宋鐵兵,李康樂,馬 強,趙穎林,趙 軍,謝 娟

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710021;2.西安大興醫(yī)院渭水園院區(qū),陜西 西安 710018)

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤,2018年全球新增病例約289萬例,死亡62.6萬人[1-2]。中醫(yī)稱乳腺癌為乳巖,發(fā)病原因為情志失調、飲食失節(jié)、沖任不調,患者在氣血虧虛的同時感受毒邪之氣,阻塞經絡,造成氣滯血瘀,日久痰核凝結,形成乳巖。目前,乳腺癌的治療主要依靠手術、化療、放療、內分泌和抗體治療[3]。三陰性乳腺癌占乳腺癌15%,由于治療方案有限,該型患者轉移率高,預后極差[4]。據清代趙學敏所編的《本草綱目拾遺》記載,古代有很多醫(yī)家單獨使用土貝母的塊莖來治療婦人乳癰、乳巖、癰疽及諸郁之癥,現仍被廣泛應用[5]。中藥土貝母味苦,性微寒,歸肺、脾經,有散結消毒、散癰腫的功效。近些年來大量研究表明,土貝母皂苷甲(Tubeimoside I,TBMS Ⅰ)是土貝母的主要活性成分,具有廣泛抗腫瘤活性[6]。

早期生長反應因子1(Early growth response 1,Egr1)是Egr轉錄因子家族成員,具有高度保守的GC的含量啟動子結合,Egr1受到多種細胞因子、神經遞質、激素、DNA損傷因子、其他壓力刺激,Egr1具有多種功能,可直接調節(jié)多種生物過程包括生長發(fā)育、細胞周期阻滯、分化、凋亡、癌癥等[7]。Egr1在細胞中被抑制后,300多個基因受到影響,包括轉錄因子、生長因子、細胞周期蛋白調節(jié)因子、結構蛋白[8]。p21是位于Egr1下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子,由于p21通過短暫或永久地誘導細胞周期阻滯來抑制癌細胞增殖,被認為是一種重要的腫瘤抑制劑,另外p21還能促進細胞分化、衰老,抑制基因轉錄和凋亡[9]。有研究發(fā)現,p21可被上游Egr1直接激活發(fā)揮作用[10]。本次研究在Egr1/p21信號通路的基礎上展開,通過土貝母皂苷甲體外干預人MCF-7細胞,探索其對人乳腺癌細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株:乳腺癌MCF-7細胞(貨號CL-0149,武漢普諾賽生命科技有限公司)傳至4～5代。

1.1.2 藥品及試劑:土貝母皂苷甲(純度≥98%,HPLC,CAS:102040-03-9);DMEM培養(yǎng)基(批號J180009,HyClone公司);胎牛血清(HyClone公司);青霉素-鏈霉素(批號15140-122,HyClone公司);胰酶0.25%(批號AD21573271,HyClone公司);CCK-8細胞增殖與毒性檢測試劑盒(批號20160406);DMSO(批號300490623);引物、RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒(批號9108)。

1.1.3 實驗儀器:生物顯微成像系統(tǒng)(Olympus公司);高速冷凍離心機(型號HC-3018R,科大創(chuàng)新股份有限公司);酶標儀(型號1510,Thermo公司);反轉錄儀(Eppendorf AG公司);qRT-PCR儀(型號Takara)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組:采用90%的DMEM基礎培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗,三者按比例混合均勻即為完全培養(yǎng)基。將復蘇或傳代后的MCF-7細胞放置于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),在每個25 cm2培養(yǎng)瓶中加4 ml完全培養(yǎng)基,將細胞培養(yǎng)瓶放置于5%的CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d換1次液,待細胞對數增長時,進行實驗。細胞分組:空白組、TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組。

1.2.2 土貝母皂苷甲溶液配制:精確稱量土貝母皂苷甲固體粉末3.20 mg,溶于20 ml完全培養(yǎng)基中,震蕩使完全溶解,得160 μg/ml的土貝母皂苷甲母液,放于冰箱4 ℃保存,備用。TBMS Ⅰ高劑量組濃度20 μg/ml、TBMS Ⅰ中劑量組濃度15 μg/ml、TBMS Ⅰ低劑量組濃度10 μg/ml。

1.2.3 細胞增殖檢測:取對數生長期的MCF-7細胞接種到96孔培養(yǎng)板上,每孔5×103個細胞,邊緣孔加入PBS溶液,防止實驗培養(yǎng)基揮發(fā)影響結果,每個實驗組設3個復孔,將96孔培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預細胞24 h,之后每個實驗孔加入20 μl的CCK-8試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,使用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值,根據OD值計算細胞存活率。重復上述步驟,藥物干預時間分別改為48 h和72 h,最后計算出對應干預時間的細胞存活率。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡:取對數生長期MCF-7細胞接種于6孔板,每孔5×105個細胞,將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預細胞48 h,之后收集培養(yǎng)基中的細胞,使用PBS溶液洗滌2次,消化,離心1000 r/min、5 min,對應收集細胞,加入400 μl 1×Binding Buffer將2次收集的細胞制備成細胞懸液;向細胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫條件,避光孵育15 min,再向其中加入10 μl的PI染色劑,混勻,避光冰浴5 min,在0.5 h內用流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期分布:取對數生長期MCF-7細胞接種于6孔板,每孔1×106個細胞,將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預細胞48 h,之后使用PBS溶液洗滌2次,消化,離心1000 r/min、5 min,收集細胞,使用PBS溶液將細胞濃度調整為1×106個/ml,取濃度為1×106個/ml的細胞懸液1 ml,離心2000 r/min、5 min,棄上清,加入500 μl的70%冷乙醇固定,4 ℃過夜,離心1000 r/min、5 min,棄冷乙醇固定液,加50 μl的RNase A 、450 μl的PI配置好的工作液,混勻,4 ℃避光放置0.5 h,用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Western blotting檢測Egr1、p21蛋白表達:待細胞培養(yǎng)瓶里的細胞呈對數生長時,并且細胞長至70%左右時,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預細胞48 h,棄掉培養(yǎng)基,加PBS溶液洗滌2次,消化,離心2000 r/min、5 min,收集細胞,按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白,隨后上樣每孔20 μg,電泳,轉膜,封閉過夜。次日,加入一抗,室溫孵育2 h,使用PBST溶液洗滌5次,加入二抗,室溫孵育2 h后,避光加入ECL發(fā)光液,顯影。

1.2.7 qRT-PCR檢測Egr1、p21 mRNA表達:待細胞培養(yǎng)瓶里的細胞呈對數生長時,并且細胞長至70%左右時,使用不同濃度土貝母皂苷甲干預細胞48 h,棄掉培養(yǎng)基,加PBS溶液洗滌2次,消化,離心2000 r/min、5 min,收集細胞,按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,使用核酸濃度測量儀測定總RNA濃度、純度,測定結果表明樣品OD260/OD280值均在1.8～2.1范圍之內,符合要求。取各樣品RNA 1 μg與5×Primer Script RT Master Mix、無菌無酶水組成10 μl反應體系,混勻,進行反轉錄。反應條件:先37 ℃、15 min,后85 ℃、反應5 s,將反轉錄產物cDNA放置于冰箱-20 ℃中保存?zhèn)溆?使用Thermal Cycler Dice Real Time System擴增儀,檢測目的基因相對表達。

2 結 果

2.1 各組MCF-7細胞存活率比較 見表1。土貝母皂苷甲干預MCF-7細胞24 h后,TBMS Ⅰ高劑量組對MCF-7細胞抑制作用最明顯。干預48 h后,TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組都能抑制MCF-7細胞活性。干預72 h,TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組能明顯抑制MCF-7細胞存活率,與48 h組內比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表1 各組MCF-7細胞存活率比較(%)

2.2 各組MCF-7細胞凋亡比較 土貝母皂苷甲能夠誘導MCF-7細胞凋亡,土貝母皂苷甲各劑量組與空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TBMS Ⅰ低劑量組對MCF-7細胞凋亡率10.9%、TBMS Ⅰ中劑量組20.4%、TBMS Ⅰ高劑量組31.9%,提示TBMS Ⅰ高劑量組對MCF-7細胞的凋亡效果最好。

2.3 各組對MCF-7細胞周期的影響 見表2(圖1)。土貝母皂苷甲干預MCF-7細胞48 h后,土貝母皂苷甲各劑量組G0/G1期細胞所占比率均減低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。48 h后土貝母皂苷甲各劑量組G2/M期細胞占比均增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組對MCF-7細胞周期影響比較

表2 各組對MCF-7細胞周期影響比較(%)

2.4 各組Egr1、p21蛋白表達比較 各組干預MCF-7細胞48 h后,土貝母皂苷甲各劑量組Egr1、p21蛋白表達均升高,見圖2。

2.5 各組Egr1、p21 mRNA表達比較 干預MCF-7細胞48 h后土貝母皂苷甲各劑量組Egr1、p21 mRNA表達量均高于空白組,且TBMS Ⅰ高劑量組Egr1、p21 mRNA表達量最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 各組MCF-7細胞Egr1、p21 mRNA比較

3 討 論

乳腺癌在中醫(yī)典籍中稱之為“乳巖”“乳疽”等,中醫(yī)藥在臨床治療乳腺癌已取得長足進展。土貝母皂苷甲具有廣泛的生物學活性,包括抗炎、抗病毒、免疫抑制作用[11]。土貝母皂苷甲對肝癌、肺癌、結直腸癌、乳腺癌等有抗癌作用[12]。土貝母皂苷甲可通過抑制NF-κB結合活性或Wnt/β-catenin信號通路,激活MAPK-JNK通路,促進蛋白酶體VEGFR2、Tie2降解,誘導細胞凋亡,抑制細胞增殖和轉移,抑制腫瘤血管生成[13-14]。

Egr1是一種由應激、損傷、絲裂原和分化誘導的即時早期反應基因,它調節(jié)多種基因表達,參與控制生長和凋亡,在各種人類癌癥中發(fā)揮抑癌作用[14]。p21是位于Egr1下游的重要靶基因,是一種細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)抑制劑,其功能在于誘導細胞周期阻滯[15]。有研究發(fā)現,Egr1通過轉錄調控其下游靶基因,尤其是參與細胞周期阻滯和凋亡的p21發(fā)揮抗癌作用[16]。同時有文章表明,作為下游靶基因p21過表達,影響乳腺癌細胞周期分化,促進乳腺癌細胞凋亡[17]。

本次研究結果表明土貝母皂苷甲可以促進乳腺癌MCF-7細胞中Egr1的表達,而Egr1通過上調下游靶基因,特別是參與細胞周期停滯和細胞凋亡的p21,從而誘導凋亡。本次研究表明,土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖,促進Egr1的表達,進而激活其下游靶基因p21表達,引起MCF-7細胞周期G2/M阻滯,誘導乳腺癌細胞MCF-7的凋亡。因此,土貝母皂苷甲對乳腺癌的作用機制很可能是通過激活Egr1/p21信號通路,發(fā)揮抗癌作用的。

同時本次研究僅從細胞層次探討土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖,分子生物學指標的改變?yōu)榕R床治療提供新的理論依據,但是通過此實驗的結果遠遠不能替代現代醫(yī)學治療乳腺癌的方案,僅對乳腺癌的治療提供新思路,根據此前團隊實驗[18-20],將進一步制定體內實驗方案,明確土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖更深層次的藥理學機制。