶。地衣芽孢桿菌是嗜熱細(xì)菌,其生產(chǎn)的α-淀粉酶通常比從其他微生物(包括芽孢桿菌屬其他物種)獲得的α-淀粉酶更耐熱,適宜溫度范圍在50～100 ℃[35-36]。其他從地衣芽孢桿菌獲得酶,如β-葡萄糖苷酶、幾丁質(zhì)酶、內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶,不僅具有高溫穩(wěn)定性,而且具有寬范圍的pH耐受性,并且與地衣芽孢桿菌的來(lái)源無(wú)關(guān)[37-40]。Han等[41]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌能顯著提高肉雞空腸和回腸中α-淀粉酶、麥芽糖酶和蔗糖酶活性。地衣芽孢桿菌在腸道上部能迅速?gòu)?fù)活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶,有助于降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物,同時(shí)通過(guò)生物奪氧機(jī)制消耗腸道內(nèi)氧氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境,有利于減少有害微生物數(shù)量,進(jìn)而維持腸道生態(tài)平衡[42]。

細(xì)菌胞外聚合物是細(xì)菌響應(yīng)外界環(huán)境的刺激而合成并分泌到胞外的大分子物質(zhì),對(duì)細(xì)胞具有重要的生理意義。地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的分泌胞外多糖的能力,eps基因簇是其參與胞外多糖合成的重要功能基因,其中epsK基因編碼的蛋白EpsK作為一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胞外聚合物的合成和分泌中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[43]。陳震[44]發(fā)現(xiàn),epsDEF基因簇的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)地衣芽抱桿菌在穩(wěn)定期胞外多糖的積累,同時(shí)發(fā)現(xiàn)gtaB-2基因?yàn)榈匾卵挎邨U菌合成胞外多糖的關(guān)鍵基因,其過(guò)表達(dá)可有效促進(jìn)地衣芽孢桿菌胞外多糖的合成。Petrova等[45]在地衣芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)一種由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成的胞外多糖,具有良好的抗氧化和抗菌活性。Abinaya等[4]分離純化的地衣芽孢桿菌的胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力,且對(duì)革蘭氏陰性菌具有很強(qiáng)的抗菌活性和抗生物被膜活性。地衣芽孢桿菌合成的胞外多糖具有多種調(diào)控因子,細(xì)胞通過(guò)對(duì)這些調(diào)控因子的控制來(lái)協(xié)調(diào)不同種類聚合物的合成,進(jìn)而響應(yīng)外界條件變化。因此,增加對(duì)地衣芽孢桿菌及其產(chǎn)生的胞外多糖生物聚合物能力的研究具有重要意義,胞外多糖的合成代謝機(jī)制及生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步深入研究。

2 地衣芽孢桿菌的抗真菌作用和霉菌毒素解毒能力

反芻動(dòng)物被認(rèn)為對(duì)霉菌毒素較不敏感,主要是因?yàn)榱鑫肝⑸锶壕哂薪到饽承┟咕舅氐哪芰?。然?Gallo等[46]通過(guò)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)評(píng)估霉菌毒素在瘤胃環(huán)境中的穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著霉菌毒素濃度的增加,產(chǎn)氣量呈線性下降,總揮發(fā)性脂肪酸濃度呈二次方下降。有學(xué)者指出,霉菌毒素不僅對(duì)牛腸道健康造成潛在負(fù)面影響[47],還會(huì)影響奶牛血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性和總抗氧化能力[48]。例如,飼喂含有霉變玉米粉和棉籽的飼糧能夠會(huì)奶牛采食量、產(chǎn)奶量以及乳脂、乳蛋白和乳糖的產(chǎn)量[49]。Rocchetti等[50]報(bào)道,奶牛食用黃曲霉毒素污染的玉米青貯后,牛乳樣品中氧化型谷胱甘肽含量顯著積累,易導(dǎo)致機(jī)體氧化/抗氧化失衡。除此之外,為保證奶牛高產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)需要,通常飼喂大量精料,這往往會(huì)造成瘤胃環(huán)境的酸化,減弱瘤胃微生物的解毒作用,使反芻動(dòng)物對(duì)霉菌毒素更加敏感[51]。即使飼糧中黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度很低,也可能導(dǎo)致基因毒性致癌物代謝物黃曲霉毒素M1(AFM1)從乳汁中排出,對(duì)人健康構(gòu)成潛在威脅[52]。

2.1 地衣芽孢桿菌的抗真菌作用

地衣芽孢桿菌能夠分泌多種抗菌物質(zhì),具有抑制真菌的作用[53]。地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種酶,具有病原真菌廣譜抗性。李婭楠[54]發(fā)現(xiàn),添加地衣芽孢桿菌會(huì)改變微貯稻草中細(xì)菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu),尤其是腐敗菌和曲霉菌的豐度。Gong等[55]發(fā)現(xiàn),茶樹根系土壤中的芽孢桿菌TR-1具有廣譜抗真菌活性。Ling等[56]從地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中分理出具有抗真菌的絲氨酸蛋白酶成分,可以抑制辣椒疫霉、立枯絲核菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和灰霉菌的生長(zhǎng)。地衣芽孢桿菌還具有產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力,幾丁質(zhì)是植物病原真菌細(xì)胞壁以及節(jié)肢動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和線蟲外骨骼的基本化合物。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以降解真菌細(xì)胞壁,破壞尖孢鐮刀菌的活性[57],還可以通過(guò)菌絲腫脹和球狀結(jié)構(gòu)的改變抑制真菌植物病原菌[58-59]。Arbsuwan等[60]從木瓜中分離出的地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)生細(xì)胞外抗菌物質(zhì),對(duì)重要的動(dòng)植物病原體和腐敗微生物具有抑制作用。Ul Hassan等[61]發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機(jī)化合物,其中3-甲基-1-丁醇是含量最高的化合物,這些化合物具有廣泛的生物活性,對(duì)曲霉和青霉的產(chǎn)毒菌株具有拮抗作用,適合作為抗真菌毒素的生物防治劑。

2.2 地衣芽孢桿菌的霉菌毒素解毒能力

物理和化學(xué)方法已廣泛用于去除霉菌毒素,但這些方法可能降低飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和感官特性。霉菌毒素的微生物轉(zhuǎn)化法與物理和化學(xué)方法相比,具有更高的特異性和環(huán)境友好性,是一種很有前途的霉菌毒素脫毒方法。地衣芽孢桿菌基因組序列中存在參與CotA漆酶生成的相關(guān)基因,可有效降解霉菌毒素。地衣芽孢桿菌中CotA漆酶不僅能夠有效氧化AFB1,并將其分解為無(wú)毒產(chǎn)物黃曲霉毒素Q1(AFQ1)及其差向異構(gòu)體(epiAFQ1),還可以有效降解玉米赤霉烯酮和鏈格孢霉毒素,錳離子(Mn2+)和銅離子(Cu2+)誘導(dǎo)和氧化還原介質(zhì)可以增強(qiáng)CotA漆酶對(duì)玉米赤霉烯酮的降解能力[62-65]。Raksha等[66]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可以減少94.7%的AFB1,并且可以喪失AFB1的致突變作用。地衣芽孢桿菌具有開發(fā)成飼料添加劑用于去除玉米赤霉烯酮的巨大潛力,在受玉米赤霉烯酮污染的玉米粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后,地衣芽孢桿菌減少了98%以上的玉米赤霉烯酮。Wang等[67]從發(fā)霉的土壤樣品中分離并鑒定了具有強(qiáng)大的嘔吐毒素解毒能力的地衣芽孢桿菌菌株,可以在37 ℃條件下48 h內(nèi)降解1 mg/L嘔吐毒素的82.67%以上,并且在模擬胃液中具有很強(qiáng)的存活率和嘔吐毒素降解率,還修復(fù)了嘔吐毒素引起的腸道菌群失調(diào)。綜上可知,地衣芽孢桿菌可能是在飼料青貯過(guò)程中對(duì)霉菌毒素進(jìn)行生物修復(fù)和解毒的一個(gè)理想選擇。

3 小結(jié)與展望

地衣芽孢桿菌能夠加速青貯發(fā)酵進(jìn)程,分泌生物酶等物質(zhì)改變有害菌生物膜表面結(jié)構(gòu),破壞霉菌生長(zhǎng)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),提高有害菌的抗生素敏感性,從而起到抑菌作用。目前,地衣芽孢桿菌由于缺乏生產(chǎn)數(shù)據(jù)在青貯發(fā)酵中尚未推廣使用。未來(lái),需要進(jìn)一步深入研究地衣芽孢桿菌的作用機(jī)制和關(guān)鍵基因,以更好地應(yīng)用于青貯飼料生產(chǎn)中。此外,開展對(duì)地衣芽孢桿菌品種和菌株的篩選和優(yōu)化工作,選擇具有較高生物活性和適應(yīng)性的菌株用于實(shí)際生產(chǎn)。同時(shí),還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)地衣芽孢桿菌與其他微生物的相互作用的研究,以最大限度地發(fā)揮其在青貯飼料中的效果。綜合而言,地衣芽孢桿菌在青貯飼料領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊,并有望為畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出積極貢獻(xiàn)。