許弘弢，黃小娟，鄭重陽，張志愿

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學研究所，中國醫(yī)學科學院口腔頜面再生醫(yī)學創(chuàng)新單元，上海 200011

在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤已經(jīng)成為主要的死亡原因之一，據(jù)統(tǒng)計，口腔癌在全身惡性腫瘤發(fā)病率中居第6位，其中90%為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1-2］。目前，治療OSCC的主要手段是手術徹底切除原發(fā)腫瘤，但切除后仍有相對較高的復發(fā)率且患者預后較差，局部復發(fā)率為25% ～ 50%，5年生存率為64.8%［2］。

現(xiàn)階段術前腫瘤定位時，判斷是否有局部或遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移主要依靠計算機體層成像（computed tomography，CT）、正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）及磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等大型設備，但這些設備對腫瘤組織的靈敏度和特異度還有待提高，并且這些設備不能在術中實現(xiàn)實時定位引導切除。目前術中定位腫瘤切除范圍的手段非常有限，主要依賴術者的視診和觸診，但這種缺乏依據(jù)而只基于經(jīng)驗的判斷太過主觀。通常采用術中快速冷凍切片病理學檢查對癌床邊緣進行檢查，但作為一種耗時耗力的評估手段，能否準確地評估癌床狀態(tài)、減少復發(fā)率頗有爭議［3］。

依托于熒光探針的熒光成像技術可以作為一種補充性手段用于腫瘤的診療過程。熒光探針經(jīng)光照激發(fā)后會在富集處發(fā)射耀眼的熒光信號，經(jīng)儀器捕捉后即形成熒光影像，具有極高的分辨率（微米級），并可以與裸眼影像結(jié)合。除此之外，熒光成像所需的設備便攜可移動，不會遮擋手術視野，不會打亂既有工作流程，這些特點使得術中實時熒光成像引導切除成為可能。熒光成像技術也可以與CT、PET、MRI及術中快速冷凍切片病理學檢查等手段結(jié)合使用，彌補現(xiàn)階段術前診斷、術中定位及術后檢查等環(huán)節(jié)的不足，有助于降低復發(fā)率、提高患者生存率和生存質(zhì)量。

1 熒光成像簡介

熒光是一種光致發(fā)光的現(xiàn)象，其原理為熒光分子吸收外界光源照射的能量，使得熒光分子從基態(tài)躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)，之后熒光分子會通過釋放光子產(chǎn)生熒光的形式再次回到基態(tài)。通常，這一過程是由高能（短波）的入射光激發(fā)熒光分子后產(chǎn)生低能（長波）的熒光，其中波長的變化被稱為斯托克斯位移，可以在很大程度上影響熒光成像的效果。熒光成像系統(tǒng)通過捕捉靶區(qū)特定波長范圍的熒光并將其集成至顯示器就可以在術中實現(xiàn)實時熒光成像。

早在1944年，熒光成像技術就已經(jīng)在臨床診療中使用［4］。近期，隨著材料科學的發(fā)展、多學科聯(lián)合的深入，使得熒光成像成為一種極具潛力的輔助技術。與CT、PET及MRI等常規(guī)的成像方式相比，熒光成像作為一種非侵入性的成像方式，不會產(chǎn)生電離輻射、放射性損傷等不良反應，卻能提供實時可視化、超高分辨率的影像資 料。

與影像學和組織病理學等傳統(tǒng)診斷方式相比，熒光探針能夠在細胞、分子水平上進行診斷，有更高的靈敏度和特異度。熒光探針可以根據(jù)激發(fā)/發(fā)射光的波長進行分類，即可見光區(qū)（390 ～ 700 nm）、近紅外一區(qū)（near infrared region-Ⅰ，NIR-Ⅰ：700 ～ 900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ：900 ～ 1 700 nm）。本文針對這3個分區(qū)中代表性的熒光探針及其在口腔腫瘤診療過程中的應用及進展進行論述。

2 可見光區(qū)熒光探針的應用

傳統(tǒng)熒光探針的激發(fā)/發(fā)射光的波長通常位于可見光區(qū)，其中熒光素鈉（s o d i u m fluorescein，NaFL）、亞甲基藍（methylene blue，MB）和5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）獲得了美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的認證，在臨床和基礎研究中被廣泛使用。

2.1 熒光素

NaFL經(jīng)靜脈注射后通過非特異性的微血管滲漏作用在微血管系統(tǒng)紊亂的腫瘤組織中滯留；早在1948年，NaFL就在腦瘤手術中使用［5］，后來也被用于眼科血管造影［6］及探查口腔腫瘤［7］等。Qaiser等［7］為了研究NaFL探查口腔癌的靈敏度和特異度，通過局部噴涂方式進行了包含100名研究對象的橫斷面研究，病理學檢查發(fā)現(xiàn)其中58例具有口腔癌或異常增殖，局部噴涂NaFL后顯示熒光陽性的患者有56例，靈敏度為96.6%；在剩余42名健康者中有20名熒光陽性、22名陰性，特異度為52.4%，不能將炎癥組織與腫瘤組織有效區(qū)分。

異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）也屬于熒光素家族，常用于疾病機制研究中，Annexin Ⅴ能夠與細胞早期凋亡時細胞膜上出現(xiàn)的靶點特異性結(jié)合，F(xiàn)ITC與Annexin Ⅴ偶聯(lián)使得細胞凋亡可視化。Du等［8］使用AnnexinⅤ-FITC熒光探針研究口腔鱗癌細胞中miR-221上調(diào)是否會導致阿霉素抵抗的產(chǎn)生，結(jié)果顯示，抑制miR-221表達并使用阿霉素后熒光強度較之前有明顯提升，即腫瘤細胞凋亡增多，AnnexinⅤ-FITC熒光探針將細胞凋亡程度與熒光強度相聯(lián)系，從而可獲得更直觀的數(shù)據(jù)。

2.2 MB

MB為多功能熒光探針［4］，最初在1944年用于乳腺癌的診斷，除此之外還可作為光動力治療（photodynamic therapy，PDT）材料［9］、組織病理學染料［10］。MB對口腔前哨淋巴結(jié)探查有極高的靈敏度，Vishnoi等［10］用MB作為組織病理學染料對94例患者進行前哨淋巴結(jié)活檢，顯示其鑒定率高達93.61%。MB熒光的波峰均在可見光范圍內(nèi)，因此其熒光穿透深度淺、背信比低，這些特點極大地影響了其在口腔腫瘤診斷方面的應用。

2.3 5-ALA

5-ALA是血紅素合成過程中的中間物質(zhì)，在血紅素的代謝過程中5-ALA可以轉(zhuǎn)化為具有熒光性質(zhì)的原卟啉Ⅸ。Zheng等［11］通過局部噴涂5-ALA探查口腔癌及癌前病變，使用數(shù)字化內(nèi)窺鏡探查患者49例，獲得118張病理學切片，結(jié)果顯示，5-ALA用于區(qū)分癌前病變組織與正常組織的靈敏度為92%，特異度為96%，用于區(qū)分腫瘤組織與正常組織的靈敏度為98%，特異度為96%，用于區(qū)分癌前病變組織與腫瘤組織的靈敏度為98%，特異度為92%，可以明確區(qū)分腫瘤和炎癥。

NaFL、MB和5-ALA等都是有機熒光分子，生物相容性較好，能夠快速地從體內(nèi)代謝，但是在可見光范圍內(nèi)，組織對光的吸收、散射及反射作用較強，因此激光的穿透深度及激發(fā)的熒光信號強度有限，成像過程中容易產(chǎn)生背景熒光，降低了目標組織與正常組織之間的對比度，使得成像質(zhì)量受到限制，而NIR熒光探針的光學特性就在一定程度上避免了這些問題。

3 NIR-Ⅰ熒光探針的應用

N I R-Ⅰ熒光探針主要包括以吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）及其衍生物為代表的菁類有機探針，早在1970年，ICG就被用于眼科診斷［12］，是NIR類探針中唯一獲得美國FDA批準的熒光探針。菁類化合物分子兩端各有一個氮雜環(huán)，兩個氮雜環(huán)通過碳原子共軛鍵（多甲川鍵）相連接［13］，是其光學特性的結(jié)構(gòu)基礎。

3.1 ICG

ICG為無毒性水溶性探針分子，在靜脈注射后，可迅速與血漿蛋白相結(jié)合并在血管中流動，癌組織中的微血管結(jié)構(gòu)紊亂，通透性高，使得隨血流運動的ICG富集，即實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR），NIR光激發(fā)后在富集區(qū)域發(fā)出明亮熒光，具有較好的穿透力和信噪比。Pan等［14］對ICG在口腔腫瘤診療過程中所發(fā)揮的作用進行了研究，細胞實驗顯示，ICG具有極高的生物相容性；在動物實驗中，48只荷瘤小鼠分為兩組各24只，分別為皮下移植和原位移植模型，注射ICG后12 h，所有荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域均顯示熒光；在包含20例患者的臨床試驗中，注射ICG后6 ～ 8 h，所有腫瘤都顯示熒光，靈敏度為100%，并且腫瘤區(qū)域與癌周正常組織的熒光強度有明顯的對比，術后對癌床進行檢查發(fā)現(xiàn)4例患者的切緣有ICG熒光殘留，進行病理學檢查發(fā)現(xiàn)，2例含有殘留癌細胞，另外2例為假陽性，假陽性率為50%。

上述研究說明ICG對口腔癌有一定的診斷能力，但是其對深部軟組織邊界探查能力不足，富集效率有待進一步提高且量子產(chǎn)率（quantum yield，QY）較低。因此，許多團隊正在研究將ICG作為熒光基團與其他靶向分子結(jié)合及開發(fā)其他高QY菁類探針［15］，以期在癌癥診斷、腫瘤邊界確認等方面取得突破性進展。

3.2 其他菁類熒光探針

目前，其他菁類熒光探針中以IRDye800CW應用最為廣泛，可以與單抗體、小分子及肽廣泛地結(jié)合，產(chǎn)生靶向熒光效果，提供超過5 mm的探查深度［16］。西妥昔單抗-IRDye800CW是第一個被用于口腔腫瘤診療的靶向探針［17］，可以特異性結(jié)合腫瘤細胞表面高表達的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。Rosenthal等［18］為測試西妥昔單抗-IRDye800CW的安全性及靈敏度進行了一項包含12例患者的臨床試驗，靜脈注射不同濃度西妥昔單抗-IRDye800CW懸濁液，結(jié)果顯示，在整個試驗階段沒有出現(xiàn)2級以上不良反應，且熒光探針對腫瘤細胞有極高的特異度，靈敏度達到100%，證實了臨床應用靶向熒光探針的可行性。

上述探針都屬于NIR-Ⅰ，穿透深度、成像精度還可以進一步提升；而組織對NIR-Ⅱ的光吸收少，引起的光損傷小，同時光的穿透力也更強，有助于熒光成像獲得更為清晰的信背比、更精細的空間分辨率。這些特性極大增強了NIR-Ⅱ探針對腫瘤邊界的探測能力，因此NIR-Ⅱ熒光探針是目前的研究熱門。

4 NIR-Ⅱ熒光探針的分類及應用

NIR-Ⅱ熒光探針主要包括稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒（upconverting nanoparticle，UCNP）和量子點（quantum dot，QD），具有高達10 mm的組織穿透力［19］，清晰的信噪比、可靠的空間分辨率等光學特性增強了熒光探針對腫瘤探查的精確度，但目前在口腔腫瘤診斷和探查方面的研究還比較有限。

4.1 UCNP熒光探針

UCNP經(jīng)典結(jié)構(gòu)包含基質(zhì)材料及摻雜在其中的稀土元素。基質(zhì)材料主要由氟化物構(gòu)成，可以有效地降低能量損耗，提高發(fā)射光強度。稀土元素標志性的原子結(jié)構(gòu)［20］使其具有特殊的光學特性，常作為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的敏化劑和激活劑使用。經(jīng)光激發(fā)后，UCNP的3種成分會發(fā)生復雜的能態(tài)變化，實現(xiàn)反斯托克斯位移發(fā)光，即低能量（長波）的光激發(fā)而發(fā)射高能量（短波）熒光。這一特性使得UCNP具有極高的光穩(wěn)定性，不易光漂白，并且斯托克位移較大、發(fā)射峰的寬度小、峰值高等優(yōu)點使得其能有效地規(guī)避來自激發(fā)光及其他熒光的干擾。

如何提高UCNP較低的QY和熒光強度一直是材料學家面臨的難題。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)將UCNP外再包裹一層由基質(zhì)材料構(gòu)成的外殼，形成核-殼結(jié)構(gòu)，能夠顯著提升探針QY并獲得比之前高百倍的熒光強度，還可以將發(fā)射光調(diào)整到NIR-Ⅱ。Lin等［21］將核-殼結(jié)構(gòu)UCNP、碳原子（C）、金原子（Au）進行摻雜，得到熒光探針RENP@C@Au（UCA），探針表面經(jīng)過短肽c-MET結(jié)合蛋白（c-MET binding peptide，cMBP）修飾后可以靶向OSCC細胞表面過表達的c-MET蛋白。UCA中主要的激活劑為釹（Nd3+），經(jīng)過NIR光照射后分別在650、1 064 nm處顯示發(fā)射峰。細胞實驗［21］結(jié)果顯示，在含有不同濃度UCA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)各種腫瘤細胞系都能保持很高的生存率，并且對人舌鱗癌細胞Cal-27的靶向性最高。動物實驗［21］結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈注射后探針能夠在病灶處發(fā)射明亮的熒光信號，并具有識別微型病灶（3 mm）的能力。

4.2 QD納米熒光探針

QD通常由Ⅱ ～ Ⅵ、Ⅲ ～ Ⅴ或Ⅳ ～ Ⅵ族元素組成，通過調(diào)整元素及其比例、納米顆粒大小就可以調(diào)整光學特性。除此之外，QD的光學特性十分出色，具有較大的斯托克位移，能夠充分排除來自激發(fā)光的干擾。窄的發(fā)射峰，使其能屏蔽掉環(huán)境雜波的影響；強的光穩(wěn)定性，可以持續(xù)激發(fā)而熒光強度不會發(fā)生衰減。

將QD表面修飾后，它也可與短肽、單抗等靶向分子結(jié)合，極大地提高其探查腫瘤組織、劃分腫瘤邊界的能力。Zhu等［22］將Ag2Se與西妥昔單抗結(jié)合為西妥昔單抗-Ag2Se，激發(fā)后可在930 nm波長處觀察到最大激發(fā)峰，QY為7.3%，在異種移植舌鱗癌細胞Cal-27的裸鼠身上進行動物實驗，結(jié)果顯示，靜脈注射7 h后可以在腫瘤部位觀察到明顯熒光，于13 h達到最大強度。

5 小結(jié)

熒光成像技術在口腔腫瘤探查、術中引導切除及術后檢查癌床等方面都具有良好的表現(xiàn)?？梢姽鈪^(qū)熒光探針雖然有較高的QY、良好的生物相容性，但受制于羸弱的穿透深度和較強的組織反射、吸收，其在臨床使用過程中受到極大限制。以ICG為代表的NIR-Ⅰ菁類探針是現(xiàn)階段臨床應用和研究中的主要探針，激發(fā)后能實現(xiàn)令人滿意的穿透深度，并且NIR光能夠減少來自組織的散射、吸收及自熒光等影響成像質(zhì)量的因素。更為重要的是，菁類探針較低的細胞毒性、良好的生物相容性及快速清除的特點使其滿足臨床轉(zhuǎn)化的首要前提：可靠的安全性。而NIR-Ⅱ探針的研發(fā)正處于起步階段，主要有UCNP、QD等，雖然他們的光學特性更為突出，但是他們的清除時間長，在體內(nèi)復雜環(huán)境中有引起潛在不良反應的可能性，并且細胞毒性大，只能通過對材料表面進行修飾或改性來提高生物相容性。除此之外，患者及患者腫瘤組織具有異質(zhì)性，往往使得靶向探針的效果大打折扣，今后如何提高其靶向性、實現(xiàn)精準治療亦是亟待解決的難題。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。