段雪偉，張敏君，王燕，楊慧文，劉冰，由天輝*

（1.廣東藥科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

構(gòu)樹[Broussonetia papyrifera（L.）Vent]，別名褚桃，為?？茦?gòu)屬落葉喬木，分布于我國(guó)華北、華中、華南、西南、西北等地區(qū)[1]。研究表明構(gòu)樹皮和葉中含有豐富的黃酮和生物堿類成分，具有抗炎抑菌[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4]等功效，構(gòu)樹花提取物可以抗衰老，對(duì)皮膚炎癥也有較好的作用[5]。構(gòu)樹花分為雄花和雌花，雌花授粉形成果實(shí)，雄花脫落被大量丟棄。構(gòu)樹雄花富含多糖類物質(zhì)，有食用的傳統(tǒng)，安全性較高，且構(gòu)樹雄花花序繁茂，數(shù)量可觀、來源廣泛，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。

多糖是一種廣泛分布于自然界中的高分子聚合物，是構(gòu)成動(dòng)植物細(xì)胞的重要組成部分，并參與細(xì)胞的代謝及生理調(diào)節(jié)[6]。植物多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有無(wú)毒、無(wú)害、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者青睞，大量研究表明植物多糖具有抗氧化[7]、抗炎[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、降血脂[10]等生理功效。目前，提取植物多糖的方法包括熱水浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶法等，其中超聲輔助提取法的原理是利用超聲波的空化作用，增大植物細(xì)胞壁的通透性，加速多糖的析出，達(dá)到減少提取時(shí)間、提高多糖得率的目的[11]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)構(gòu)樹花研究還鮮少報(bào)道，構(gòu)樹花資源沒有被充分利用，因此本文以構(gòu)樹雄花為研究對(duì)象，通過超聲輔助提取其活性多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并分析構(gòu)樹花多糖的體外抗氧化活性，旨在為深入挖掘構(gòu)樹花的綜合利用價(jià)值提供試驗(yàn)依據(jù)，并對(duì)開發(fā)具有生物活性的多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

構(gòu)樹花：采自安徽省亳州市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院程軒軒教授鑒定為?？茦?gòu)屬植物構(gòu)樹的雄花序；2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate），ABTS]、抗壞血酸：美國(guó)Sigma 公司；苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、亞硫酸鉀、水楊酸、FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、鹽酸：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ-3200 DB 超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；JC-TP 1204 型萬(wàn)分之一電子天平：青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司；XWK-V108S 酶標(biāo)儀：東莞西瓦卡精密量?jī)x有限公司；YRE-5299 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器：河南佰年儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)樹花多糖提取工藝

將構(gòu)樹花烘干、粉碎后過60 目篩，準(zhǔn)確稱取構(gòu)樹花粉末2.00 g，按照料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率80 W、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間80 min、提取2 次，合并提取液，過濾、濃縮、定容至50 mL，加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置24 h，收集沉淀，冷凍干燥得構(gòu)樹花多糖。配制成5 mg/mL 的構(gòu)樹花多糖溶液，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

考察料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]、超聲功率（60、80、100、120、140 W）、提取溫度（60、65、70、75、80 ℃）、提取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5）和乙醇濃度（65%、70%、75%、80%、85%）對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響?？疾炷骋灰蛩貢r(shí)其他因素固定條件為料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率80 W、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間80 min、提取2 次、乙醇濃度75%。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理[12]，以構(gòu)樹花多糖得率為響應(yīng)值，選取4 個(gè)對(duì)響應(yīng)值影響較大的因素（料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間）為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 構(gòu)樹花多糖含量的測(cè)定方法

1.3.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考Chen 等[13]的方法，采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為Y=2.018 7X+0.022 4（R2=0.992 4）。

1.3.4.2 多糖含量的測(cè)定

精密吸取一定體積的5 mg/mL 構(gòu)樹花多糖溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到多糖含量，再按公式（1）計(jì)算出構(gòu)樹花多糖得率（W，%）。

式中：C 為樣品溶液中構(gòu)樹花多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為測(cè)定液總體積，mL；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；M 為構(gòu)樹花粉末原料質(zhì)量，g。

1.3.5 構(gòu)樹花多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基的清除作用

參考Huang 等[14]的方法，配制ABTS 溶液。向1 mL構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL）加入6 mL ABTS 溶液，在30 ℃水浴中充分避光反應(yīng)6 min，于734 nm 處檢測(cè)不同濃度構(gòu)樹花多糖吸光度Ax，以純水代替ABTS 溶液測(cè)吸光度Ay，以純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測(cè)吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對(duì)照，按公式（2）計(jì)算ABTS+自由基清除率（E，%）。

1.3.5.2 構(gòu)樹花多糖對(duì)羥自由基的清除作用

參考Zan 等[15]的方法，采用水楊酸法測(cè)定構(gòu)樹花多糖對(duì)羥自由基的清除能力。向2 mL 構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL） 內(nèi)分別加入2 mL FeSO4溶液、2 mL 水楊酸溶液混勻后靜置10 min，再加2 mL H2O2溶液后置于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)0.5 h，510 nm 處測(cè)吸光度Ax，用純水代替H2O2溶液測(cè)吸光度Ay，用純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測(cè)吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對(duì)照，按公式（3）計(jì)算羥自由基清除率（F，%）。

1.3.5.3 構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

參考Chen 等[16]的方法測(cè)定構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。向2 mL 構(gòu)樹花多糖溶液（質(zhì)量濃度為0.4～4.0 mg/mL） 中加入4.5 mL Tris-HCl 溶液，置于25 ℃水浴鍋內(nèi)充分反應(yīng)20 min，再加0.4 mL鄰苯三酚溶液，靜置5 min 后加0.1 mL HCl 停止反應(yīng)，在325 nm 處檢測(cè)溶液吸光度Ax，以純水代替鄰苯三酚測(cè)得吸光度Ay，以純水代替構(gòu)樹花多糖溶液測(cè)吸光度A0。以同濃度抗壞血酸作為對(duì)照，按公式（4）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率（G，%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Graph-Pad Prism 8 進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 8.6 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)多糖得率的影響

料液比對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖1 可知，隨溶劑體積增大，多糖得率先是逐漸上升，當(dāng)料液比為1 ∶40（g/mL）時(shí)，多糖得率達(dá)5.49%，而后逐漸下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)所用溶劑較少時(shí)，溶液濃度較大，多糖溶出不完全，得率較低，增大溶劑體積可以增加構(gòu)樹花與純水的接觸面積，利于多糖析出；繼續(xù)增大純水用量，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)等非多糖物質(zhì)溶出，從而影響多糖含量，此外，溶劑體積的增加會(huì)延長(zhǎng)后期高溫濃縮時(shí)間，造成多糖分子結(jié)構(gòu)破壞，也會(huì)降低多糖得率[17]。因此，選擇料液比為1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 超聲功率對(duì)多糖得率的影響

超聲功率對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖2 可知，超聲功率較低時(shí)，構(gòu)樹花多糖得率隨超聲功率增大呈現(xiàn)明顯增勢(shì)，并在功率為100 W 時(shí)得率達(dá)到峰值5.78%。因?yàn)槌暡ㄓ兄谄茐闹参锛?xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖釋放；當(dāng)超聲波功率較大時(shí)，多糖糖苷鍵會(huì)被超聲波破壞，使多糖降解率大于多糖的析出率[18]，降低多糖得率。因此，選擇超聲功率為80、100、120 W進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

提取溫度對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖3 可知，在溫度低于70 ℃時(shí)，多糖得率隨提取溫度升高而增加，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，多糖得率最高，達(dá)到6.06%。升高溫度可以可加速構(gòu)樹花中多糖的運(yùn)動(dòng)，有利于多糖的析出；提取溫度超過70 ℃時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)會(huì)被高溫破壞[19]。因此，選擇提取溫度為65、70、75 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖4 可知，提取低于60 min 時(shí)，多糖得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，提取60 min 時(shí)，多糖得率最高，達(dá)到5.41%；因?yàn)樘崛r(shí)間太短時(shí)，多糖無(wú)法充分析出，超過60 min 時(shí)，大部分多糖已被提取出來，繼續(xù)提取，多糖中的雜質(zhì)析出使多糖得率下降[20]。因此，選擇提取時(shí)間為40、60、80 min 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

提取次數(shù)對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖5 可知，提取2 次時(shí)，多糖得率達(dá)到5.21%，提取3～5 次時(shí)，隨著次數(shù)增加構(gòu)樹花多糖得率反而減少?？赡苁且?yàn)樘崛? 次時(shí)，大部分多糖已經(jīng)被提取出來[21]，多次提取也會(huì)增加后期濃縮時(shí)間。因此，將最佳提取次數(shù)確定為2 次。

2.1.6 乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響

乙醇濃度對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

由圖6 可知，乙醇濃度低于75%時(shí)，多糖得率隨乙醇濃度增加而升高，乙醇濃度為75%時(shí)，多糖得率為5.21%，隨后趨于平緩。乙醇濃度為75%時(shí)，此時(shí)大部分多糖已經(jīng)溶出[22]，繼續(xù)增加乙醇濃度，無(wú)法提高多糖得率，又會(huì)造成試劑的浪費(fèi)。因此，將最佳乙醇濃度確定為75%。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

利用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.6 進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn)

以構(gòu)樹花多糖得率（Y）為考察響應(yīng)指標(biāo)，建立其與料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間4 個(gè)因素的回歸模型，得到二次回歸方程為Y=6.55+0.181 1A+0.123B-0.116 6C+0.101 9D+0.136 8AB+0.001 9AC+0.314 9AD-0.29BC-0.078 9BD-0.077CD-0.466 8A2-0.523 3B2-0.265 1C2-0.441D2。

由表3 可以看出，該回歸模型P<0.000 1，具有高度顯著性，模型總決定系數(shù)R2=0.962 6，R2Adj=0.925 2，表明有92.52%的試驗(yàn)值可用該模型預(yù)測(cè)，試驗(yàn)誤差較小，能準(zhǔn)確反映4 個(gè)因素對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響。此外A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AD、BC 項(xiàng)的P<0.01，影響極顯著；AB 項(xiàng)的P<0.05，具有顯著性影響，而AC、BD、CD 的P>0.05，對(duì)指標(biāo)無(wú)顯著影響。比較F 值得出各因素對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響大小為料液比>超聲功率>提取溫度>提取時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各個(gè)因素及其相互作用對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響的3D 響應(yīng)面如圖7 所示。

圖7 各因素交互作用對(duì)構(gòu)樹花多糖得率的影響Fig.7 Response surface plot of the effect of each factor on yield of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers

兩因素之間的交互作用是否顯著可以從等高線形狀看出，等高線為橢圓形，說明兩因素交互作用對(duì)構(gòu)樹花多糖得率影響顯著[23]。從圖7 可以看出，AB、AD、BC 的等高線為橢圓形，說明構(gòu)樹花多糖得率受料液比和超聲功率、料液比和提取時(shí)間、超聲功率和提取溫度的影響顯著，與上述方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過分析回歸模型可知，采用超聲波輔助提取構(gòu)樹花多糖的最佳條件：料液比1 ∶43.123（g/mL），超聲功率104.967 W，提取溫度68.055 ℃，提取時(shí)間64.807 min，此最優(yōu)條件下構(gòu)樹花多糖得率的預(yù)測(cè)值為6.63%。為驗(yàn)證結(jié)果可靠性，結(jié)合實(shí)際提取試驗(yàn)可行性，調(diào)整最終構(gòu)樹花多糖提取條件：料液比1 ∶43（g/mL），超聲功率105 W，提取溫度68 ℃，提取65 min，重復(fù)試驗(yàn)5 次，此最優(yōu)提取工藝條件下，構(gòu)樹花多糖得率為6.66%，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，證明該試驗(yàn)?zāi)M準(zhǔn)確、有效，適用于構(gòu)樹花多糖的提取。

2.3 體外抗氧化活性結(jié)果與分析

2.3.1 構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除作用見圖8。

圖8 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on ABTS+ free radicals

如圖8 所示，在試驗(yàn)配制的多糖濃度范圍內(nèi)，構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基表現(xiàn)出非常強(qiáng)的清除能力，且ABTS+自由基清除率與多糖濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)構(gòu)樹花多糖濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，清除率可達(dá)94.83%，此時(shí)構(gòu)樹花多糖的ABTS+自由基清除能力與抗壞血酸的最大清除能力接近，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基清除率的半抑制濃度（IC50）為0.47 mg/mL，說明構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基表現(xiàn)出極好的清除能力。

2.3.2 構(gòu)樹花多糖對(duì)羥自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用見圖9。

圖9 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on hydroxyl radicals

如圖9 所示，構(gòu)樹花多糖對(duì)羥自由基清除能力隨多糖濃度升高而提高，當(dāng)構(gòu)樹花多糖濃度升至2.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到88.3%，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對(duì)羥自由基的IC50值為0.76 mg/mL，具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

2.3.3 構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見圖10。

圖10 構(gòu)樹花多糖和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effects of polysaccharides from Broussonetia papyrifera flowers and ascorbic acid on superoxide anion radicals

如圖10 所示，構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力與多糖濃度呈正比，濃度為4.0 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到83.9%，經(jīng)線性擬合得出構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為2.47 mg/mL，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，相比較抗壞血酸，雖然構(gòu)樹花多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率較弱，但仍表現(xiàn)出一定的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波提取構(gòu)樹花多糖的條件，通過對(duì)料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間4 個(gè)因素的考察與響應(yīng)面分析，得到構(gòu)樹花多糖的最優(yōu)提取條件：當(dāng)料液比1 ∶43（g/mL）時(shí)，在超聲功率105 W 和提取溫度68 ℃條件下，提取65 min，構(gòu)樹花多糖得率為6.66%。此外，對(duì)提取的構(gòu)樹花多糖進(jìn)行了體外抗氧化活性分析，結(jié)果顯示，構(gòu)樹花多糖對(duì)ABTS+自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.47、0.76 mg/mL 和2.47 mg/mL，其結(jié)果弱于抗壞血酸。

綜上所述，采用超聲輔助提取法可有效提高構(gòu)樹花多糖的得率，所得構(gòu)樹花多糖體外抗氧化活性較強(qiáng)，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)療或化妝品等領(lǐng)域，該結(jié)果可為提高構(gòu)樹花的利用價(jià)值提供參考。