王 婧，段世超

(1.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450003;2.河南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,河南 鄭州 450003)

臨床上有一部分行輔助生殖助孕的不孕患者,其年齡<40歲、接受≥3個胚胎移植周期、累計移植≥4枚優(yōu)質(zhì)胚胎但未能成功妊娠,這類患者被診斷為反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure,RIF)。子宮內(nèi)膜容受性與RIF患者的妊娠結(jié)局密切相關(guān)[1]。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)能夠調(diào)節(jié)RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性,促進胚胎種植,改善妊娠結(jié)局,但其具體作用機制較復(fù)雜[2]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)通過影響胚胎種植窗期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的蛻膜形態(tài)調(diào)節(jié)胚胎著床,LIF表達(dá)水平越高,子宮內(nèi)膜容受性越好,胚胎著床成功率越高,因此,LIF是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子,檢測子宮內(nèi)膜中LIF表達(dá)水平可以反映子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)[3]。基于此,本研究通過在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型,觀察HCG干預(yù)后子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液中LIF表達(dá)的變化,探討HCG對RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的影響,旨在為HCG改善RIF患者妊娠結(jié)局的臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2015年1月至2022年12月在河南省人民醫(yī)院行輔助生殖助孕的20例RIF患者為子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本的來源對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡20～40歲;(2)不孕年限≥ 1 a;(3)體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)18～24 kg·m-2;(4)血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)<15 IU·L-1。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)子宮內(nèi)膜結(jié)核患者;(2)子宮內(nèi)膜異位癥患者;(3)存在宮腔積液;(4)存在直徑≥ 5 cm的子宮肌瘤。同時選擇40枚相同時間段行輔助生殖助孕并成功分娩、已無生育需求患者的實驗室凍存胚胎為廢棄胚胎標(biāo)本的來源對象。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2022-182號),患者自愿簽署胚胎廢棄知情同意書。實驗結(jié)束后,按照實驗室胚胎廢棄相關(guān)規(guī)定處理標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器

達(dá)爾伯克改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、膠原酶、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、雌激素(estrogen,E2)、孕激素(progesterone,P)、HCG購自上海晶抗生物工程有限公司,LIF一抗及二抗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、增強電化學(xué)發(fā)光(enhanced electrochemical luminescence,ECL)試劑購自上海妙一生物技術(shù)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)

用一次性無菌子宮內(nèi)膜取樣器采集20例RIF患者月經(jīng)第14天的子宮內(nèi)膜組織。在無菌操作臺用解剖鑷剪碎子宮內(nèi)膜組織,用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U·L-1青鏈霉素的DMEM洗滌3次,迅速移入含1 g·L-1膠原酶的離心管中,37 ℃消化2 h,加入DMEM終止消化,2 000 r·min-1離心5 min;棄上清,收集細(xì)胞懸液,計數(shù)細(xì)胞密度,按1×108L-1接種于60 mm3培養(yǎng)皿,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞聚合度超過95%時,加入胰蛋白酶消化傳代,2 000 r·min-1離心5 min;靜置后收集沉淀物,加入細(xì)胞冷凍保護液混懸后分別置于1～20號凍存管中,置于液氮中保存?zhèn)溆肹4]。

1.3.2 子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型的構(gòu)建

參照YU等[5]的方法構(gòu)建40個子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型:從液氮中取出20個凍存管,立即置于37 ℃水浴箱中,完全解凍后,將每個凍存管的細(xì)胞懸液分成2份,分裝至40個含5 mL DMEM的離心管中,2 000 r·min-1離心5 min;收集40份細(xì)胞懸液,計數(shù)細(xì)胞密度,按每孔1×108L-1接種于10個4孔板中,每孔加入5 mL含有子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞懸液;同時,每孔加入2 mL子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液(含1 mg·L-1E2和10 mg·L-1P的 DMEM)和1枚復(fù)蘇解凍成功的實驗室廢棄胚胎,然后將其分為子宮內(nèi)膜-胚胎-HCG共培養(yǎng)組(試驗組)和子宮內(nèi)膜-胚胎共培養(yǎng)組(對照組),每組20個共培養(yǎng)模型,均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1天(D1),試驗組加入1 mL HCG(1 mg·L-1),對照組加入1 mL子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液(含 1 mg·L-1E2和10 mg·L-1P),連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3.3 試驗組和對照組培養(yǎng)液的收集

培養(yǎng)過程中,分別收集培養(yǎng)D1、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)試驗組和對照組培養(yǎng)液各1 mL,平均分成2份,每份0.5 mL,加入細(xì)胞冷凍保護液混懸后置于凍存管中,-20 ℃凍存。

另于培養(yǎng)D7收集試驗組培養(yǎng)液5 mL,按每孔1×108L-1細(xì)胞密度接種于5孔板中,每孔1 mL,將5孔板分為陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組,分別加入0、1、2、4、5 mg·L-1HCG 1 mL;同時收集對照組培養(yǎng)液5 mL,按每孔1×108L-1細(xì)胞密度接種于5孔板中,每孔1 mL,將5孔板分為陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,分別加入含0、1、2、4、5 mg·L-1E2和0、10、20、40、50 mg·L-1P的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL;以上各組均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d,分別收集試驗組中各組及對照組中各組培養(yǎng)液各1 mL,平均分成2份,每份0.5 mL,加入細(xì)胞冷凍保護液混懸后置于凍存管中,-20 ℃凍存。

1.3.4 ELISA法檢測不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平

分別取D1、D3、D5、D7試驗組和對照組凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,3 000 r·min-1離心15 min,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書方法檢測LIF水平,顯色后,應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測LIF在 450 nm波長處的吸光度值,根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算LIF水平。

1.3.5 Western blot法檢測不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中的LIF蛋白相對表達(dá)量

分別取D1、D3、D5、D7試驗組和對照組凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,用預(yù)冷的PBS重懸,加入裂解液于冰上裂解30 min,12 000 r·min-1離心 15 min;取上清液,采用BCA法測定蛋白濃度,每孔上樣30 μg蛋白,100 ℃煮沸5 min,進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;采用轉(zhuǎn)膜儀在250 mA條件下濕法轉(zhuǎn)膜100 min,脫脂奶粉封閉 2 h;加入LIF一抗(滴度為11 000),4 ℃孵育過夜,洗膜3次,每次5 min;加入LIF二抗(滴度為 15 000),室溫孵育2 h,洗膜3次,每次5 min;采用ECL試劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白灰度值,以目的蛋白灰度值與β-actin內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 ELISA法檢測不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后的試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平

分別取試驗組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組以及對照組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組的凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中的LIF,操作步驟同“1.3.4”項。

1.3.7 Western blot法檢測不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后的試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量

分別取試驗組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組以及對照組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組的凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,采用Western blot法檢測培養(yǎng)液中的LIF蛋白相對表達(dá)量,操作步驟同“1.3.5”項。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較

D1、D3、D5、D7時,試驗組培養(yǎng)液中LIF水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。試驗組和對照組D3、D5、D7時培養(yǎng)液中LIF水平均高于D1時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);試驗組和對照組D5、D7時培養(yǎng)液中LIF水平均高于D3時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);試驗組和對照組D7時培養(yǎng)液中LIF水平均高于D5時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較Tab.1 Comparison of the level of LIF protein in culture medium between the experimental group and thecontrol group at different culture time

2.2 不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較

D1、D3、D5、D7時,試驗組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。試驗組和對照組D3、D5、D7時培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D1時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);試驗組和對照組D5、D7時培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D3時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);試驗組和對照組D7時培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D5時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1和表2。

圖1 不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of LIF protein in culture medium in the experimental group and the control group at different culture time

表2 不同培養(yǎng)時間試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of the relative expression of LIF protein in culture medium between the experimental group and the control group at different culture time

2.3 不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較

對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組培養(yǎng)液中LIF水平分別為(23.78±1.97)、(23.69±1.99)、(23.72±1.99)、(23.71±2.01)、(23.72±1.92)mg·L-1。對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組各組之間培養(yǎng)液中LIF水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。試驗組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平分別為(30.29±3.55)、(31.69±0.69)、(32.86±0.85)、(34.93±0.82)、(37.65±0.73)mg·L-1。試驗組 1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于1 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于2 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于 4 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。試驗組陰性未干預(yù)組培養(yǎng)液中LIF水平高于對照組陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 1 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后試驗組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較

對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量分別為0.33±0.01、0.33±0.01、0.34±0.01、0.34±0.01、0.34±0.01。對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組各組之間培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。試驗組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量分別為0.87±0.02、1.01±0.02、1.39±0.03、1.67±0.04、2.03±0.03。試驗組1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于1 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于2 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于4 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。試驗組陰性未干預(yù)組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于對照組陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。1 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

A1:試驗組陰性未干預(yù)組;A2:試驗組1 mg·L-1 HCG組;A3:試驗組2 mg·L-1 HCG組;A4:試驗組4 mg·L-1 HCG組;A5:試驗組5 mg·L-1 HCG組;B1:對照組陰性未干預(yù)組; B2:對照組1 mg·L-1 E2+10 mg·L-1 P組;B3:對照組2 mg·L-1 E2+20 mg·L-1 P組;B4:對照組4 mg·L-1 E2+40 mg·L-1 P組;B5:對照組5 mg·L-1 E2+50 mg·L-1 P組。

3 討論

輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展為眾多不孕患者解決了生育難題,但部分不孕患者經(jīng)歷多次胚胎移植仍然未能獲得臨床妊娠,這類患者被稱為RIF[6]。子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎種植和妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素,RIF患者想要獲得良好的妊娠結(jié)局,必須改善其子宮腔內(nèi)環(huán)境,提高子宮內(nèi)膜容受性[7]。因此,如何提高RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性是輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點和難點。

HCG是胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種二聚體糖蛋白激素,是影響胚胎種植的關(guān)鍵信號分子[8]。有研究表明,HCG能夠調(diào)節(jié)RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性,可能通過以下途徑發(fā)揮作用:HCG通過自分泌方式促進滋養(yǎng)細(xì)胞的分化,啟動及控制胚胎種植前分泌絨毛的侵襲性,增加自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量,加速滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的浸潤,促進子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子、Ki67等因子的表達(dá),改善子宮腔內(nèi)環(huán)境[9];同時,HCG通過旁分泌方式作用于子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞表面受體,促進子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞歸巢,延遲子宮內(nèi)膜蛻膜化進程,減少子宮內(nèi)膜蠕動,加速子宮內(nèi)膜增殖,提高子宮內(nèi)膜容受性,改善妊娠結(jié)局[10]。LIF是子宮內(nèi)膜與胚胎間傳遞信息的關(guān)鍵因子,在胚胎種植過程中,LIF能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境,抑制嚴(yán)重炎癥反應(yīng),促進子宮內(nèi)膜血管生成,豐富子宮內(nèi)膜血流供應(yīng),增加胚胎與子宮內(nèi)膜表面的黏附能力,提高胚胎侵襲力和種植力,促進胚胎種植[11]。LIF同時也是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子,檢測子宮內(nèi)膜中LIF的分泌和表達(dá)能夠監(jiān)測子宮內(nèi)膜容受性的變化,反映子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài)[12]。本研究以此為背景,采用體外培養(yǎng)的方法,通過在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型,觀察HCG干預(yù)后子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液中LIF表達(dá)的變化,探討HCG對RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的影響。

AGHAJANZADEH等[13]研究發(fā)現(xiàn),HCG能夠調(diào)控RIF患者種植窗期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相關(guān)信號通路的開放,激活大量子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)信號因子的釋放,上調(diào)LIF蛋白的表達(dá),提高子宮內(nèi)膜容受性,促進胚胎種植。胚胎種植發(fā)生于女性正常月經(jīng)周期排卵后6～7 d,故本研究選取RIF患者月經(jīng)第14天的子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,并以子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型建立后培養(yǎng)D1至D7天為檢測LIF表達(dá)的時間點,與胚胎種植窗期的時間點相吻合。本研究結(jié)果顯示,在培養(yǎng)D1、D3、D5、D7時,試驗組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組;說明,HCG能夠激活子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相關(guān)信號通路,促進子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞短暫、瞬間性分泌大量LIF;而對照組因為缺少HCG,無法有效調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路,子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞無法迅速傳遞關(guān)鍵信息,導(dǎo)致LIF的分泌和表達(dá)低于試驗組。以上結(jié)果提示,HCG對RIF患者LIF的分泌和表達(dá)具有促進與誘導(dǎo)作用,HCG通過促進LIF的高分泌表達(dá),提高子宮內(nèi)膜容受性,與AGHAJANZADEH等[13]的研究結(jié)果相符。子宮內(nèi)膜中LIF的分泌和表達(dá)水平能夠反映子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài),LIF表達(dá)水平越高,子宮內(nèi)膜容受性越好。本研究發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間增加,試驗組和對照組LIF水平和蛋白相對表達(dá)量均逐漸增加,在培養(yǎng)D7時最高,說明種植窗期LIF的分泌和表達(dá)呈現(xiàn)逐步升高趨勢,子宮內(nèi)膜容受性在種植窗期D7時達(dá)到最佳狀態(tài),這與BALAKIER等[14]研究發(fā)現(xiàn)的女性正常月經(jīng)周期中排卵后6～7 d子宮內(nèi)膜容受性最好、最利于胚胎著床的結(jié)論是一致的。

REZAEE等[15]研究顯示,RIF患者胚胎移植前行宮腔灌注HCG治療,使用不同水平HCG可以獲得不同的妊娠結(jié)局。ALSBJERG等[16]研究發(fā)現(xiàn),RIF患者胚胎移植前行宮腔灌注HCG治療可以提高胚胎種植率,宮腔灌注液中的HCG水平與RIF患者的胚胎種植率及子宮內(nèi)膜容受性具有一定正向相關(guān)性,相對于低水平HCG,高水平HCG對子宮內(nèi)膜容受性的改善作用更加明顯。本研究選取LIF水平和蛋白相對表達(dá)量最高、子宮內(nèi)膜容受性最好的D7培養(yǎng)液,觀察HCG水平對LIF表達(dá)及子宮內(nèi)膜容受性的影響,結(jié)果顯示,隨著HCG濃度的增加,試驗組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量逐漸升高;而隨著E2和P水平的增加,對照組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量無明顯變化;說明,HCG水平與子宮內(nèi)膜LIF的分泌和表達(dá)密切相關(guān),在子宮內(nèi)膜容受性達(dá)到最佳狀態(tài)時,一定程度上增加HCG水平,能夠進一步啟動LIF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),LIF的分泌和表達(dá)在原有基礎(chǔ)上可以繼續(xù)增加;而繼續(xù)增加E2和P水平并不能增加LIF的分泌和表達(dá)。此結(jié)果與ALSBJERG等[16]的研究結(jié)果相符。以上結(jié)果提示,HCG水平對LIF的分泌和表達(dá)呈現(xiàn)促進作用,可以嘗試增加RIF患者的HCG水平以進一步提高其子宮內(nèi)膜容受性。

4 結(jié)論

在體外共培養(yǎng)條件下,HCG能夠促進RIF患者子宮內(nèi)膜LIF的分泌和表達(dá),提高RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性。臨床工作中,RIF患者可以嘗試應(yīng)用HCG提高胚胎種植率,改善妊娠結(jié)局。但本研究尚有一定局限性:本研究僅發(fā)現(xiàn)LIF的分泌和表達(dá)具有一定的HCG濃度依賴性,對于HCG提高RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的最佳濃度以及改善RIF患者妊娠結(jié)局的更多作用機制尚需在后期工作中進一步研究。