劉紫晨

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子市 832000

膿毒癥心肌病是繼發(fā)于膿毒癥的嚴(yán)重器官功能障礙,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,包括炎癥反應(yīng)失衡、線粒體功能損傷、氧化應(yīng)激、鈣調(diào)節(jié)障礙、自噬調(diào)節(jié)紊亂和內(nèi)皮功能障礙等[1]。組織器官遭受急性感染或損傷時(shí),中性粒細(xì)胞作為先天性免疫的重要組成部分,早期會(huì)大量聚集在病灶處發(fā)揮獨(dú)特的免疫作用[2]。中性粒細(xì)胞參與感染所致的機(jī)體損傷時(shí),所涉及的機(jī)制多種多樣,除吞噬、脫顆粒,誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生外,還介導(dǎo)形成誘捕網(wǎng),該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被稱為中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng) (Neutrophil extracellular traps,NETs),已有研究表明細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素和機(jī)體產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子在膿毒癥心肌抑制期間起著關(guān)鍵作用[3-5],NETs作為一種潛在的抗菌機(jī)制,在膿毒癥心肌病中的作用值得深入探討及研究。

硫化氫(H2S)是一種氣體生物介質(zhì),具有調(diào)節(jié)心血管、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)的重要功能[6-7]。NaHS是一種外源性H2S供體,可以提高內(nèi)源性H2S水平。既往研究表明,在大鼠膿毒癥模型中,腹腔注射NaHS可以增加內(nèi)源性H2S的合成,可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)自噬改善膿毒癥引起的心功能障礙[8-9],但是體內(nèi)H2S氣體信號(hào)能否通過(guò)調(diào)控NETS影響膿毒癥心肌病尚未明確。因此,本研究擬通過(guò)給予外源性H2S(NaHS)對(duì)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠進(jìn)行干預(yù)處理,進(jìn)一步展開心肌損傷相關(guān)酶CK-MB和LDH檢測(cè)、心肌病理組織學(xué)染色、血清H2S含量測(cè)定和中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)形成相關(guān)因子(Gasdermin D, GSDMD)、髓過(guò)氧化物酶 (Myeloperoxidase, MPO)、瓜氨酸化組蛋白3 (Citrulline, CitH3)指標(biāo)變化情況檢測(cè),基于NETs進(jìn)一步探究H2S在膿毒癥心肌損傷中作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物。清潔級(jí)雄性SD大鼠48只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±25)g,購(gòu)自新疆恒朝生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(豫)2020-0005,實(shí)驗(yàn)大鼠在我院動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng),由專人添加食物與水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25℃,環(huán)境濕度為50%～70%,室內(nèi)通風(fēng)良好,進(jìn)食、飲水及籠內(nèi)活動(dòng)不設(shè)限。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均得到石河子大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)(中國(guó)石河子)的批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物與試劑。NaHS購(gòu)自宏昌生物科技有限公司,批號(hào):240-778-0;GSDMD抗體(貨號(hào):TA4012 )來(lái)自上海Abmart公司、MPO抗體(貨號(hào):22225-1-AP1)、CitH3(貨號(hào):13754-1-AP)來(lái)自武漢三鷹公司; RIPA組織裂解液(貨號(hào):R0010)、Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗(貨號(hào):K1034G-AF594)購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(貨號(hào):GB23303)、抗β-actin抗體(貨號(hào):GB11001)購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E412-01/02)購(gòu)自南京諾唯贊公司;石蠟、蘇木素、伊紅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);LDH乳酸脫氫酶試劑盒(貨號(hào):A0202-2)、CK-MB試劑盒(貨號(hào):H197-1-2)、內(nèi)源性硫化氫檢測(cè)(H2S)試劑盒(貨號(hào):BC2050)購(gòu)自北京索萊寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型。將48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,1周后按照體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、 膿毒癥模型組(模型組)、H2S給藥組、H2S抑制劑組。模型組、H2S給藥組、H2S抑制劑組采用盲腸結(jié)扎穿孔法制作大鼠膿毒癥心肌病模型[10],具體方法如下:大鼠術(shù)前半天不予飼喂飼料,但不限制飲水。通過(guò)腹腔內(nèi)注射10%的戊巴比妥鈉(350mg/kg)進(jìn)行麻醉,待大鼠麻醉后開腹暴露盲腸,在距離盲腸遠(yuǎn)端1/3處用4.0縫線結(jié)扎盲腸,用14號(hào)針對(duì)盲腸進(jìn)行穿孔,并從穿孔處擠出少量糞便。然后將盲腸放回腹腔,逐層關(guān)腹。術(shù)后立即通過(guò)皮下注射生理鹽水 (50ml/kg) 進(jìn)行液體復(fù)蘇。假手術(shù)組行盲腸結(jié)扎術(shù),不進(jìn)行穿孔,余操作與模型組一致。為保持實(shí)驗(yàn)的一致性,所有CLP手術(shù)均由具有手術(shù)執(zhí)業(yè)資格的個(gè)體醫(yī)生進(jìn)行。

1.2.2 藥物處理與取樣。選取造模成功大鼠納入實(shí)驗(yàn),膿毒癥模型組:采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備SIC大鼠模型;H2S給藥組:CLP術(shù)后1h予以腹腔注射NaHS(8.9μmol/kg),按2ml/kg給藥;H2S抑制劑組:CLP術(shù)前30min腹腔注射PAG(40mg/kg),按2ml/kg給藥,術(shù)后1h予以腹腔注射NaHS(8.9μmol/kg);假手術(shù)組:予以同等劑量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。待術(shù)后各組大鼠實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)結(jié)束,即術(shù)后12h后麻醉取腹主動(dòng)脈血4ml,使用離心機(jī)離心后取上清液,分裝后置于-80℃冰箱,用于后續(xù)檢測(cè)。各組大鼠采用三倍劑量的戊巴比妥鈉安樂(lè)死后,留取心臟標(biāo)本,用于制作染色病理切片及后續(xù)檢測(cè)。取5ml中性粒細(xì)胞分離液加入15ml離心管中,然后緩慢加入4ml大鼠外周血,室溫500g離心30min。可見離心管中兩層環(huán)形盤狀白色懸浮細(xì)胞層,下層為中性粒細(xì)胞層,緩慢吸出中性粒細(xì)胞懸液分裝冷藏備用。

1.2.3 心肌組織HE染色。將包埋好的心肌石蠟包塊使用切片機(jī)將組織切至5μm厚度,60℃烤片30min進(jìn)行脫蠟,采用雙蒸水水洗后行蘇木素—伊紅染色,梯度酒精脫水,透明,滴加適量中性樹膠后加蓋玻片封片,待切片干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.4 心肌酶生化指標(biāo)檢測(cè)。取已經(jīng)分裝好的血清,操作步驟均按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書方法操作。分別檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的變化水平。

1.2.5 內(nèi)源性H2S水平檢測(cè)。按照試劑盒中試劑標(biāo)序分別加入各組,室溫下混勻,隨后靜置30min,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔665nm波長(zhǎng)下的吸光度,進(jìn)一步計(jì)算得出H2S水平。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)MPO含量。將已切好的切片60℃烘烤30min后進(jìn)行脫蠟處理,使用枸櫞酸鈉緩沖液體系進(jìn)行抗原修復(fù),再用0.1% Triton X-100孵育20min破膜滲透,之后在10%山羊血清孵育20min,減少非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn),接著在室溫下使用兔抗MPO室溫下孵育4h,最后在暗盒中用羊抗兔IgG抗體孵育30min,DAPI封片,在熒光顯微鏡下觀察和拍攝圖像。

1.2.7 Western blot檢測(cè)血清GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達(dá)。取出中性粒細(xì)胞懸液,加入RIPA組織裂解液裂解30min,12 000r/min離心取上清液,測(cè)定蛋白濃度。蛋白加loading buffer后煮沸上樣,進(jìn)行凝膠電泳,使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后,BSA封閉液封閉2h,使用GSDMD、MPO、CitH3(1∶10 00)抗體孵育置于4℃冰箱過(guò)夜處理,第2天回收洗凈一抗后使用對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1h,隨后滴加ECL發(fā)光液與膜作用后進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 大鼠心肌HE病理染色結(jié)果顯示,12h后假手術(shù)組所有大鼠心肌細(xì)胞排列整齊,長(zhǎng)軸與心肌纖維方向一致;模型組可見心肌間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂,伴有不同程度的水腫、變性;與模型組相比,H2S給藥組心肌纖維未見明顯受損,病理?yè)p傷程度明顯減輕;而H2S抑制劑組大鼠心肌的損傷程度較H2S給藥組明顯加重。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色結(jié)果(400×)

2.2 CK-MB、LDH檢測(cè) 血清CK-MB和LDH是評(píng)價(jià)心肌損傷的重要指標(biāo)。通過(guò)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,模型組CK-MB和LDH明顯上升,予以腹腔注射NaHS后,二者的含量有所下降,同時(shí),在補(bǔ)充H2S抑制劑后CK-MB和LDH含量較H2S給藥組上升(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血清LDH、CK-MB水平

2.3 H2S水平檢測(cè) 經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清H2S水平顯著下降,與模型組對(duì)比,H2S給藥組大鼠H2S含量有所升高,在予以補(bǔ)充H2S抑制劑PAG后,H2S含量下降(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清H2S水平

2.4 MPO熒光定量 在大鼠心肌組織切片的MPO熒光切片中,筆者發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,模型組MPO熒光密度增強(qiáng),表達(dá)量明顯上升,但給予外源性H2S補(bǔ)充劑NaHS后,發(fā)現(xiàn)MPO表達(dá)量明顯下降,最后,在給予PAG抑制H2S含量后MPO熒光強(qiáng)度提升。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌MPO熒光染色結(jié)果(400×)

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)Western blot檢測(cè)中性粒細(xì)胞外線粒體誘捕網(wǎng)關(guān)鍵蛋白GSDMD、MPO、CitH3表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠外周血中性粒細(xì)胞上清中GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達(dá)量顯著升高。與模型組比較,H2S給藥組能顯著降低GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達(dá)水平。在使用PAG之后,GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達(dá)水平明顯提升(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠外周血中性粒細(xì)胞GSDMD、MPO和CitH3表達(dá)水平

3 討論

中性粒細(xì)胞在感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。它可通過(guò)吞噬、釋放溶菌酶和形成NETs,依靠自身網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在活化時(shí)破膜釋放未聚集的染色質(zhì),進(jìn)而殺滅感染的細(xì)菌、真菌,但也有研究證實(shí),在機(jī)體感染時(shí),NETs自身具備免疫原性,可促發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng),與細(xì)胞毒性、促血栓、細(xì)胞死亡調(diào)控形成等不良事件密切相關(guān)[11-12],可見中性粒細(xì)胞在感染性疾病中的作用值得深入研究。H2S作為一種氣體信號(hào)分子,其促炎或抗炎作用仍有待進(jìn)一步研究與探討,既往研究表明在不同模型中H2S的給藥溫度、劑量、時(shí)間和首選給藥途徑,吸入氣態(tài)或注射液態(tài)都是造成H2S不同作用的潛在因素[13-16]。本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)在膿毒癥大鼠心肌損傷模型中,外源性給予H2S供體NaHS具有抗炎作用,其主要機(jī)制是通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的形成,繼而改善膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷。

CK-MB和LDH是廣泛被認(rèn)可的心肌損傷標(biāo)志物,這兩項(xiàng)作為心肌損傷的診斷和檢測(cè)指標(biāo),具有一定的特異性和實(shí)用性[17]。本研究結(jié)果顯示,膿毒癥模型組與假手術(shù)組心肌酶學(xué)指標(biāo)CK-MB、LDH相比明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)心肌病理組織學(xué)染色結(jié)果也顯示,假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊呈規(guī)律梭形,膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞排列無(wú)序,心肌橫線模糊或缺失,同時(shí)伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),這是心肌損傷的標(biāo)志。筆者通過(guò)人為處理分別促進(jìn)和抑制大鼠體內(nèi)H2S的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與膿毒癥心肌損傷模型相比,促進(jìn)H2S表達(dá)降低了CK-MB和LDH含量,而通過(guò)PAG抑制大鼠體內(nèi)H2S含量發(fā)現(xiàn)心肌損傷并未得到明顯改善。以上結(jié)果表明,在膿毒癥大鼠心肌損傷模型中,外源性給予H2S供體NaHS起到了一定程度的心肌保護(hù)作用。

中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)是由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),它是以DNA為骨架,其間鑲嵌有組蛋白CitH3、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase, NE)、MPO、抗菌肽(IL-37)、絲氨酸蛋白酶等,因此,關(guān)于NETs的檢測(cè)也都是圍繞這些主要組成成分展開[18]。NETs可以捕獲、中和和殺死病原體,防止細(xì)菌傳播,而過(guò)量的NETs形成也可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。在膿毒癥相關(guān)的心肌損傷中,NETs刺激中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到心肌,并通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子引起組織損傷。抑制NETs形成可減輕膿毒癥心肌病[19-20]。NETs在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出促炎作用,加重了心肌損傷和炎細(xì)胞的浸潤(rùn),抑制CLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)形成可減輕膿毒癥相關(guān)的心肌損傷。MPO作為NETs形成的主要組分之一,免疫熒光結(jié)果顯示,NaHS可降低膿毒癥大鼠心肌MPO表達(dá)水平。此外,Western blot結(jié)果顯示,H2S的過(guò)表達(dá)也降低了膿毒癥大鼠心肌組織GSDMD的表達(dá)水平,正常細(xì)胞條件下,GSDMD 蛋白在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)無(wú)活性狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激因素,GSDMD可由細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶或中性粒細(xì)胞彈性蛋白進(jìn)行剪切修飾,經(jīng)剪切修飾的 GSDMD的N端能在細(xì)胞膜處發(fā)生寡聚反應(yīng),形成裂解孔,從而靶向和溶解中性粒細(xì)胞顆粒膜,釋放出MPO和NETs。

綜上所述,本研究結(jié)果表明H2S具有一定的抗炎作用,可通過(guò)下調(diào)GSDMD信號(hào)通路減少NETs的釋放和形成,從而改善膿毒性心肌病。