倪慕蘭 李燕維 劉 斌

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福鼎醫(yī)院病理科,福建省福鼎市 355200

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性的皮膚炎癥性病變。其發(fā)病機制尚未明確,目前認(rèn)為主要與遺傳和異常免疫應(yīng)答有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清IL-13水平升高,可能在AD的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[1]。IL-13發(fā)揮生物學(xué)功能是通過與相應(yīng)受體相結(jié)合形成受體復(fù)合物后,促使下游基因轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。本研究采用免疫組化方法,檢測IL-13的特異性受體(IL-13Ra1和IL-13Ra2)在AD患者皮損區(qū)、非皮損區(qū)和正常人皮膚組織中的表達(dá),以進(jìn)一步探討其在發(fā)病機制中的作用及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 依據(jù)Hanifin-Rajkal診斷標(biāo)準(zhǔn),選取我院門診確診的35例AD患者作為觀察對象,其中21例為進(jìn)行期,14例為靜止期。男18例,女17例;年齡12～85歲,平均年齡(27±12.7)歲。所選病例在皮膚活檢時至少2個月以上未用過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥等相關(guān)治療。對照組15例正常人皮膚標(biāo)本選用非皮膚病變手術(shù)切除皮膚組織,其中男8例,女7例;年齡20～64歲,平均年齡(32±11.3)歲。

1.2 取材及標(biāo)本處理 每例AD患者于典型皮損區(qū)以及至少距離5cm外觀無異常處(作為非皮損區(qū))分別取活檢;15例正常人皮膚組織標(biāo)本選用整形手術(shù)等非皮膚病變手術(shù)切除皮膚組織。選取組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水浸蠟,石蠟包埋。

1.3 實驗方法 石蠟包埋標(biāo)本常規(guī)切片HE染色后由兩位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行重新核定。3μm厚連續(xù)切片,采用EnVision兩步法染色,具體操作步驟嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行,用PBS代替一抗作陰性對照,用已知陽性組織切片作陽性對照。兔抗人IL-13Ra1多克隆抗體及兔抗人IL-13Ra2多克隆抗體均購自abcam公司。免疫組化EnVision試劑盒及其他試劑購自DAKO公司。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) IL-13Ra1及IL-13Ra2均以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。采用雙盲法依據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強度進(jìn)行半定量評估:先按陽性細(xì)胞比例將無、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0～4分;再按染色強度將無、弱、中、強分別計為0～3分,其中不著色0分,黃色1分,棕黃色2分,黃褐色3分;將兩項得分相乘后得0～2分為(-),3～5分為(+),6～9分為(++),10～12分以上為(+++);其中-～+判定為陰性,++～+++判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和處理。組間表達(dá)差異采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-13Ra1和IL-13Ra2在正常人及AD患者皮膚組織中的表達(dá) 二者在正常人皮膚及AD患者非皮損區(qū)僅于基底層部分角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿內(nèi)見少量表達(dá)(見圖1),在AD患者皮損區(qū)的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿內(nèi)強表達(dá),且IL-13Ra1和IL-13Ra2陽性表達(dá)范圍擴大到表皮全層以及真皮乳頭層(見圖2～3)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:IL-13Ra1在AD患者皮損區(qū)中陽性率為88.6%(31/35),IL-13Ra2在AD患者皮損區(qū)中陽性率為80.0%(28/35),二者非皮損區(qū)和正常人皮膚相比呈顯著表達(dá)高(P<0.01);在非皮損區(qū)和正常人皮膚之間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

圖1 IL-13Ra1在正常人皮膚基底層部分角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿內(nèi)低表達(dá)(IHC×200)

圖2 IL-13Ra1在AD患者皮損區(qū)的表皮全層以及真皮乳頭層強表達(dá)(IHC×200)

圖3 IL-13Ra2在進(jìn)行期AD患者皮損區(qū)的表皮全層以及真皮乳頭層強表達(dá)(IHC×200)

表1 IL-13Ra1及IL-13Ra2在AD患者皮損區(qū)、非皮損區(qū)和正常人皮膚組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 進(jìn)行期和靜止期AD患者皮損區(qū)IL-13Ra1和IL-13Ra2的表達(dá) IL-13Ra2在進(jìn)行期AD皮損區(qū)陽性表達(dá)率為95.2%(20/21),而靜止期AD皮損區(qū)為57.1%(8/14),IL-13Ra2在進(jìn)行期AD的表達(dá)高于靜止期(P<0.05);而IL-13Ra1在進(jìn)行期和靜止期AD皮損區(qū)中表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 IL-13Ra1及IL-13Ra2在進(jìn)行期和靜止期AD患者皮損區(qū)中的表達(dá)

3 討論

AD可發(fā)生于各個年齡段,其中以兒童發(fā)病率最高,主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的瘙癢、皮膚干燥和濕疹[2]。進(jìn)行期AD患者常有明顯的瘙癢癥狀,且病情反復(fù)遷延難愈,從而嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和身心健康。AD的發(fā)病機制尚未明確,已報道輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1/ Th2功能失衡導(dǎo)致的異常免疫應(yīng)答是其發(fā)病的重要原因,也就是Th2 型炎癥是AD的基本特征[3]。進(jìn)一步研究指出IL-13作為一種由活化的CD4+Th2分泌的多效細(xì)胞因子,與其受體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)下游信號通路,抑制Th1 細(xì)胞分化、誘導(dǎo)IgE合成,在AD患者皮損形成中的起關(guān)鍵作用。在進(jìn)行期AD患者的皮損中,IL-13優(yōu)先使得Th2 細(xì)胞聚集,參與AD發(fā)病;在靜止期,IL-13則與IFN-r產(chǎn)生協(xié)同作用,使得慢性炎癥細(xì)胞在真皮層聚集,從而導(dǎo)致AD的慢性化[4]。

IL-13生物學(xué)功能的基礎(chǔ)是與特異性受體結(jié)合,即與IL-13Ra1或IL-13Ra2結(jié)合并與IL-4Ra、IL-2Rr共同組成受體復(fù)合物。目前對IL-13特異性受體的報道相對較少,IL-13Ra1和IL-13Ra2屬于促紅細(xì)胞生成素受體家族中的異源二聚體受體,與IL-13特異性結(jié)合后,激活STAT6信號途徑促使下游基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化,參與AD發(fā)病和疾病進(jìn)展[5]。Wongpiyabovorn等[6]在6例AD患者皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-13受體mRNA的過表達(dá),并檢測出STAT6通路的激活和多種促Th2分化因子的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致免疫失衡介導(dǎo)AD皮損的形成。本研究通過特異性抗體,采用免疫組化方法明確了IL-13Ra1和IL-13Ra2受體蛋白在皮膚中表達(dá)的表達(dá)模式:少量表達(dá)在正常皮膚和AD患者非皮損區(qū)基底層角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿內(nèi),而在AD患者皮損區(qū)的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿內(nèi)強表達(dá),并且表皮全層以及真皮乳頭層均檢測出受體表達(dá)。IL-13Ra1和IL-13Ra2受體蛋白在皮損區(qū)表達(dá)強度的增加和表達(dá)范圍的擴大,提示IL-13受體蛋白其在AD皮損形成中發(fā)揮重要的作用。在進(jìn)一步的實驗分析中,筆者發(fā)現(xiàn)IL-13Ra2在進(jìn)行期AD皮損區(qū)陽性表達(dá)高于靜止期,提示IL-13Ra2與AD疾病活動相關(guān)。IL-13Ra2是一種調(diào)節(jié)型的受體,當(dāng)受到IFN-r等刺激因子后可以迅速地轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上,增強IL-13的信號轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)Th2型炎癥的發(fā)生[7]。由此推測,IL-13Ra2可作為免疫學(xué)指標(biāo)反映病人的疾病活動性,也提出作為AD進(jìn)行期藥物治療的一個新靶點的可能。

在藥物治療上,除了傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素和免疫制劑外,AD生物制劑的免疫靶向治療也越來越熱門。目前IL-4Ra拮抗劑Dupilumab已經(jīng)美國食品藥品管理局獲批用于中重度AD、哮喘等過敏性疾病。臨床試驗顯示,Dupilumab可顯著改善中—重度青少年AD患者的癥狀,且具有可接受的安全性[8]。針對IL-13Ra1和IL-13Ra2的生物制劑(Lebrikizumab和Tralokinumab)也在進(jìn)一步的研發(fā)中[9]。本試驗明確了IL-13Ra1和IL-13Ra2受體在AD皮損區(qū)高表達(dá),不僅證實了特異性受體在AD發(fā)生過程中起著重要作用,而且也為高選擇的特異性的拮抗IL-13生物制劑治療中重度AD提供一定的理論基礎(chǔ)。