馬 鑫，張俊杰，孫延國，魯儀增，李 猛，宋福榮，趙云朝，許慶標(biāo)，劉金錦，張連合，仝伯強(qiáng)，穆艷娟*

（1.興林（北京）林業(yè)工程設(shè)計(jì)研究院有限公司，北京 100091；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；3.國家林業(yè)和草原局元寶楓工程技術(shù)研究中心暖溫帶林草種質(zhì)資源保存與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省林草種質(zhì)資源中心，山東濟(jì)南 250102；4.菏澤市林業(yè)局，山東 菏澤 274000；5.成武縣國有林場，山東 成武 274200）

元寶楓（Acer truncatum Bunge）又名元寶槭、平基槭等，為我國無患子科（Sapindaceae）槭屬（Acer Linn.）植物，其分布范圍廣、栽培歷史悠久，是我國特有的觀賞樹種、木本油料樹種[1,2]。元寶楓葉中含有多種與人體健康有關(guān)的活性成分，元寶楓的果皮、果翅和種皮含有大量的優(yōu)質(zhì)縮合性單寧，而單寧具有抗氧化、抗血栓、降低膽固醇等功效，有益于心臟血管疾病的預(yù)防。而且元寶楓油是植物源神經(jīng)酸的重要來源，進(jìn)一步促進(jìn)了元寶楓藥用價(jià)值的開發(fā)利用。尤其近10 多年來，元寶楓產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)研究與培育技術(shù)開發(fā)縱深發(fā)展，并且在槭屬植物源神經(jīng)酸開發(fā)[3]、元寶楓籽油列入新資源食品[4]以及元寶楓葉、樹皮、枝條等利用研究[5-8]等方面取得了突破，陸續(xù)測(cè)序組裝了元寶楓的葉綠體基因組[9-11]、全基因組[12]并挖掘了神經(jīng)酸的生物合成調(diào)控基因等，報(bào)道了元寶楓嫁接育苗技術(shù)[13,14]、扦插育苗技術(shù)[15-18]、組培快繁技術(shù)[19-23]等無性繁育技術(shù)和結(jié)實(shí)規(guī)律[24]，元寶楓的全株開發(fā)利用前景越來越廣闊[25,26]。最新研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酸可以通過發(fā)芽刺激富集在元寶楓的種子中[27]。但是，元寶楓種子生物學(xué)研究薄弱[28]，元寶楓種子萌發(fā)率不高（66%）[29]，元寶楓的機(jī)理研究[30]及繁育研究[31]均基于發(fā)芽法，易造成不可控的經(jīng)濟(jì)損失?！禛B2772-1999 林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[32]也只采用發(fā)芽法進(jìn)行元寶楓種子生活力測(cè)定，常規(guī)檢測(cè)法下的元寶楓發(fā)芽率低而且檢測(cè)周期長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了現(xiàn)代育苗、生產(chǎn)對(duì)元寶楓種子生活力快速檢測(cè)的需求。2,3,5-氯化三苯基四氮唑法（TTC 法）是國際上檢測(cè)木本油料樹種種子生活力的通用快速、高效方法[36]。本研究以元寶楓家系種子為材料，探索建立元寶楓種子生活力TTC 快速檢測(cè)方法，以期為元寶楓產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以國家林業(yè)草原元寶楓工程技術(shù)研究中心于2020 年秋季采集的元寶楓種子為材料，采種后室溫自然晾干，去除果皮后備用。其中，正交試驗(yàn)中每處理的種子數(shù)量為10 個(gè)；最佳染色溫度篩選所用種子為2 個(gè)河北省種源的元寶楓單株種子（單株編號(hào)HB060 和HB067）和1 個(gè)山東省種源的單株種子（單株編號(hào)SD001），正交試驗(yàn)中每處理的種子數(shù)量為20 個(gè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理方法

將元寶楓種子置于20～25℃的水中浸泡18h，隨后放置3～5℃的環(huán)境中預(yù)處理10～14 d。按照向振勇等提供的方法[33]配置TTC 濃度梯度為0.5%、0.75%、1%，置4℃冰箱備用。染色處理溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

1.2.2 染色方法

按照正交設(shè)計(jì)進(jìn)行染色試驗(yàn)。將處理完畢的元寶楓種子置于暗盒內(nèi)進(jìn)行TTC 染色，每盒10 粒，參照《GB2772-1999 林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[32]茶條槭（A.ginnala Maxim.）TTC 處理時(shí)間，分別將含有元寶楓種子的暗盒放置于培養(yǎng)箱中避光加熱48h。隨后，按照向振勇等提供的方法[33]從元寶楓種子中取出胚，檢測(cè)元寶楓胚的染色程度判斷元寶楓種子的生活力，計(jì)算具種子生活力（Seed viability，SV）的百分比：SV=（有生活力的種子數(shù)量/供試種子總數(shù)）×100%。具最佳染色效果（The best dyeing effect，BDE）的所占百分比，BDE=（具最佳染色的種子數(shù)量/供試種子總數(shù)）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用Microsoft Office Excel 2013 和SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 元寶楓種子生活力對(duì)不同處理的響應(yīng)

TTC 濃度和不同處理染色溫度，對(duì)元寶楓種子的染色效果均有一定影響（表1），其中SV 為50%～95%，平均為76.17%；BDE 為22.5%～75%，平均為53.33%。由表1 進(jìn)一步分析表明，隨著TTC 濃度由0.5%升高至1%，SV 和BDE 均逐漸增高，分別為71%和50.5%、74.5%和51.5%、83%和58%；隨著染色處理溫度由20℃升高至40℃，SV 和BDE 的變化也基本一致，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，分別為59.17%和32.5%、75.83%和41.67%、79.17%和64.17%、84.17 和59.17、82.5%和69.17%，TTC 的濃度越高元寶楓種子中具活力種子的檢出比例越高，而染色溫度以35℃～40℃為宜。

表1 不同處理下元寶楓種子染色情況

SV 與BDE 呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.817），具生活力的元寶楓種子所占比例越高，相關(guān)處理的染色率越高，具最佳染色效果元寶楓種子所占的比例也越高。

元寶楓SV 最低的組合為處理1（表1），TTC 濃度為0.5%，染色溫度20℃；元寶楓SV 最高的組合為處理14（表1），TTC 濃度為1%，染色溫度35℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

TTC 濃度和染色溫度對(duì)元寶楓種子生活力影響的極差分析（表2）表明，染色溫度的極差R2 （25） 大于TTC 濃度的極差R1（12），表明染色溫度對(duì)元寶楓SV 的影響大于TTC 濃度對(duì)其SV 的影響。TTC 濃度中，K3 最大，濃度為1%；染色溫度中，K4 最大，染色溫度為35℃。極差分析表明，元寶楓種子TTC 檢測(cè)的最佳條件為TTC 濃度為1%；染色溫度為35℃。

表2 不同處理對(duì)元寶楓種子生活力影響的極差分析

2.3 不同處理的主效應(yīng)檢驗(yàn)

TTC 濃度和染色溫度處理的交互效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，TTC 濃度及其與染色溫度互作對(duì)SV 的影響均較小，均未達(dá)到顯著水平； 溫度0.05 水平上對(duì)SV 的影響較大，達(dá)到顯著差異水平。說明與極差分析結(jié)果一致，染色溫度對(duì)SV 的影響較大，需要進(jìn)一步篩選出最佳處理溫度。

表3 元寶楓種子不同處理的主效應(yīng)檢驗(yàn)

2.4 元寶楓種子生活力TTC 法最佳檢測(cè)處理因子驗(yàn)證與篩選

2.4.1 TTC 最佳濃度驗(yàn)證與篩選

不同單株元寶楓種子的生活力檢測(cè)結(jié)果（表4）進(jìn)一步表明，不同TTC 濃度梯度下，檢測(cè)出具有活力的種子數(shù)量為16.89～17.78 個(gè)，平均為17.22 個(gè)，變異系數(shù)為2.3%；SV 為84.44%～88.89%，平均為86.11%，變異系數(shù)為2.3%。BDE 為72.22%～73.33%，平均為72.78%，變異系數(shù)為0.62%。以上說明，在TTC 濃度0.5%～1%變化時(shí)，TTC 法用于元寶楓種子生活力檢測(cè)時(shí)的檢出能力均較強(qiáng)，不同單株之間的變化不大。從具有生活力的元寶楓種子檢出數(shù)量、SV 以及BDE 來看，均以TTC 濃度1%時(shí)最為理想。綜合選擇以1%TTC濃度最佳。

表4 不同家系元寶楓種子生活力對(duì)TTC 濃度處理的響應(yīng)

2.4.2 TTC 最佳染色溫度驗(yàn)證與篩選

不同家系元寶楓種子生活力檢測(cè)結(jié)果（表5）進(jìn)一步表明，不同染色溫度梯度下，檢測(cè)出具有活力的種子數(shù)量范圍為17～17.67個(gè)，平均為17.22 個(gè)，變異系數(shù)為1.82%；SV為85%～88.33%，平均為86.11%，變異系數(shù)為1.82%。BDE 為68.89%～76.67%，平均為72.78%，變異系數(shù)為4.36%。以上說明，在染色溫度35℃～40℃梯度下，TTC 法用于元寶楓種子生活力檢測(cè)時(shí)的檢出能力也均較強(qiáng)，不同單株之間的SV 變化相對(duì)較小，BDE 的變化相對(duì)較大。從具有生活力的元寶楓種子檢出數(shù)量、SV 以及BDE 來看，綜合以37.5℃染色溫度下，SV（91.67%）和BDE（81.67%）的結(jié)果均最佳。

表5 不同家系元寶楓種子生活力對(duì)不同溫度處理的響應(yīng)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

染色溫度顯著影響元寶楓種子的染色效果，隨溫度升高染色效果先逐漸增強(qiáng)再稍微減弱；染色效果隨TTC 濃度升高而逐漸增強(qiáng)，但TTC 濃度及其與染色溫度的交互作用對(duì)元寶楓種子染色效果的影響均未達(dá)到顯著水平。TTC 濃度0.5%～1%，染色溫度為35℃～40℃時(shí)，TTC 法在不同單株之間的檢驗(yàn)?zāi)芰鞠喈?dāng)，適用于元寶楓種子生活力檢測(cè)。其中，以TTC 濃度為1%、37.5℃染色處理?xiàng)l件下開展元寶楓種子生活力檢測(cè)最為理想。

3.2 討論

TTC 法在植物種子檢驗(yàn)中具有簡便、快捷、有效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[33,34]。其中，TTC 濃度決定了染色效果的深淺，而溫度影響到染色效果的呈現(xiàn)速度，二者綜合決定了TTC 法檢測(cè)的效果和靈敏程度。但是近年來，一直沒有建立起元寶楓種子生活力快速檢測(cè)方法體系，傳統(tǒng)方法耗時(shí)長、效果差，不利于元寶楓種子調(diào)撥及育種評(píng)估。本研究通過對(duì)元寶楓種子生活力檢驗(yàn)的TTC 濃度和溫度梯度處理，進(jìn)行正交分析及其在不同單株間進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證篩選，從中得出的最佳TTC 濃度和最佳溫度，研建了元寶楓種子TTC 快速檢驗(yàn)方法，為元寶楓相關(guān)科研生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。