楊麗微, 仇有喜, 楊 松

肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)是兒童常見(jiàn)的社區(qū)獲得性肺炎[1]。氣道黏液栓是支氣管黏膜炎癥、壞死及黏液大量異常分泌,黏液積聚阻塞支氣管,是導(dǎo)致難治性及重癥MPP發(fā)生的重要因素[2]。MPP合并氣道黏液栓患兒可遺留支氣管擴(kuò)張、肺不張及塑形性支氣管炎等癥狀,導(dǎo)致患兒不良預(yù)后[3]。目前,纖維支氣管鏡下肺泡灌洗已成為治療MPP合并氣道黏液栓的重要介入治療方法,有利于解除氣道阻塞,減少后遺癥的發(fā)生[4]。但目前影響MPP合并氣道黏液栓患兒介入治療療效的因素尚不清楚。支氣管肺泡灌洗能夠獲得下呼吸道和肺泡上皮表面的液體,通過(guò)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞,有助于肺部疾病的診斷及療效評(píng)估[5]。肺泡巨噬細(xì)胞是對(duì)呼吸道黏液阻塞后發(fā)生反應(yīng)的關(guān)鍵防御細(xì)胞,其通過(guò)感知并響應(yīng)高濃度黏液及黏液中的外源性或內(nèi)源性炎癥刺激,分泌白介素(interleukin,IL)-2等炎癥因子,參與氣道黏液的清除,與MPP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。有研究表明,MPP感染時(shí)中性粒細(xì)胞聚集和過(guò)度激活,其通過(guò)促進(jìn)肺組織氧化應(yīng)激損傷,加重MPP感染程度[7]。本研究通過(guò)分析MPP合并氣道黏液栓患兒BALF中各細(xì)胞分類及炎癥因子的表達(dá),探討各指標(biāo)對(duì)MPP合并氣道黏液栓患兒的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2018年2月至2022年2月于佳木斯中心醫(yī)院接受支氣管肺泡灌洗術(shù)的168例MPP患兒的臨床資料,根據(jù)支氣管鏡下查出氣道黏液栓存在情況,將其分為MPP合并氣道黏液栓組(78例)和單純MPP組(90例)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡1～14歲;(2)根據(jù)臨床、影像學(xué)表現(xiàn)及血清肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)-IgM滴度≥1∶160和(或)MP-DNA陽(yáng)性,符合《兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范(2019年版)》[8]中關(guān)于MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)患兒入院后均經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療5～7 d,臨床癥狀、體征及影像學(xué)檢查無(wú)明顯改善,行纖維支氣管鏡檢查及肺泡灌洗術(shù)治療,符合《中國(guó)兒科可彎曲支氣管鏡術(shù)指南(2018年版)》[9]中關(guān)于支氣管鏡檢查及肺泡灌洗術(shù)的適應(yīng)證;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前3個(gè)月內(nèi)有抗生素使用史;(2)合并其他病原微生物感染,如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌及肺結(jié)核等;(3)伴有氣道狹窄、哮喘急性發(fā)作等疾病;(4)合并先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良及遺傳代謝病等。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。本研究經(jīng)佳木斯中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):M20170034),患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2治療方法 患兒住院后均予以吸氧、霧化吸入及阿奇霉素治療。注射用阿奇霉素(國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司),治療劑量10 mg/(kg·d),1次/d,連續(xù)使用5～7 d。對(duì)于重癥及危重癥患兒,常規(guī)予以地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州卓峰制藥廠)1 mg/(kg·d),1次/d,連續(xù)使用5～7 d。

1.3支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗 入院后予注射用阿奇霉素治療5～7 d,臨床癥狀、體征及影像學(xué)檢查無(wú)明顯改善,擇手術(shù)日清晨使用柔性視頻支氣管鏡(BF-3C30,日本Olympus)進(jìn)行支氣管鏡檢查,術(shù)前禁飲食6 h。根據(jù)患兒年齡選擇適宜的支氣管鏡型號(hào),采用邊麻醉邊進(jìn)氣管的局部麻醉方法[10]。觀察氣管、各級(jí)支氣管病變。(1)MPP合并氣道黏液栓鏡下表現(xiàn)為1個(gè)及以上肺段支氣管腔內(nèi)有黏稠分泌物阻塞管腔,不易吸出,部分需要借助異物鉗或細(xì)胞刷清除。(2)單純MPP鏡下只表現(xiàn)為黏膜充血水腫、黏膜粗糙、黏膜糜爛、濾泡增生、少許分泌物。采集分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。當(dāng)觀察到氣道黏液栓阻塞時(shí),用細(xì)胞刷將黏液栓清除,結(jié)合胸部CT或X線片,用37 ℃生理鹽水對(duì)相應(yīng)部位進(jìn)行支氣管肺段灌洗,體重≤20 kg者灌洗量為1 ml/(kg·次),>20 kg者灌洗量為2 ml/(kg·次),連續(xù)灌洗3次,負(fù)壓(10 mmHg)抽吸BALF進(jìn)行檢測(cè)。

1.4BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)方法 采用改良BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)制片和瑞氏-吉姆薩染色法[11]。當(dāng)支氣管鏡到達(dá)靶支氣管后,經(jīng)工作孔道注入37 ℃生理鹽水,1～2 ml/(kg·次),總量≤10 ml/次,再以負(fù)壓100～200 mmHg吸引獲取BALF標(biāo)本,灌洗液回吸收率≥40%。取BALF標(biāo)本經(jīng)一次性痰液過(guò)濾器過(guò)濾后,4 ℃條件下以1 500 r/min離心5 min,棄上清,用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為每低倍鏡視野15～20個(gè)細(xì)胞。向細(xì)胞離心裝置中加入200 μl細(xì)胞懸液,800 r/min離心4 min,玻片自然晾干30 min后采用自動(dòng)化瑞氏-吉姆薩染色法染色20 min,試劑盒購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)公司。烘干后采用奧林巴斯CX31光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鏡檢,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。計(jì)算巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)目的百分比。

1.5BALF炎癥因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取BALF標(biāo)本,4 ℃條件下以2 000 r/min離心10 min,取上清進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,應(yīng)用酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛公司)檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度值,計(jì)算IL-2、IL-4、IL-8、IL-10濃度。所用試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)公司。

1.6臨床資料收集 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集研究對(duì)象的性別、年齡、體重、發(fā)熱時(shí)間等一般資料。收集入院后第1天實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo),包括血紅蛋白、C反應(yīng)蛋白、血小板數(shù)目、外周血白細(xì)胞數(shù)目、外周血中性粒細(xì)胞百分比、外周血淋巴細(xì)胞百分比、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶水平以及血清MP-IgM抗體滴度。MP-IgM抗體滴度采用被動(dòng)顆粒凝集法測(cè)定,所用試劑盒購(gòu)自日本FUJIREBIO株式會(huì)社。

1.7隨訪 對(duì)MPP合并氣道黏液栓組進(jìn)行隨訪,于患者病程2個(gè)月時(shí)囑其至門診復(fù)查胸部X線片等,根據(jù)肺部炎癥吸收情況,分為肺炎吸收緩慢組(35例)和肺炎完全吸收組(43例)[12]。

2 結(jié)果

2.1兩組BALF中各細(xì)胞分類及炎癥因子水平比較 MPP合并氣道黏液栓組BALF巨噬細(xì)胞百分比、IL-4、IL-10水平低于單純MPP組,BALF中性粒細(xì)胞百分比、IL-2、IL-8水平高于單純MPP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組BALF中各細(xì)胞分類及炎癥因子水平比較

2.2MPP合并氣道黏液栓組BALF巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比與炎癥因子水平的相關(guān)性分析結(jié)果 MPP合并氣道黏液栓組BALF巨噬細(xì)胞百分比與IL-4、IL-10水平呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-2、IL-8水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);中性粒細(xì)胞百分比與IL-4、IL-10水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與IL-2、IL-8水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 MPP合并氣道黏液栓組BALF巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比與炎癥因子水平的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3MPP合并氣道黏液栓患兒預(yù)后與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 對(duì)于MPP合并氣道黏液栓患兒,肺炎吸收緩慢組發(fā)熱時(shí)間、BALF中性粒細(xì)胞百分比高于肺炎完全吸收組,BALF巨噬細(xì)胞百分比低于肺炎完全吸收組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 MPP合并氣道黏液栓患兒預(yù)后與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

2.4影響MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的多因素logistic回歸分析結(jié)果 以MPP合并氣道黏液栓患兒病程2個(gè)月時(shí)肺炎吸收情況(肺炎吸收緩慢=1,肺炎完全吸收=0)為因變量,以發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞百分比、BALF中性粒細(xì)胞百分比為自變量納入多因素logistic回歸。分析結(jié)果顯示,較長(zhǎng)的發(fā)熱時(shí)間、較高的BALF中性粒細(xì)胞百分比是促進(jìn)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);較高的BALF巨噬細(xì)胞百分比是抑制肺炎吸收緩慢的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 影響MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.5發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比預(yù)測(cè)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的效能分析結(jié)果 ROC曲線分析結(jié)果顯示,發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞百分比、BALF中性粒細(xì)胞百分比均可有效預(yù)測(cè)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的發(fā)生情況(P<0.05),且三指標(biāo)聯(lián)合可進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)效能,靈敏度和特異度分別為89.00%、75.00%。見(jiàn)表6,圖1。

圖1 發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比預(yù)測(cè)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的ROC曲線圖

表6 發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比預(yù)測(cè)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

3.1氣道黏液栓是支氣管黏膜炎癥、壞死及黏液分泌異常、黏液排除障礙引起氣道內(nèi)積聚,結(jié)塊形成,其主要成分為黏液、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等。氣道黏液栓若清除不及時(shí),梗阻長(zhǎng)期存在,管壁壓力升高擴(kuò)張,可導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張、肺不張及閉塞性支氣管炎,嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命。支氣管鏡檢查及肺泡灌洗術(shù)對(duì)于清除氣道黏液栓及繼發(fā)性病變?nèi)缱枞苑窝子休^好的臨床效果。但MPP合并氣道黏液栓患兒支氣管鏡灌洗術(shù)后何時(shí)完全吸收及影響MPP合并氣道黏液栓患兒預(yù)后的因素尚不清楚。因此有必要深入研究MPP合并氣道黏液栓疾病機(jī)制,尋找能夠評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)志物,指導(dǎo)臨床診治。正常肺泡上皮細(xì)胞表面有一層肺上皮黏液層,具有維持肺泡表面張力及穩(wěn)定性的作用。對(duì)BALF中各細(xì)胞分類及炎癥因子進(jìn)行測(cè)定分析,可能有助于MPP合并氣道黏液栓患兒的預(yù)后評(píng)估。

3.2肺泡巨噬細(xì)胞存在于肺上皮黏液層中,具有豐富的溶酶體及吞噬體,能吞噬清除細(xì)菌、灰塵等顆粒,活化淋巴細(xì)胞,是機(jī)體防御功能的第一道防線。在肺部支原體、細(xì)菌等微生物感染時(shí),細(xì)菌代謝產(chǎn)物能夠激活肺泡巨噬細(xì)胞,分泌大量炎癥因子,巨噬細(xì)胞形成偽足,包裹致病菌形成吞噬體,在與溶酶體結(jié)合后,釋放消化致病菌的氧化酶和水解酶,殺死病原菌[13]。本研究中,MPP合并氣道黏液栓患兒BALF巨噬細(xì)胞百分比顯著減少,IL-4、IL-10水平降低,而IL-2、IL-8水平升高,表明巨噬細(xì)胞減少及炎癥因子平衡紊亂參與促進(jìn)MPP合并氣道黏液栓的疾病發(fā)生。有學(xué)者通過(guò)上皮鈉通道β亞基SCNN1B轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建氣道黏液栓模型,發(fā)現(xiàn)模型小鼠氣道表面液體脫水,上皮細(xì)胞大量分泌黏蛋白,巨噬細(xì)胞大量凋亡、數(shù)目減少,氣道中性粒細(xì)胞增多,促進(jìn)肺部炎癥的發(fā)展,氣道大量黏液栓形成[5]。筆者分析認(rèn)為,BALF巨噬細(xì)胞百分比減少的原因與Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡失調(diào)有關(guān)。MPP感染時(shí)由于支原體負(fù)荷較高,導(dǎo)致肺泡局部中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加,促進(jìn)大量炎癥因子,如IL-5分泌,其能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子,如IL-4、IL-10等,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致BALF中巨噬細(xì)胞百分比減少[14]。

3.3本研究中,MPP合并氣道黏液栓患兒BALF中性粒細(xì)胞百分比顯著增加,與BALF中炎癥因子表達(dá)有關(guān),提示中性粒細(xì)胞可能參與促進(jìn)MPP患兒氣道黏液栓的形成。研究表明,MPP感染時(shí),氣道黏膜上皮細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生粒細(xì)胞/單核細(xì)胞集落刺激因子,促進(jìn)大量中性粒細(xì)胞募集和活化,導(dǎo)致BALF中性粒細(xì)胞百分比增加[15]。此外,MPP患兒中性粒細(xì)胞募集活化后能夠促進(jìn)髓過(guò)氧化物酶分泌,引起肺組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生,加重肺組織炎癥及肺組織損傷,組織壞死脫落造成氣道黏液栓形成[15]。本研究中,肺炎吸收緩慢組MPP合并氣道黏液栓患兒BALF中性粒細(xì)胞百分比升高。有研究發(fā)現(xiàn),MPP中大量中性粒細(xì)胞激活,導(dǎo)致Th17細(xì)胞活化,分泌IL-17、IL-6、IL-8等促炎因子,降低巨噬細(xì)胞的黏液及微生物清除能力,加重肺部炎癥,導(dǎo)致黏液吸收緩慢[16]。這與本研究中MPP合并氣道黏液栓患兒BALF中性粒細(xì)胞百分比與IL-2、IL-8水平呈正相關(guān)的結(jié)果一致。因此,BALF中性粒細(xì)胞百分比升高可能參與了MPP患兒氣道黏液栓的形成,是評(píng)估患者預(yù)后的標(biāo)志物。

3.4MPP合并氣道黏液栓患兒臨床表現(xiàn)輕重不一,肺部炎癥吸收的時(shí)間也不同。本研究以病程2個(gè)月為預(yù)后評(píng)估的時(shí)間點(diǎn),結(jié)果78例MPP合并氣道黏液栓患兒中,肺炎吸收緩慢患兒有35例,占44.87%,與既往研究報(bào)道結(jié)果相似[17]。本研究中,較長(zhǎng)的發(fā)熱時(shí)間是影響MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。筆者分析,MP本身作為致熱源能夠誘導(dǎo)IL-2、IL-8等促炎因子的產(chǎn)生,使得肺組織損傷加重、肺組織壞死,導(dǎo)致肺炎吸收緩慢[18]。本研究中,BALF巨噬細(xì)胞百分比降低,中性粒細(xì)胞百分比升高是影響MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有學(xué)者在氣道黏液栓小鼠模型中發(fā)現(xiàn),肺泡巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子,如干擾素調(diào)控因子1過(guò)度表達(dá)能夠抑制單核巨噬細(xì)胞增殖,促進(jìn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、活化,加重脂多糖等因素誘導(dǎo)的肺組織損傷及肺炎疾病進(jìn)展,導(dǎo)致疾病恢復(fù)緩慢[19]。此外,BALF巨噬細(xì)胞百分比及巨噬細(xì)胞活性下降可導(dǎo)致CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值降低,機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂,抗感染免疫能力降低,導(dǎo)致MP不能被快速清除,大量中性粒細(xì)胞滲透至細(xì)支氣管及血管周圍,加重肺部組織炎癥,導(dǎo)致患兒即使經(jīng)積極治療后病情仍加重或遷延不愈[20]。ROC曲線分析結(jié)果顯示,發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞百分比、BALF中性粒細(xì)胞百分比三指標(biāo)聯(lián)合對(duì)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值,其靈敏度和特異度分別為89.00%、75.00%,優(yōu)于單一指標(biāo)。因此,臨床醫(yī)師可參考該模型對(duì)MPP合并氣道黏液栓患兒的臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,以制定個(gè)體化的治療措施,改善患兒預(yù)后。

綜上所述,MPP合并氣道黏液栓患兒BALF巨噬細(xì)胞百分比降低,中性粒細(xì)胞百分比升高,兩者與BALF中炎癥因子水平有關(guān),均參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。發(fā)熱時(shí)間、BALF巨噬細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比三指標(biāo)聯(lián)合對(duì)MPP合并氣道黏液栓患兒肺炎吸收緩慢具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值,有利于臨床醫(yī)師對(duì)患兒預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,指導(dǎo)臨床治療。但本研究也存在一定的不足,由于BALF中存在復(fù)雜的細(xì)胞成分,不同類型免疫細(xì)胞及同一種免疫細(xì)胞不同亞型也可能發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能,而且BALF中還存在其他細(xì)胞因子,如IL-17、IL-6等,其在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步深入研究。