孫家官，瞿蓉蓉，孟偉民，崔俊偉，王志霞，宋 杰

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.青海省第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,青海 西寧 810000;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科,河南 衛(wèi)輝 453100)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染引起的慢性傳染性疾病,主要表現(xiàn)為肺結(jié)核,在致死性傳染病中居第2位[1]。早期診斷和及時治療是結(jié)核病防控的主要策略[2]。結(jié)核病診斷的主要依據(jù)是臨床癥狀和體征、影像學(xué)檢查、痰細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查等,其中痰培養(yǎng)和痰涂片鏡檢是世界衛(wèi)生組織推薦的診斷方法,但耗時長(2～8周)、陽性率低(14%～47%)[3]。因此,需要對Mtb感染過程的關(guān)鍵基因和重要生物學(xué)通路進(jìn)行研究,篩選結(jié)核病診斷與治療的新靶標(biāo),以期提高疾病的診治效率。本研究通過對肺結(jié)核患者進(jìn)展期和好轉(zhuǎn)期外周血進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息分析,篩選差異表達(dá)基因,探討其功能和生物學(xué)通路,并構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),以鑒定結(jié)核病免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因,為結(jié)核病的診斷和治療提供候選靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年7月至9月青海省第四人民醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》[4],根據(jù)臨床癥狀和體征、痰菌培養(yǎng)、抗酸染色以及影像學(xué)檢查確診肺結(jié)核。排除標(biāo)準(zhǔn):人類免疫缺陷病毒感染、妊娠、腫瘤、嚴(yán)重肝腎衰竭、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物者。共5例肺結(jié)核患者納入本研究,患者在初診時表現(xiàn)出典型的肺結(jié)核癥狀,如慢性咳嗽(5/5)、發(fā)熱(2/5)、胸痛(2/5)和夜間盜汗(1/5)。本研究已獲得醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn),患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血液樣本收集及轉(zhuǎn)錄組測序

分別于初診(進(jìn)展期)和抗結(jié)核治療6個月后(好轉(zhuǎn)期)[5]用PAXgene全血RNA管采集患者外周血,送至廣州基迪奧生物公司進(jìn)行RNA提取及測序。測序數(shù)據(jù)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾:(1)去除原始數(shù)據(jù)中帶有測序接頭的序列;(2)去除含N堿基比例大于10%的序列;(3)去除全部都是A堿基的序列;(4)去除低質(zhì)量序列(堿基識別錯誤率≤1%的堿基數(shù)占整條序列50%以上)。以每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目(fragments per kilo base of transcript per million fragments mapped,FPKM)計算基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,以差異倍數(shù)(fold change,FC)>2[即|Log2(FC)|>1]和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.05作為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 差異表達(dá)基因富集分析

應(yīng)用基因本體論(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(https://www.geneontology.org/)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析;應(yīng)用京都基因和基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行通路富集分析,以確定差異表達(dá)基因參與的重要生物代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

將差異表達(dá)基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫,以最低交互得分>0.4為顯著性閾值獲得差異表達(dá)基因之間的蛋白互作關(guān)系,并用Cytoscape 3.9.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。使用CytoHubba插件,采用最大團中心性(maximal clique centrality,MCC)算法,篩選排名前10的基因并作為關(guān)鍵基因。使用分子復(fù)合物檢測(molecular complex detection,MCODE)插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白復(fù)合物分析,參數(shù)設(shè)置如下:degree cutoff=2,node score cutoff=0.2,K-Core=2,Depth from Seed=100。

1.5 Mtb感染免疫調(diào)控關(guān)鍵基因的診斷效能評價

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE83456,選擇106個血液樣本進(jìn)行診斷效能的評估,包括45例肺結(jié)核患者樣本和61例健康對照樣本。利用R語言的pROC包繪制受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計算免疫調(diào)控關(guān)鍵基因診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度、曲線下面積(area under curve,AUC)及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)。

1.6 免疫浸潤分析

通過估計已知RNA轉(zhuǎn)錄本的相對子集識別細(xì)胞類型(cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts,CIBERSORT)進(jìn)行免疫浸潤分析以了解各類免疫細(xì)胞的豐度。CIBERSORT算法是基于已知的T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、靜息態(tài)和激活態(tài)的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞等22種免疫細(xì)胞參考集LM22,通過mRNA表達(dá)譜來定量評估樣本中免疫細(xì)胞亞型的相對比例的分析方法[6-7]。將差異表達(dá)基因譜上傳至CIBERSORT數(shù)據(jù)庫獲得各樣本22種免疫細(xì)胞的豐度值,通過主成分分析研究免疫細(xì)胞的浸潤差異。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選

根據(jù)|Log2(FC)|>1和FDR<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異分析,共篩選出187個差異表達(dá)基因,其中149個上調(diào),38個下調(diào),結(jié)果見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

2.2 差異表達(dá)基因的功能和富集通路分析

GO功能富集分析從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個方面對基因進(jìn)行注釋。生物過程主要富集于白細(xì)胞與細(xì)胞黏附及調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生、T細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)(圖2A);細(xì)胞組分主要富集于吞噬囊泡、溶細(xì)胞顆粒、T細(xì)胞受體復(fù)合物、特殊顆粒(次級顆粒)、三級顆粒(白明膠酶顆粒)(圖2B);分子功能主要富集于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰb受體活性、二氧化碳轉(zhuǎn)運復(fù)合體活性、MHCⅠ類蛋白復(fù)合物結(jié)合受體、MHCⅠ類受體活性、銨跨膜轉(zhuǎn)運體活性(圖2)。KEGG富集分析顯示,差異表達(dá)的基因主要涉及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)1/Th2細(xì)胞分化、瘧疾、Th17細(xì)胞分化、凋亡等信號通路,結(jié)果見圖3。

A:生物學(xué)過程;B:細(xì)胞組分;C:分子功能。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG functional enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析和關(guān)鍵基因篩選

根據(jù)蛋白相互作用分析的數(shù)據(jù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò), PPI網(wǎng)絡(luò)包含75個節(jié)點(nodes),398條邊(edges),平均聚集度(degree)為5.3,PPI富集P<1.0 × 10-16,結(jié)果見圖4A。MCC得分居前10位的基因分別是穿孔素-1(perforin-1,PRF-1)、白細(xì)胞分化抗原2(clusters of differentiation 2,CD2)、白細(xì)胞分化抗原247(clusters of differentiation 247,CD247)、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體D1(killer cell lectin like receptor D1,KLRD1)、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體B1(killer cell lectin like receptor B1,KLRB1)、自然殺傷細(xì)胞顆粒蛋白7(natural killer cell granule protein 7,NKG7)、顆粒溶素(granulysin,GNLY)、T-box轉(zhuǎn)錄因子21(T-box transcription factor 21,TBX21)、白細(xì)胞介素2受體亞基β(interleukin 2 receptor subunit beta,IL2RB)、顆粒酶H(granzyme H,GZMH),結(jié)果見表1。

利用Cytoscape軟件的MCODE插件鑒定出的蛋白復(fù)合體包含上調(diào)的11個基因,84條邊,平均聚集度為7.6。11個上調(diào)的基因為殺傷細(xì)胞凝集素樣受體F1(killer cell lectin like receptor F1,KLRF1)、GNLY、KLRB1、白細(xì)胞分化抗原7(clusters of differentiation 7,CD7)、CD247、IL2RB、NKG7、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體K1(killer cell lectin like receptor K1,KLRK1)、KLRD1、TBX21、GZMH。KEGG分析發(fā)現(xiàn),該11個基因主要涉及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、Th1/Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化(圖4B)。

2.4 關(guān)鍵基因診斷效能評估

KLRB1診斷肺結(jié)核的AUC為0.855 4(95%CI:0.783 2～0.927 6),敏感度為82.22%,特異度為75.41%;CD2診斷肺結(jié)核的AUC為0.835 7(95%CI:0.757 8～0.913 6),敏感度為62.22%,特異度為91.80%;CD247診斷肺結(jié)核的AUC為0.865 9(95%CI:0.795 9～0.935 9),敏感度為73.33%,特異度為86.89%。結(jié)果見圖5。

圖5 KLRB1、CD2和CD247的ROC曲線分析結(jié)果Fig.5 ROC curve analysis results of KLRB1,CD2 and CD247

2.5 免疫浸潤分析

免疫細(xì)胞浸潤的主成分分析結(jié)果顯示,結(jié)核進(jìn)展過程中免疫細(xì)胞浸潤模式存在明顯的群體異質(zhì)性,治療前的進(jìn)展期主要由嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞發(fā)揮抗結(jié)核作用,治療后的好轉(zhuǎn)期主要是由CD8+和CD4+T細(xì)胞、Th細(xì)胞等適應(yīng)性免疫細(xì)胞以及激活的NK細(xì)胞發(fā)揮抗結(jié)核作用(圖6)。22種免疫細(xì)胞浸潤豐度分析顯示,單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在免疫微環(huán)境中的豐度最高(圖7)。好轉(zhuǎn)期記憶B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞的豐度顯著降低,而幼稚B細(xì)胞、靜息態(tài)CD4+記憶T細(xì)胞、靜息態(tài)NK細(xì)胞、激活態(tài)NK細(xì)胞的豐度顯著升高(P<0.05)。

圖6 免疫細(xì)胞浸潤模式的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of immune cell infiltration patterns

圖7 免疫細(xì)胞浸潤豐度差異分析箱式圖Fig.7 Box plot of the abundance difference analysis in immune cell infiltration

3 討論

結(jié)核病是由Mtb感染引起的慢性呼吸道傳染性疾病,胞內(nèi)寄生的特性使其與其他細(xì)菌感染不同,可能具有獨特的感染與免疫調(diào)控機制。本研究的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示Mtb感染清除后,149個基因表達(dá)上調(diào),38個基因表達(dá)下調(diào)。GO分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因參與白細(xì)胞與細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生等免疫過程,參與吞噬囊泡、溶細(xì)胞顆粒、T細(xì)胞受體復(fù)合物、中性粒細(xì)胞顆粒(特殊顆粒和三級顆粒)等細(xì)胞組分形成,編碼的蛋白主要與MHCⅠ類分子活性以及二氧化碳和銨轉(zhuǎn)運體等分子功能相關(guān)。KEEG信號通路主要富集在NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、Th1/Th2及Th17細(xì)胞分化和凋亡信號通路。同時,富集分析結(jié)果也提示,中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過形成吞噬囊泡、釋放溶細(xì)胞顆粒產(chǎn)生細(xì)胞毒作用以及Th細(xì)胞分化參與抗Mtb感染過程。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析,篩選得到結(jié)核病免疫調(diào)控的10個關(guān)鍵基因,可分為2類:細(xì)胞毒性相關(guān)基因PRF1、GZMH、GNLY、KLRD1、KLRB1、NKG7、TBX21和T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CD2、CD247、IL2RB。PRF1、GZMH和GNLY是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)和NK細(xì)胞分泌的溶細(xì)胞顆粒,是CTL和NK細(xì)胞清除胞內(nèi)寄生病原體的效應(yīng)分子,它們的抗結(jié)核保護效應(yīng)已被確認(rèn)[8-9]。KLRD1、KLRB1是殺傷細(xì)胞凝集素樣受體家族成員,是NK細(xì)胞表面識別MHCⅠ類分子的調(diào)節(jié)性受體。NKG7是Th1細(xì)胞相關(guān)蛋白,抑制Th2轉(zhuǎn)錄過程,調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性顆粒胞吐作用和炎癥反應(yīng)[10]。TBX21是Th1相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因,編碼的轉(zhuǎn)錄因子T-bet不僅促進(jìn)Th1特征性細(xì)胞因子干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)的表達(dá),而且也能抑制Th2特征性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4的產(chǎn)生,即T-bet在促進(jìn)Th1細(xì)胞分化的同時也阻斷或抑制Th2細(xì)胞分化。因此,有研究將T-bet作為基于Ag85B DNA疫苗的佐劑[11-12]。有研究報道,在Mtb感染早期,NK細(xì)胞和T細(xì)胞特異性基因KLRD1、NKG7、TBX21表達(dá)的下調(diào)與結(jié)核病進(jìn)展有關(guān)[13]。而本研究發(fā)現(xiàn),在清除Mtb后,KLRD1、NKG7和TBX21表達(dá)上調(diào);這說明,KLRD1、NKG7和TBX21的表達(dá)狀態(tài)影響著結(jié)核病的進(jìn)展。CD247、CD2、IL2RB是T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因,CD247編碼的CD3-ζ鏈參與T細(xì)胞活化第一信號的傳導(dǎo),CD2參與介導(dǎo)T細(xì)胞旁路激活途徑和T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的黏附,IL2RB編碼的IL-2受體β鏈通過STAT、MAPK、PI3K等途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、分化[14-16]。本研究通過MCODE模塊分析鑒定出結(jié)核病的關(guān)鍵蛋白復(fù)合體由11個蛋白構(gòu)成,其中CD247、IL2RB、KLRB1、NKG7、GNLY、GZMH、TBX21同時也是Cytohubba篩選出來的關(guān)鍵基因。KEGG分析發(fā)現(xiàn),該蛋白復(fù)合體參與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和Th1/Th2及Th17細(xì)胞的分化。免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn),在Mtb感染的進(jìn)展期,NK細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與的固有免疫發(fā)揮著抗結(jié)核作用;在好轉(zhuǎn)期,NK細(xì)胞參與的固有免疫和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫共同發(fā)揮著抗結(jié)核作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析和免疫浸潤分析的結(jié)果表明,PRF1、GZMH、GNLY、KLRD1、KLRB1、NKG7、TBX21等細(xì)胞毒性相關(guān)基因,以及CD2、CD247、IL2RB等T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)隨著結(jié)核病的進(jìn)程發(fā)生改變,固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與抗結(jié)核感染免疫。研究報道,Mtb感染早期,NK細(xì)胞分泌溶細(xì)胞顆粒,M1型巨噬細(xì)胞形成吞噬囊泡,中性粒細(xì)胞分泌含有溶菌酶和吞噬素的特殊顆粒,從而殺傷被感染的細(xì)胞;在Mtb感染12～20 d后,Th1細(xì)胞的適應(yīng)性免疫反應(yīng)成為主要抗結(jié)核免疫機制,Th1誘導(dǎo)CTL分化,通過穿孔素/顆粒酶途徑殺傷靶細(xì)胞[17-18]。Th17細(xì)胞也參與保護性免疫反應(yīng),Th17細(xì)胞分泌IL-17募集中性粒細(xì)胞和調(diào)節(jié)趨化因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19-20]。值得注意的是,NKG7和TBX21在促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的同時,也會抑制初始CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。這種Th1/Th2細(xì)胞分化失衡的現(xiàn)象在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。有研究報道,Th1細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α等,促進(jìn)細(xì)胞免疫,消除感染源;而Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和TGF-β,抑制Th1介導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答,Th2細(xì)胞分化通常被認(rèn)為是Mtb的一種免疫逃避形式[21-22]。

4 結(jié)論

本研究通過對肺結(jié)核患者疾病進(jìn)展過程中的外周血進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息分析,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性相關(guān)基因PRF1、KLRD1、KLRB1、NKG7、GNLY、TBX21、GZMH和T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CD2、CD247、IL2RB是結(jié)核病進(jìn)展過程中免疫調(diào)控的關(guān)鍵基因,通過表達(dá)免疫調(diào)控分子產(chǎn)生一系列的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與機體抵御Mtb的侵襲過程,這有望成為結(jié)核診斷和治療的候選靶標(biāo)。但本研究主要對小樣本量肺結(jié)核患者的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,也未將結(jié)核病和其他疾病進(jìn)行對比研究,因此,篩選出的關(guān)鍵基因僅能作為結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測的候選生物標(biāo)志物,這為后續(xù)研究提供靶標(biāo),但應(yīng)用于臨床實踐尚需大樣本量的分子生物學(xué)實驗以驗證其可靠性。