姚瑩瑩,李家輝,李海英,吳盈萍,趙曉鈺,周 軍,趙全莊,李宗福

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.塔城地區(qū)畜牧科技研究推廣中心,新疆塔城 834700;3.新疆額敏縣國家級飛鵝保種場,新疆額敏 834606)

0 引 言

【研究意義】我國收錄在冊的家禽品種有189個(gè),其中116個(gè)為雞品種[1]。外來品種引入與地方品種雜交也會造成遺傳資源的改變[2]。也迷里雞長期生長在我國新疆塔城地區(qū)額敏縣,其體型小而靈活,體質(zhì)健壯,野外覓食能力極強(qiáng)、耐熱、耐寒、耐粗飼、適應(yīng)性、抗逆性和抗病力強(qiáng),且肉質(zhì)細(xì)膩鮮美,蛋白含量、胸肉含量和瘦肉率高[3]。也迷里雞產(chǎn)品綜合利用價(jià)值高,在國內(nèi)市場上雞肉的需求量也明顯呈增長趨勢[3,4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微衛(wèi)星是第二代遺傳標(biāo)記,又稱簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSR),由核心序列和兩側(cè)翼序列組成,長度一般在200 bp以內(nèi)[5,6]。SSR是有效評價(jià)保種的分子標(biāo)記之一,具有分布廣泛、位點(diǎn)多、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、多樣性豐富等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。湯青萍等[10]對12個(gè)地方烏骨雞品種利用27個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示12個(gè)地方烏骨雞品種平均雜合度為0.622;平均多態(tài)信息含量為0.576;品種間遺傳距離結(jié)果表明,沐川烏骨雞與略陽雞遺傳距離最近(0.100 2),烏蒙烏骨雞與略陽雞最遠(yuǎn)(0.254 6),各烏骨雞群體的遺傳多樣性較豐富,具有較高的選擇潛力。楊速等[11]對拜城油雞用28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記,結(jié)果表明,各位點(diǎn)的有效等位基因、雜合度和多態(tài)信息含量平均值分別為7.38、0.62和0.57,拜城油雞的遺傳多樣性豐富。趙東偉等[12]對3個(gè)世代的徐海雞群體利用20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記,分析表明,徐海雞0、1、2世代的多態(tài)信息含量均值分別為0.489、0.496和0.518,呈逐步上升趨勢;3個(gè)世代的Ho在0.32～0.39;He在0.58～0.62,徐海雞群體豐富的遺傳多樣性得到很好的保存。【本研究切入點(diǎn)】也迷里雞是近幾年發(fā)現(xiàn)的新品種,目前運(yùn)用微衛(wèi)星技術(shù)對也迷里雞遺傳多樣性的研究還未見報(bào)道。需利用15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對也迷里雞進(jìn)行遺傳多樣性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對也迷里雞2個(gè)世代共4個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,為也迷里雞優(yōu)質(zhì)品種資源保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取健康狀況良好的2個(gè)世代共4個(gè)群體(G1:1世代公雞、G2:2世代公雞、M1:1世代母雞、M2:2世代母雞)也迷里雞為材料,每個(gè)世代隨機(jī)抽取60只個(gè)體,其中公母比例1∶1。對120只也迷里雞個(gè)體,采用EDTA采血管取翅下靜脈血3 mL/只,搖勻后分裝于1.5 mL離心管,置于-20℃下保存?zhèn)溆?。也迷里雞由額敏縣恒鑫實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[13]中苯酚-氯仿抽提法(結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件稍加修改)提取血樣中DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度,用紫外分光光度計(jì)法估計(jì)含量,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)選取用于雞遺傳多樣性評價(jià)的15對引物。試驗(yàn)采用的引物由南京康旭禾生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10 μL:2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL,10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL,DNA template 1.0 μL,ddH2O 3.0 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),72℃末端延伸20 min。取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1

表1 15對微衛(wèi)星引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GenAIex軟件統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因流(Nm)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、F-統(tǒng)計(jì)量(Fis、Fit、Fst、Nm)以及群體遺傳距離相關(guān)參數(shù)。利用Cervus軟件對各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)進(jìn)行計(jì)算。利用Phylip軟件基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA遺傳進(jìn)化樹。利用GenAIex軟件基于群體遺傳距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。利用STRUCTURE軟件評估群體遺傳結(jié)構(gòu)。用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)

研究表明,15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在也迷里雞4個(gè)群體中共檢測出102個(gè)等位基因,平均等位基因數(shù)為6.800個(gè),其中LEI0192和LEI0234位點(diǎn)檢測出的等位基因數(shù)最多,均為13個(gè);各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)介于2.191～7.485,平均值為3.688,其中LEI0234位點(diǎn)檢測出的有效等位基因數(shù)最多,為7.485個(gè),等位基因數(shù)(6.800)與有效等位基因數(shù)(3.688)兩指標(biāo)差異較大,也迷里雞群體還存在一定的選育空間;觀測雜合度在0.425～0.817,平均值為0.660;期望雜合度在0.544～0.790,平均值為0.708,Ho低于He,各微衛(wèi)星位點(diǎn)存在一定程度的雜合子缺失;多態(tài)信息含量介于0.439～0.854,平均值為0.661,其中MCW0248位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.250.5),其遺傳多樣性豐富。

Nm在6.192～29.689,其中MCW0216位點(diǎn)最大(29.689),LEI0166位點(diǎn)最小(6.192),均大于1,各位點(diǎn)Nm平均值為15.091,4個(gè)群體間存在高度的基因交流;Fis在-0.152～0.385,平均值為0.051;Fit在-0.137～0.392,平均值為0.070,也迷里雞4個(gè)群體在世代內(nèi)的近交程度較低;Fst在0.011～0.039,平均值為0.020,其中所有位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)均小于0.05,4個(gè)群體的遺傳分化并不明顯。表2

表2 各位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)

2.2 觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及等位基因

研究表明,1世代15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Ho范圍在0.350～0.902,平均值為0.630;2世代15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Ho范圍在0.455～0.812,平均值為0.680。2個(gè)世代中ADL0268位點(diǎn)Ho值最高(0.902),LEI0192位點(diǎn)值最低(0.350)。2個(gè)世代Ho差異極顯著(P<0.01),也迷里雞經(jīng)過2個(gè)世代的繁育,其遺傳多樣性增加。1世代15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的He范圍在0.549～0.862,平均值為0.681;2世代15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的He范圍在0.514～0.824,平均值為0.704。2個(gè)世代中LEI0234位點(diǎn)He值最高(0.862),MCW0248位點(diǎn)低最值(0.514)。2個(gè)世代He無顯著差異(P>0.05)。1世代的Na范圍在3～10.5,平均值為5.367;2世代的Na范圍在2.5～10.5,平均值為5.8。2個(gè)世代Na無顯著差異(P>0.05)。

世代間Ho、He和Na的變化趨勢均呈現(xiàn)出上升趨勢,其中Ho呈差異極顯著(P<0.01),He和Na無顯著差異(P>0.05),也迷里雞群體的遺傳多樣性較為豐富。表3

表3 2個(gè)世代不同位點(diǎn)觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及等位基因數(shù)(Na)

2.3 群體間的遺傳距離、遺傳相似性和聚類

研究表明,4個(gè)群體的遺傳距離范圍為0.042～0.081;遺傳相似性范圍為0.922～0.959。其中,M2和G2遺傳距離最近(0.042),遺傳相似性最高(0.959);G2與G1遺傳距離最遠(yuǎn)(0.081),遺傳相似性最低(0.922),2個(gè)群體間的遺傳變異程度相對較高。也迷里雞4個(gè)群體主要分為2類,G1單獨(dú)聚為一類,其他3個(gè)群體聚為一類,其中,M2與G2先聚為一類,再和M1聚為一類,與群體間的Nei’s遺傳距離結(jié)果一致。表4,圖1

圖1 4個(gè)也迷里雞群體的Nei's遺傳距離UPGMA聚類

表4 4個(gè)群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳相似性

2.4 4個(gè)也迷里雞群體PCoA

研究表明,G2與M2之間相似度高,遺傳距離較近,差異最小,G1與其他3個(gè)群體間差異較大,存在一定的遺傳距離,同UPGMA聚類圖分析結(jié)果一致。圖2

圖2 4個(gè)也迷里雞群體PCoA分析

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明,隨著假設(shè)亞群數(shù)目K的增加,LnP(D)逐漸增加,但沒有出現(xiàn)急劇的波動(dòng),在K=2～4時(shí)變化幅度最大。當(dāng)K=4時(shí),LnP(D)的衍生值ΔK取到最大值(31.1463),遠(yuǎn)大于其它對應(yīng)的ΔK值,并且,當(dāng)K=4時(shí),ΔK出現(xiàn)拐點(diǎn),在一定范圍內(nèi)取到極大值。以K=4為反映供試群體真實(shí)情況的最佳取值,即采集的120個(gè)個(gè)體被分為4組。圖3,圖4

圖3 K值與ΔK關(guān)系

圖4 120個(gè)個(gè)體STRUTURE類聚(K=4)

3 討 論

3.1 15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)及也迷里雞的遺傳多樣性

遺傳多樣性是指群體內(nèi)所有個(gè)體的遺傳變異總和,群體遺傳多樣性越豐富,該群體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng),進(jìn)化潛力越大[14]。群體內(nèi)遺傳變異的程度一般用遺傳參數(shù)來度量,基因雜合度、多態(tài)信息含量等均能對多態(tài)位點(diǎn)或群體的遺傳多樣性進(jìn)行評估,數(shù)值越高遺傳多樣性越高,所攜帶的遺傳信息越豐富[15]。

3.1.1 多態(tài)信息含量

多態(tài)信息含量是表示微衛(wèi)星位點(diǎn)變異程度高低、衡量基因片段多態(tài)性的一個(gè)指標(biāo)[16]。當(dāng)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC>0.5時(shí),表示高度多態(tài)性位點(diǎn);當(dāng)0.25

試驗(yàn)利用15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對也迷里雞2個(gè)世代共4個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測,結(jié)果表明,15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上共檢測出102個(gè)等位基因;平均等位基因數(shù)為6.800個(gè);平均有效等位基因數(shù)為3.688個(gè);多態(tài)信息含量平均值為0.661,且15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,僅MCW0248位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.250.5)。試驗(yàn)結(jié)果同前人對地方雞品種的研究結(jié)果一致,微衛(wèi)星位點(diǎn)均呈現(xiàn)出高度多態(tài)性,也迷里雞整個(gè)群體的選擇潛力較大,遺傳多樣性豐富。

3.1.2 雜合度

雜合度分為觀測雜合度和期望雜合度,數(shù)值越高說明群體遺傳變異越大,遺傳多樣性越豐富;Ho與He越接近,該品種受外來選擇影響越小,群體接近遺傳平衡狀態(tài)。尚嵩洋[20]在3個(gè)莊河大骨雞群體20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上共檢測出168個(gè)等位基因,觀測雜合度平均值為0.611 1,低于平均期望雜合度0.717 1,觀測雜合度與期望雜合度數(shù)值的不同是由于在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了基因突變或者隨機(jī)性的基因漂移造成的。李興才等[21]在香爐山雞群體21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上共檢測出85個(gè)等位基因;觀察雜合度平均值為0.575 7;期望雜合度平均值為0.637 1,群體內(nèi)出現(xiàn)一定程度的雜锃子缺失。伍革民等[22]對4個(gè)貴州烏骨雞群體進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記分析,發(fā)現(xiàn)各群體平均雜合度在0.706 9～0.738 5,平均值為0.727 2,其中廣西烏骨雞群體雜合度最高(0.738 5),4個(gè)烏骨雞群體在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的基因雜合度,具有豐富的遺傳多樣性。

試驗(yàn)中15個(gè)位點(diǎn)的觀測雜合度平均值為0.660;期望雜合度平均值為0.708,觀測雜合度低于期望雜合度,該結(jié)果同莊河大骨雞[17]、香爐山雞[18]研究結(jié)果一致,群體內(nèi)出現(xiàn)純合子過剩、雜合子缺失的現(xiàn)象。此外,也迷里雞1世代的Ho、He平均值分別為0.630、0.681;2世代的Ho、He平均值分別為0.680、0.704,2世代的雜合度高于1世代,也迷里雞群體遺傳變異得到保存,仍具有較高水平的遺傳多樣性,與PIC結(jié)果一致。

3.2 遺傳距離及聚類

一般認(rèn)為分化時(shí)間越短,遺傳距離越小[23]。楊速等[24]對7個(gè)番鴨群體遺傳距離及聚類分析的研究結(jié)果顯示,7個(gè)番鴨群體主要被分為2類;福建花羽番鴨與法國巴巴里番鴨遺傳距離最遠(yuǎn)(0.164 1),且福建花羽番鴨與其他6個(gè)群體遺傳距離均較大,結(jié)合福建花羽番鴨的遺傳多樣性最高,福建花羽番鴨攜帶較多獨(dú)特的遺傳信息。劉雅麗等[25]利用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測仙居雞保種效果中發(fā)現(xiàn),9世代與10世代的遺傳相似性系數(shù)極高(0.973 5),遺傳距離極低(0.026 9),2個(gè)世代的保種群沒有受到外來品種的影響。曾濤等[26]在雁蕩土雞及其他3個(gè)雞群遺傳距離和系統(tǒng)聚類結(jié)果中顯示,5個(gè)群體聚為3類,雁蕩麻雞2個(gè)群體為一類,仙居雞為一類,蕭山雞與龍游麻雞為一類。雁蕩麻雞與其他3個(gè)品種間的遺傳距離大于3個(gè)品種內(nèi)部的遺傳距離,雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨(dú)存在的一個(gè)品種。

研究中也迷里雞4個(gè)群體的遺傳距離范圍為0.042～0.081;4個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)范圍為0.008～0.018。其中,M2和G2遺傳距離最近(0.042),遺傳分化系數(shù)最小(0.008),遺傳相似性最高;G2與G1遺傳距離最遠(yuǎn)(0.081),遺傳分化系數(shù)最大(0.018),遺傳相似性最低。UPGMA聚類圖結(jié)果顯示,也迷里雞4個(gè)群體主要分為2類,G1單獨(dú)聚為一類,其他3個(gè)群體聚為一類,其中,M2與G2先聚為一類,再和M1聚為一類,該結(jié)果同主成分分析結(jié)果一致。

3.3 遺傳分化

F-統(tǒng)計(jì)量反映群體近交程度、群體間遺傳分化程度,主要包括Fis、Fit、Fst和Nm。白優(yōu)[27]對烏蒙鳳雞、威寧雞等6個(gè)群體用19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析,F-統(tǒng)計(jì)量研究結(jié)果表明,Fis、Fit和Fst平均值分別為-0.224 0、0.034 3和0.211 0,群體間存在較大的遺傳分化;Nm平均值為0.934 8(Nm<1),遺傳漂變可能會對群體的遺傳結(jié)構(gòu)造成影響。吳俊峰[28]對固始雞和浙川烏骨雞利用29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性研究,結(jié)果顯示,固始雞2個(gè)遷地保種群間Fst值為0.082,原位保種群與2個(gè)遷地保種群Fst值分別為0.102和0.130,均出現(xiàn)中度遺傳分化(0.05

研究中也迷里雞15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的Fis、Fit平均值分別為0.051、0.070;Fst平均值為0.020,其中所有位點(diǎn)遺傳分化系數(shù)均小于0.05;Nm平均值為15.091,遠(yuǎn)大于1。Fis、Fit結(jié)果高于烏蒙鳳雞群體[27],低于北京鴨群體[29];Fst結(jié)果低于烏蒙鳳雞[27]、固始雞[28]和北京鴨群體[29],也迷里雞4個(gè)群體的近交程度較低、遺傳分化不明顯,群體間存在高度的基因交流,也迷里雞保持著豐富的遺傳多樣性。

4 結(jié) 論

也迷離雞15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的PIC平均值為0.661,Fis、Fit、Fst平均值分別為0.051、0.070、0.020,且2世代的雜合度高于1世代,也迷離雞群體選擇潛力大、近交程度低、遺傳分化不明顯,具有較豐富的遺傳多樣性。