任文義 程雨辰 何金童 徐曉鋒

(寧夏大學動物科技學院,銀川 750021)

青貯飼料在收割、制作及使用過程中易受霉菌毒素的污染,對動物和人類健康帶來很大危害,已經成為行業(yè)研究的一個熱點。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種具有高度生物技術意義的革蘭氏陽性內生孢子菌,具有許多潛在的用途,包括生產生物活性化合物(多糖類物質、酶類活性物質、脂肽類生物表面活性劑、桿菌肽以及小分子活性物質等),這些化合物被應用于廣泛的領域,如水產養(yǎng)殖、農業(yè)、食品、生物醫(yī)學和制藥業(yè)[1-5]。由于新型基因操作工具的可行性,地衣芽孢桿菌作為生產酶和其他生物產品的表達載體也越來越受到關注[6]。此外,除了作為益生菌,對地衣芽孢桿菌的生物技術應用還包括生物絮凝、生物礦化和抗生物膜活性等[7-9]。研究表明,飼喂經地衣芽孢桿菌處理青貯飼料的動物產品對人類和環(huán)境安全[10]。地衣芽孢桿菌具有較強的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性,能促進飼料中營養(yǎng)成分的降解,使動物更充分地吸收和利用飼料。此外,地衣芽孢桿菌具有很強的降解纖維的能力,可顯著提高飼料中中性洗滌纖維(NDF)和淀粉的消化率,進而提高飼料利用率[11-12]。目前,地衣芽孢桿菌在青貯飼料中應用的研究較少,其對青貯飼料的影響有待進一步研究?；诖?本文將主要介紹地衣芽孢桿菌改善青貯發(fā)酵、抑制微生物腐敗和霉菌毒素產生的潛在途徑,以期為地衣芽孢桿菌在青貯發(fā)酵中的合理利用提供參考依據。

1 地衣芽孢桿菌的生理學功能及其在青貯發(fā)酵過程中的應用潛力

青貯的主要原理是通過乳酸菌厭氧發(fā)酵快速達到低pH和維持厭氧條件。青貯過程可分為好氧階段、發(fā)酵階段、穩(wěn)定階段和飼喂階段(圖1)。好氧階段植物細胞和需氧(兼性)微生物的呼吸活動會使青貯環(huán)境中的氧氣迅速減少;發(fā)酵階段開始時已是厭氧環(huán)境,不同種類的微生物(乳酸菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌和酵母菌)能夠厭氧生長,競爭可用的營養(yǎng)物質,在保存良好的青貯飼料中,乳酸菌迅速主導發(fā)酵,乳酸的積累以及在較小程度上由糖(主要是葡萄糖、果糖和蔗糖)形成的乙酸的積累而導致pH降低;穩(wěn)定階段存活的微生物數量開始減少,一些耐酸微生物(如一些酵母菌)在此期間幾乎處于非活性狀態(tài),其他微生物(如梭菌和桿菌)以孢子形式存活;飼喂階段在青貯飼料暴露于空氣時開始,青貯窖打開后暴露在空氣中是不可避免的,此時極易由耐酸酵母菌引起有氧變質。

圖1 青貯發(fā)酵階段圖

1.1 地衣芽孢桿菌的無氧代謝

地衣芽孢桿菌作為兼性厭氧菌,可以通過感知環(huán)境中氧濃度來改變細胞代謝,其分泌的地衣素在有氧狀態(tài)下能迅速消耗環(huán)境中的游離氧,產生強大的生物奪氧作用,快速創(chuàng)造厭氧環(huán)境[13]。在好氧微生物的有氧呼吸中,氧氣通常作為電子傳遞鏈的最終受體。地衣芽孢桿菌盡管喜歡有氧生長,但其在厭氧條件下也能顯示出很強的適應性[14]。厭氧呼吸過程中,硝酸鹽或亞硝酸鹽都可以作為地衣芽孢桿菌的電子受體[15-16],許多關鍵的轉錄因子,如ArcR、Fnr,參與調控厭氧呼吸的關鍵途徑[17-18]。地衣芽孢桿菌在厭氧環(huán)境中表現(xiàn)出較好適應性的原因可能是由于其基因組中存在編碼非氧依賴性核糖核苷酸還原酶的基因,該酶可將核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸(DNA合成所需的前體)。此外,地衣芽孢桿菌具有很強的通過一氧化氮還原酶途徑進行無氧呼吸的能力。Shariat等[19]發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可利用葡萄糖在厭氧發(fā)酵下生成乙酸、2,3-丁二醇、乙醇、甲酸、乳酸、琥珀酸和丙酮酸等代謝產物;當硝酸鹽存在時,地衣芽孢桿菌可利用葡萄糖在厭氧發(fā)酵下主要生成乙酸,也可以誘導甲酸鹽-硝酸鹽氧化還原酶系統(tǒng)生成甲酸,并且在加入硝酸鹽時活性增加。然而,在有氧條件下,地衣芽孢桿菌沒有這種活性。地衣芽孢桿菌的代謝產物中,乙酸、乙醇、乳酸和甲酸都可以改善青貯飼料的質量和有氧穩(wěn)定性,2,3-丁二醇和琥珀酸不僅是發(fā)酵產品的風味成分,而且琥珀酸對人體健康有許多益處[20-23]。

1.2 地衣芽孢桿菌的反硝化能力

1.3 地衣芽孢桿菌的功能酶和胞外多糖

酶制劑在動物飼料中的應用已經得到普及,可以提高營養(yǎng)物質的消化率,同時減少對環(huán)境的不利影響[32-33]。研究表明,地衣芽孢桿菌可以提高植酸酶活性,植酸酶可以有效降解植酸,進而釋放被螯合的金屬元素,改善礦物元素的生物利用率[34]。地衣芽孢桿菌能夠生產非常廣泛的酶,例如桿菌肽和地衣素,能夠在食品制造等行業(yè)中充分發(fā)揮其生物催化功能。地衣芽孢桿菌的分泌組涉及大量不同化合物,包括脂質、多糖、蛋白質和其他物質,因此可以產生極高數量的不同酶。地衣芽孢桿菌是嗜熱細菌,其生產的α-淀粉酶通常比從其他微生物(包括芽孢桿菌屬其他物種)獲得的α-淀粉酶更耐熱,適宜溫度范圍在50～100 ℃[35-36]。其他從地衣芽孢桿菌獲得酶,如β-葡萄糖苷酶、幾丁質酶、內切葡聚糖酶和木聚糖酶,不僅具有高溫穩(wěn)定性,而且具有寬范圍的pH耐受性,并且與地衣芽孢桿菌的來源無關[37-40]。Han等[41]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌能顯著提高肉雞空腸和回腸中α-淀粉酶、麥芽糖酶和蔗糖酶活性。地衣芽孢桿菌在腸道上部能迅速復活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶,有助于降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物,同時通過生物奪氧機制消耗腸道內氧氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境,有利于減少有害微生物數量,進而維持腸道生態(tài)平衡[42]。

細菌胞外聚合物是細菌響應外界環(huán)境的刺激而合成并分泌到胞外的大分子物質,對細胞具有重要的生理意義。地衣芽孢桿菌具有較強的分泌胞外多糖的能力,eps基因簇是其參與胞外多糖合成的重要功能基因,其中epsK基因編碼的蛋白EpsK作為一種跨膜轉運蛋白在胞外聚合物的合成和分泌中起到關鍵調控作用[43]。陳震[44]發(fā)現(xiàn),epsDEF基因簇的過表達可以促進地衣芽抱桿菌在穩(wěn)定期胞外多糖的積累,同時發(fā)現(xiàn)gtaB-2基因為地衣芽孢桿菌合成胞外多糖的關鍵基因,其過表達可有效促進地衣芽孢桿菌胞外多糖的合成。Petrova等[45]在地衣芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)一種由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成的胞外多糖,具有良好的抗氧化和抗菌活性。Abinaya等[4]分離純化的地衣芽孢桿菌的胞外多糖具有較強的抗氧化能力,且對革蘭氏陰性菌具有很強的抗菌活性和抗生物被膜活性。地衣芽孢桿菌合成的胞外多糖具有多種調控因子,細胞通過對這些調控因子的控制來協(xié)調不同種類聚合物的合成,進而響應外界條件變化。因此,增加對地衣芽孢桿菌及其產生的胞外多糖生物聚合物能力的研究具有重要意義,胞外多糖的合成代謝機制及生物學功能仍需進一步深入研究。

2 地衣芽孢桿菌的抗真菌作用和霉菌毒素解毒能力

反芻動物被認為對霉菌毒素較不敏感,主要是因為瘤胃微生物群具有降解某些霉菌毒素的能力。然而,Gallo等[46]通過體外瘤胃發(fā)酵參數評估霉菌毒素在瘤胃環(huán)境中的穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn),隨著霉菌毒素濃度的增加,產氣量呈線性下降,總揮發(fā)性脂肪酸濃度呈二次方下降。有學者指出,霉菌毒素不僅對牛腸道健康造成潛在負面影響[47],還會影響奶牛血清γ-谷氨酰轉肽酶活性和總抗氧化能力[48]。例如,飼喂含有霉變玉米粉和棉籽的飼糧能夠會奶牛采食量、產奶量以及乳脂、乳蛋白和乳糖的產量[49]。Rocchetti等[50]報道,奶牛食用黃曲霉毒素污染的玉米青貯后,牛乳樣品中氧化型谷胱甘肽含量顯著積累,易導致機體氧化/抗氧化失衡。除此之外,為保證奶牛高產期營養(yǎng)需要,通常飼喂大量精料,這往往會造成瘤胃環(huán)境的酸化,減弱瘤胃微生物的解毒作用,使反芻動物對霉菌毒素更加敏感[51]。即使飼糧中黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度很低,也可能導致基因毒性致癌物代謝物黃曲霉毒素M1(AFM1)從乳汁中排出,對人健康構成潛在威脅[52]。

2.1 地衣芽孢桿菌的抗真菌作用

地衣芽孢桿菌能夠分泌多種抗菌物質,具有抑制真菌的作用[53]。地衣芽孢桿菌可以產生多種酶,具有病原真菌廣譜抗性。李婭楠[54]發(fā)現(xiàn),添加地衣芽孢桿菌會改變微貯稻草中細菌和真菌的菌群結構,尤其是腐敗菌和曲霉菌的豐度。Gong等[55]發(fā)現(xiàn),茶樹根系土壤中的芽孢桿菌TR-1具有廣譜抗真菌活性。Ling等[56]從地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中分理出具有抗真菌的絲氨酸蛋白酶成分,可以抑制辣椒疫霉、立枯絲核菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和灰霉菌的生長。地衣芽孢桿菌還具有產生幾丁質酶的能力,幾丁質是植物病原真菌細胞壁以及節(jié)肢動物、甲殼動物和線蟲外骨骼的基本化合物。地衣芽孢桿菌產生的幾丁質酶可以降解真菌細胞壁,破壞尖孢鐮刀菌的活性[57],還可以通過菌絲腫脹和球狀結構的改變抑制真菌植物病原菌[58-59]。Arbsuwan等[60]從木瓜中分離出的地衣芽孢桿菌可以產生細胞外抗菌物質,對重要的動植物病原體和腐敗微生物具有抑制作用。Ul Hassan等[61]發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可以產生多種揮發(fā)性有機化合物,其中3-甲基-1-丁醇是含量最高的化合物,這些化合物具有廣泛的生物活性,對曲霉和青霉的產毒菌株具有拮抗作用,適合作為抗真菌毒素的生物防治劑。

2.2 地衣芽孢桿菌的霉菌毒素解毒能力

物理和化學方法已廣泛用于去除霉菌毒素,但這些方法可能降低飼料的營養(yǎng)品質和感官特性。霉菌毒素的微生物轉化法與物理和化學方法相比,具有更高的特異性和環(huán)境友好性,是一種很有前途的霉菌毒素脫毒方法。地衣芽孢桿菌基因組序列中存在參與CotA漆酶生成的相關基因,可有效降解霉菌毒素。地衣芽孢桿菌中CotA漆酶不僅能夠有效氧化AFB1,并將其分解為無毒產物黃曲霉毒素Q1(AFQ1)及其差向異構體(epiAFQ1),還可以有效降解玉米赤霉烯酮和鏈格孢霉毒素,錳離子(Mn2+)和銅離子(Cu2+)誘導和氧化還原介質可以增強CotA漆酶對玉米赤霉烯酮的降解能力[62-65]。Raksha等[66]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌可以減少94.7%的AFB1,并且可以喪失AFB1的致突變作用。地衣芽孢桿菌具有開發(fā)成飼料添加劑用于去除玉米赤霉烯酮的巨大潛力,在受玉米赤霉烯酮污染的玉米粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后,地衣芽孢桿菌減少了98%以上的玉米赤霉烯酮。Wang等[67]從發(fā)霉的土壤樣品中分離并鑒定了具有強大的嘔吐毒素解毒能力的地衣芽孢桿菌菌株,可以在37 ℃條件下48 h內降解1 mg/L嘔吐毒素的82.67%以上,并且在模擬胃液中具有很強的存活率和嘔吐毒素降解率,還修復了嘔吐毒素引起的腸道菌群失調。綜上可知,地衣芽孢桿菌可能是在飼料青貯過程中對霉菌毒素進行生物修復和解毒的一個理想選擇。

3 小結與展望

地衣芽孢桿菌能夠加速青貯發(fā)酵進程,分泌生物酶等物質改變有害菌生物膜表面結構,破壞霉菌生長環(huán)境及營養(yǎng)供應,提高有害菌的抗生素敏感性,從而起到抑菌作用。目前,地衣芽孢桿菌由于缺乏生產數據在青貯發(fā)酵中尚未推廣使用。未來,需要進一步深入研究地衣芽孢桿菌的作用機制和關鍵基因,以更好地應用于青貯飼料生產中。此外,開展對地衣芽孢桿菌品種和菌株的篩選和優(yōu)化工作,選擇具有較高生物活性和適應性的菌株用于實際生產。同時,還應加強對地衣芽孢桿菌與其他微生物的相互作用的研究,以最大限度地發(fā)揮其在青貯飼料中的效果。綜合而言,地衣芽孢桿菌在青貯飼料領域的應用前景廣闊,并有望為畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出積極貢獻。