韓筱,艾益靜,陳昱學(xué),戴軍,張曉萍,孫偉*

(1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,海口市功能材料與光電化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?571158;2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012;3.海南勝嶸生物科技有限公司,海南 海口 571157)

石斛屬多年生草本植物,多生長在懸崖峭壁背陰處的石縫里。我國海南是石斛主要產(chǎn)地之一。石斛素有“救命仙草”的美譽(yù),俗稱“藥黃金”,其性寒、味甘、淡、微咸,有滋陰清熱、益胃生津的療效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明[2],石斛具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老和抗血小板凝集等作用。石斛化學(xué)成分多且復(fù)雜,目前確定含有的成分有生物堿類、菲類、聯(lián)芐類、氨基酸類、微量元素及多糖類等[3-6]。海南火山金釵石斛生長在海口火山巖上,獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境和火山巖地貌,造就了火山石斛的獨(dú)特品質(zhì),長期適量服用,能強(qiáng)身健體,調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老。藥用石斛的市場需求量也比較大[7]。由于石斛屬植物品種眾多,供藥用的僅有39種[8],非藥用與藥用石斛從外觀上難以區(qū)分[9],同一石斛不同生長年限不同部位其藥用成分的含量也不盡相同,不良商家常將非藥用石斛混入藥用石斛,導(dǎo)致石斛市場以假亂真的現(xiàn)象普遍發(fā)生,石斛產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)混亂、品質(zhì)參差。因此亟待尋求一種快速有效鑒別石斛的方法。

目前對石斛屬藥用植物的鑒別法主要有性狀鑒別法[10]和色譜法、脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)分子標(biāo)記鑒定等方法[11],第一類方法需要有豐富的性狀鑒別技術(shù)與經(jīng)驗(yàn),主觀性強(qiáng),不夠準(zhǔn)確,第二類方法除紅外光譜法外,對樣品前處理都比較復(fù)雜。傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spec-troscopy,FTIR)是一種傳統(tǒng)的化合物分子結(jié)構(gòu)分析手段,它是鑒別不同化合物、確定分子結(jié)構(gòu)的常用方法,任何氣態(tài)、液態(tài)、固態(tài)樣品均可用紅外光譜進(jìn)行測定[12]。紅外光譜技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13-15],該技術(shù)應(yīng)用在中藥材的鑒定不僅能夠準(zhǔn)確迅速地反應(yīng)藥材的整體特征,而且簡單方便,用樣量少且綠色環(huán)保,近年來在中藥鑒別研究中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[16]。鄧月娥等[17]對不同產(chǎn)地金釵石斛進(jìn)行紅外光譜解析,證實(shí)了紅外光譜法對于快速判定金釵石斛的產(chǎn)地是可行的。李兆奎等[18]采用紅外光譜法對鐵皮石斛和幾種常用的混淆品進(jìn)行對比分析,可快速準(zhǔn)確地將其區(qū)分開來。

本文采用紅外光譜及二階導(dǎo)數(shù)譜對海南火山金釵石斛的不同部位進(jìn)行紅外光譜測試,分析其不同部位的主要活性成分及其含量,為火山口地區(qū)石斛的品質(zhì)和采收部位提供理論依據(jù),以期能為石斛藥材定性分析和活性鑒定提供一種新方法和新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器試劑

Avatar 360 傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司),測定范圍4 000～400 cm-1,DTGS檢測器,光譜分辨率4 cm-1,掃描信號累加次數(shù)32次,掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾;中藥粉碎機(jī)。

溴化鉀(KBr,光譜純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 石斛樣品制備

海南火山金釵石斛新鮮植株和商業(yè)石斛干粉均由海南勝嶸生物科技有限公司提供。將新鮮的石斛根、莖、葉洗凈后烘干并分別剪成小段,置于60 ℃干燥箱內(nèi)烘至恒重,用中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末。過200目(篩孔孔徑:0.075 mm)篩后分裝于不同的試管中備用。

1.3 紅外光譜分析

取少量不同部位的火山金釵石斛粉末和商業(yè)石斛干粉分別與溴化鉀粉末混合,倒入瑪瑙研缽中研磨均勻并壓片,將所有的壓片放置于傅里葉紅外光譜儀上掃描,進(jìn)行壓片測試。紅外圖譜使用Nicolet omnic 9.2操作軟件,對得到的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及圖譜預(yù)處理,預(yù)處理過程包括基線校正(Baseline automatic correction)和比對(Compare):二階導(dǎo)數(shù)譜使用Nicolet omnic 9.2操作軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 各部分的實(shí)物圖

海南火山金釵石斛葉片、莖干、根須及商業(yè)石斛干粉的照片如圖1所示。所使用的干粉為市售商品,外觀干燥蓬松呈淺黃色,不同部位的石斛均在新鮮健康植株上收集,葉肉飽滿,莖干粗壯,根須發(fā)達(dá)。

圖1 海南火山石斛干粉(a)、葉片(b)、莖干(c)、根須(d)照片

2.2 各部分的一維紅外光譜圖

分別對海南火山石斛商業(yè)干粉及新鮮植株上葉片、莖干、根須部位處理后得到的樣品進(jìn)行溴化鉀壓片,得到海南火山石斛各部分的一維紅外光譜圖,如圖2所示。

圖2 海南火山石斛干粉(a)、葉片(b)、莖干(c)、根須(d)的一維紅外光譜圖

在紅外光譜圖中可以看出,海南火山石斛不同部位的一維紅外光譜特征吸收峰有共性也有差異。共性是不同石斛樣品譜圖形狀非常相似,四個(gè)樣品多個(gè)吸收峰的位置和強(qiáng)度基本一致,吸收峰位置只相差幾個(gè)波數(shù)。例如石斛干粉3 413.93 cm-1、石斛葉片3416.97 cm-1、石斛莖干3422.08 cm-1與石斛根須3 419.50 cm-1相差3～9個(gè)波數(shù);石斛干粉2 922.87 cm-1、石斛葉片2 923.06 cm-1、石斛莖干2 924.59 cm-1與石斛根須2 922.64 cm-1相差1～2個(gè)波數(shù),四個(gè)樣品具體的吸收峰位置見表1。因此要區(qū)分四者還需要分辨率更高的二階導(dǎo)數(shù)圖譜或者二維相關(guān)的紅外光譜。差異主要是一些特征峰強(qiáng)度不同,如峰1(1 628 cm-1附近峰)和峰2(1 050.98 cm-1附近峰)相對強(qiáng)度不同。石斛干粉樣品峰1明顯弱于峰2;石斛葉片樣品峰1強(qiáng)于峰1;石斛莖干樣品和石斛根須樣品峰1和峰2強(qiáng)度相似。

表1 不同火山石斛部位一維紅外光譜圖特征峰出峰位置

四個(gè)樣品均表現(xiàn)了C-O伸縮振動吸收峰,石斛干粉在1 153.37,1 050.98 cm-1位置,石斛葉片在1 062.00 cm-1位置,石斛莖干在1107.41,1064.99 cm-1位置,石斛根須在1106.64,1 057.40 cm-1位置。石斛干粉、石斛葉片、石斛莖干和石斛根須也表現(xiàn)了C-H彎曲振動吸收峰,石斛干粉在1 425.54,1 375.87,1 325.53 cm-1,石斛葉片在1 423.36,1 321.71 cm-1,石斛莖干在1 460.37,1 424.61 ,1 382.43,1 321.10 cm-1,石斛根須在1 459.13,1 425.90,1 380.38,1 322.56 cm-1。石斛干粉、石斛莖干和石斛根須表現(xiàn)了芳環(huán)骨架C=C伸縮振動吸收峰,該峰指示了芳香類成分的存在,石斛干粉在1 513.10 cm-1附近,石斛莖干在1 511.39 cm-1附近,石斛根須在1 512.90 cm-1附近。脂類的三個(gè)特征吸收峰在2 926,2 854,1 745 cm-1處,其中2 926 cm-1為亞甲基-CH2伸縮振動,2 854 cm-1為亞甲基-CH2伸縮振動,1738 cm-1為酯羧基C=O伸縮振動,淀粉的特征吸收峰為1 155,1 080 cm-1和1 019 cm-1,四個(gè)樣品的一維紅外光譜均有所體現(xiàn),表明四個(gè)樣品中都含有淀粉類和脂類成分以及芳香類成分,但峰的強(qiáng)弱不同,證明石斛的不同部位其藥用成分的含量有所差別。

2.3 各部分的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖

二階導(dǎo)數(shù)譜可以把重疊的一維紅外光譜峰分開,進(jìn)而提高譜圖分辨率,更加準(zhǔn)確的顯示吸收峰的位置,對商業(yè)石斛干粉紅外光譜二階求導(dǎo),得到其二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖,如圖3所示,在1 000～2 000 cm-1波段范圍內(nèi),商業(yè)石斛干粉的特征吸收峰在1 739.60,1 159.83 cm-1處有較強(qiáng)峰,1 159.83 cm-1處為最強(qiáng)峰,其余位置為若干弱峰。石斛葉片的特征吸收峰在1 740.29,1 624.07,1 462.52,1 163.34 cm-1處有較強(qiáng)峰,其余為若干弱峰。石斛莖干均為較弱的峰。石斛根須有3個(gè)較強(qiáng)峰,分別在1 740.05,1 509.30,1 162.63 cm-1處,1 509.30 cm-1處為最強(qiáng)峰。在2 500～4 000 cm-1波段范圍內(nèi),商業(yè)石斛干粉有2個(gè)較強(qiáng)峰,分別在2 852.47,2 922.75 cm-1處,其中2 922.75 cm-1處為最強(qiáng)峰,其他位置還有弱峰若干。石斛葉片有2個(gè)較強(qiáng)峰,分別在2 921.891,2 852.16 cm-1處,其中2 921.89 cm-1處為最強(qiáng)峰,其他位置還有弱峰若干。石斛莖干和根須均為若干弱峰。具體的出峰位置如表2所示。

圖3 海南火山石斛干粉(a)、葉片(b)、莖干(c)、根須(d)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

表2 不同火山石斛部位二階導(dǎo)數(shù)光譜圖特征峰出峰位置

以商業(yè)石斛干粉的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜為例,在1000～2000 cm-1波段范圍的一維紅外光譜中只出現(xiàn)9個(gè)吸收峰,但是在二階導(dǎo)數(shù)光譜中有11個(gè)吸收峰出現(xiàn)。這是因?yàn)閷σ痪S紅外光譜進(jìn)行二階求導(dǎo)后,一些被強(qiáng)吸收峰覆蓋的弱吸收峰都顯現(xiàn)出來,使石斛不同部位的原始紅外光譜圖特征峰的差異更加明顯。四個(gè)樣品的二階導(dǎo)數(shù)譜在1 740,1 658 cm-1附近為非共軛C=O伸縮振動吸收峰,在1 559,1 503 cm-1附近出現(xiàn)芳香環(huán)骨架伸縮振動峰,在1 318 cm-1和782 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)弱不同的草酸鈣的特征峰,表明四個(gè)樣品中均含有不同含量的草酸鈣成分。

3 結(jié)論

從海南火山石斛商業(yè)干粉、葉片、莖干、根須的一維紅外光譜分析可得,石斛干粉、葉片、莖干、根須含有多種相似的特征峰,如1 000～1 200 cm-1波段內(nèi)的C-O 伸縮振動特征峰,1 300～1 475 cm-1波段內(nèi)的C-H彎曲振動吸收峰,1 513.10 cm-1附近的芳環(huán)骨架C=C伸縮振動吸收峰以及亞甲基-CH2伸縮振動、亞甲基-CH2伸縮振動、酯羧基C=O伸縮振動等,說明四個(gè)樣品中都含有淀粉、多糖、脂類成分和芳香類成分等活性成分,但是含量有所差別。二階導(dǎo)數(shù)譜可以把一維紅外光譜重疊峰區(qū)分開,將較弱的峰進(jìn)一步分辨出來,通過二階導(dǎo)數(shù)光譜分析不僅驗(yàn)證了以上研究結(jié)果,也在四個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)了一維紅外光譜難以發(fā)現(xiàn)的草酸鈣成分。紅外光譜分析法不僅用樣量少、消耗化學(xué)試劑少,而且更加簡便快速,能夠在整體上反應(yīng)石斛的質(zhì)量。本文利用紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)譜得到海南火山石斛商業(yè)干粉、葉片、莖干、根須的結(jié)構(gòu)信息,分析了海南火山石斛不同部位所含活性物質(zhì)的差異,證明紅外光譜解析方法非常適用于鑒定石斛這類種類較多且極易混淆的中藥材,不僅對于探究高效快速的石斛鑒定方法有非常重要的意義,為石斛品質(zhì)控制提供了參考依據(jù),也為其他易混淆中藥的鑒別提供了新的思路。