張婭,王蓉,侯增淼,曾亮,喬保坤,黃文濤,楊鷺

(西安德諾海思醫(yī)療科技有限公司,陜西 西安 710000)

皮膚傷口愈合過程涉及炎癥后反應、細胞增殖、遷移及創(chuàng)面重塑等階段,它們通過細胞、細胞外基質(zhì),炎性介質(zhì)及各種生長因子交互影響構成一個復雜有序的創(chuàng)面愈合關系網(wǎng)[1];其中,炎癥期被廣泛接受為傷口愈合過程中的第一階段,即在創(chuàng)面修復過程中需要細胞因子和生長因子來啟動這個過程,并在整個過程中引導和維持愈合。腫瘤壞死因子(TNF-α)或γ-干擾素(IFN-γ)是炎癥反應產(chǎn)生的重要介質(zhì),可激活轉錄因子NF-κB,進而觸發(fā)大量繼發(fā)性炎癥因子,阻抑傷口愈合進程[2]。許多研究報道,TNF-α或/和IFN-γ刺激是一種成熟的促炎細胞因子誘導模型[3-4],且這種刺激會誘導白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素8(IL-8)等細胞因子以及趨化因子(MDC)釋放。另有研究表明,TNF-α、IL-6、IL-8、MDC和黏附因子等的表達與慢性炎癥密切關聯(lián),在介導慢性炎癥疾病的細胞損傷和發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5-6]。此外,創(chuàng)面微環(huán)境中的許多細胞(包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)在皮膚傷口愈合的過程中會產(chǎn)生大量的活性氧如超氧陰離子(·O2-)和羥自由基(·OH)等引發(fā)氧化應激反應,而氧化應激在創(chuàng)面愈合的炎癥階段平衡失調(diào),進一步導致皮膚組織損害,不利于創(chuàng)面修復[7]。

貽貝黏蛋白(Mussel adhesive protein,MAP),也稱作貽貝足絲蛋白,是一種從海洋貽貝中提取的新型生物材料,具有較高的生物相容性、可形成具有抗氧化能力的納米級網(wǎng)狀微觀支架,從而抑制炎癥[8]。目前,MAP已在一些細胞或組織黏附、傷口閉合和細胞-細胞毒性實驗中被成功地證明為潛在的生物黏合劑,因而作為重要的原材料服務于日化行業(yè)和醫(yī)療器械等領域[9-10];然而,由于貽貝原料難以獲得足夠的數(shù)量,它們的應用受到了極大的限制。重組貽貝黏蛋白(rMAP)是利用基因工程技術,以微生物為宿主菌經(jīng)發(fā)酵純化等工藝所獲,具有與天然貽貝黏蛋白相同的黏附性、生物相容性及和生物可降解性,且生產(chǎn)不受原料來源所限,可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),已成為醫(yī)學和組織工程應用中很有前途的生物黏附材料,因此,采用基因重組技術制備貽貝黏蛋白是未來發(fā)展必然趨勢。本公司參照Dong等[11]所報道,以大腸桿菌為宿主菌,選取天然I型貽貝黏蛋白和V型貽貝黏蛋白部分序列,制備成“I型-V型-I型”融合重組貽貝黏蛋白。這類重組貽貝黏蛋白相較于天然貽貝黏蛋白采用基因工程技術表達,其優(yōu)勢在于,發(fā)酵生產(chǎn)周期短,蛋白表達量高,便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),可作為優(yōu)良的生物醫(yī)學材料廣泛應用于醫(yī)療器械和化妝品領域[12-13]。

近年來,Ahn等[8]利用貽貝黏蛋白fp-151和玻璃蛋白融合,研究了其在巨噬細胞和角質(zhì)細胞中的抗炎作用,結果顯示其具有有效的抗炎活性,可作為治療皮膚炎癥的有效成分。然而,關于重組貽貝黏蛋白對各種皮膚傷口的治療潛力尚不清楚。因此,本研究探討了本公司制備生產(chǎn)的重組貽貝黏蛋白的體外抗氧化能力,并采用IFN-γ誘導的人皮膚成纖維細胞(HFF-1)炎癥模型評價了其抗炎作用,從而為重組貽貝黏蛋白在生物醫(yī)學、日化行業(yè)等的應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重組貽貝黏蛋白,由天然I型貽貝黏蛋白的特征十肽(AKPSYPPTYK)與天然V型貽貝黏蛋白Mfp-5的氨基酸序列(GenBank: AAS00463.1)融合組成,以pET28a為載體,以大腸桿菌BL21為宿主菌,經(jīng)發(fā)酵、純化及凍干等工藝獲得重組貽貝黏蛋白純品,電泳結果見圖1。

圖1 重組貽貝黏蛋白的SDS-PAGE分析

1.2 試驗細胞

人皮膚成纖維細胞(HFF-1,深圳豪地華拓生物科技有限公司,批號:HTX2251)。

1.3 試驗分組

利用已知的抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)作為對照,評價其抗氧化能力。試驗分組如下:(1)對照;(2)實驗組:0.1,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mg/mL的重組貽貝黏蛋白或GSH。此外,采用IFN-γ誘導的人皮膚成纖維細胞(HFF-1)炎癥模型評價其抗炎作用。試驗分組如下:1)對照;2)誘導組:10 ng/mL IFN-γ;3)實驗組:10 ng/mL IFN-γ+ 30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白。

1.4 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(·DPPH)清除能力

參考張婧琦等[14]的方法,分別取重組貽貝黏蛋白溶液和GSH 1.0 mL,與2.5 mL 1×10-4mol/L DPPH乙醇溶液混合,在室溫下放置l h,離心,取上清液,測520 nm吸光度,樣品溶液由蒸餾水代替作為對照。

DPPH清除率=[(A控制-A樣品)/A控制]×100%

(1)

1.5 還原力

參考吳禹踐等[15]的方法,均勻混合1%的鐵氰化鉀和PBS(pH值6.6)緩沖溶液2.5 mL,并加入供試液1 mL,50 ℃水浴20 min,迅速冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL。然后。離心取上清2.5 mL,依次加入蒸餾水2.5 mL和0.02%的三氯化鐵溶液0.5 mL,靜置10 min,在700 nm處測得吸光值。

1.6 ·O2-清除能力

依據(jù)魏夢濤等[16]的方法,依次取Tris-HCl(pH值8.2)2.35 mL,蒸餾水2 mL,4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液0.15 mL,再加入4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液立即混合,分別測定初始時和1 min后吸光值ΔA1,波長條件為325 nm。以上述相同步驟加入不同濃度的重組貽貝黏蛋白和GSH溶液20 μL,分別測定在初始時和1 min后吸光值ΔA2。

清除率=[(ΔA1/Δt-ΔA2/Δt)/(ΔA1/Δt)]×100%

(2)

1.7 ·OH清除能力

參考王英特等[17]的方法,分別將0.5 mL重組貽貝黏蛋白及GSH溶液,l mL 0.3 mmol/L的甲基紫溶液,1.0 mL 3 mmol/L H2O2溶液充分混合,然后繼續(xù)加入1.5 mL 2 mmol/L FeSO4溶液,快速搖勻后立即用pH值4.6的醋酸緩沖溶液將上述溶液定容至25 mL,混勻,避光靜置30 min后,在波長578 nm處測定吸光度,根據(jù)以下方程進行清除率的計算:

清除率=(A1-A0)/(A2-A0)×100%

(3)

注:式中,A1-加入樣品溶液后的吸光度;A0-未加入樣品溶液的吸光度;A2-未加入Fenton試劑及樣品溶液的吸光度。

1.8 MTT法檢測細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的 HFF-1細胞,用胰酶消化,制成細胞懸液,計數(shù)并調(diào)整細胞為 1.5×104個/mL,接種至 96 孔板,每孔100 μL(1 500 個),放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日貼壁, 棄去原培養(yǎng)基,按重組貽貝黏蛋白 50,40,30,20,10 μg/mL質(zhì)量濃度分組加樣,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;然后分別加入 50 μL 噻唑藍(MTT)溶液,孵育 2 h后,吸除上清,每孔加異丙醇100 μL,搖勻使其充分反應,測定570 nm吸光度,按公式計算樣品對細胞的增殖率。細胞增殖率=(A加樣組/A對照組)×100%。

1.9 炎性細胞因子檢測

將收集的不同時間段(24,48 h和72 h)HFF-1細胞培養(yǎng)上清液以1 500 g,6 min離心去掉細胞殘渣備用。然后,使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清中的 TNF-α、IL-6、IL-8和MDC含量。

1.10 RNA提取和實時熒光定量PCR分析

在NCBI上搜索炎癥因子相關序列,結合Primer Premier 5.0軟件設計炎癥基因特異性引物(表1)。在培養(yǎng)的不同時間點(24,48 h和72 h)去除細胞培養(yǎng)液,用PBS緩沖液清洗3次,加入1 mL的Trizol,將細胞收集于1.5 mL的無RNA酶的離心管中,按 Total RNA 提取試劑盒說明書提取RNA,再使用逆轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA備用。最后,使用SYBR Green RT-PCR試劑盒檢測相關炎癥因子的表達。反應體系按照TaKaRa公司(TransGen) SYBR預混Ex TaqTM Kit的說明進行配置。每個樣品設置3個平行樣品,用β-actin作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 引物序列

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯多重比較檢驗對數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計,所有值至少重復三次,數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示,P≤0.05被認為差異顯著。最后,利用軟件Origin 2018和PhotoshopCS6進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 清除·DPPH能力

不同濃度重組貽貝黏蛋白對·DPPH的清除能力如圖2所示。在0～0.4 mg/mL范圍內(nèi),重組貽貝黏蛋白和GSH所具有的·DPPH清除能力均具有顯著的量效關系,即隨重組貽貝黏蛋白濃度的升高,·DPPH清除能力越強。此外,同濃度下的重組貽貝黏蛋白對·DPPH的清除率要低于對照品GSH的。

圖2 不同濃度重組貽貝黏蛋白對·DPPH的清除能力

2.2 總還原力

如圖3所示,同樣濃度下,重組貽貝黏蛋白與對照品GSH的還原力比較接近,但對照品GSH的還原力要強于類貽貝黏蛋白的還原力。當重組貽貝黏蛋白質(zhì)量濃度>1.2 mg/mL時,隨著該濃度的增大,重組貽貝黏蛋白的還原力不再顯著增強。

圖3 不同質(zhì)量濃度重組貽貝黏蛋白的還原力

2.3 清除·O2-能力

從圖4可以看出,重組貽貝黏蛋白對·O2-的清除率要低于對照品GSH的,且重組貽貝黏蛋白對·O2-的清除作用低,幾乎不起作用。

圖4 不同質(zhì)量濃度重組貽貝黏蛋白對O2-·的清除能力

2.4 清除·OH能力

如圖5所示,隨重組貽貝黏蛋白和對照組GSH濃度的升高,對·OH的清除作用也隨之增大;但對照組GSH的清除作用明顯強于同濃度的重組貽貝黏蛋白,其中,當對照組GSH為2.0 mg/mL時,同濃度重組貽貝黏蛋白清除·OH的能力也達到峰值,分別為75.44%和45.02%。

圖5 不同濃度重組貽貝黏蛋白對·OH的清除能力

2.5 不同濃度重組貽貝黏蛋白對HFF-1細胞增殖的影響

由表2可以看出,不同質(zhì)量濃度的重組貽貝黏蛋白(10～0 μg/mL)處理24 h后對HFF-1細胞無顯著影響,而在處理48 h時,僅30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白顯著促進細胞增殖。不同的是,處理72 h后,20,30,40 μg/mL和50 μg/mL 重組貽貝黏蛋白均顯著促進細胞增殖,且呈先升高后降低的趨勢,即在30 μg/mL濃度處理下細胞增殖速率最大。

表2 不同濃度重組貽貝黏蛋白處理對HFF-1細胞增殖的影響

2.6 不同濃度IFN-γ刺激對HFF-1細胞產(chǎn)生TNF-α的影響

由表3可以看出,IFN-γ1 ng/mL組TNF-α的含量有升高趨勢 ,但在各個時間點TNF-α的含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05);隨 IFN-γ濃度增大、共培養(yǎng)時間的延長,TNF-α產(chǎn)生隨之顯著增加,即IFN-γ質(zhì)量濃度為5 ng/mL時 24 h和48 h以及10 ng/mL時24,48 h和72 h。因此,后續(xù)我們選用10 ng/mL的IFN-γ。

表3 不同濃度IFN-γ處理下HFF-1細胞上清液中TNF-α含量

2.7 不同處理對HFF-1細胞IL-6、IL-8和MDC蛋白水平的影響

與對照相比,IFN-γ(10 ng/mL )處理24 h,培養(yǎng)的HFF-1細胞的上清液中IL-6的含量顯著增加,且隨著處理時間的延長,細胞毒性因子IL-6含量進一步升高(圖6a)。與單獨IFN-γ處理相比,30 μg/mL重組貽貝黏蛋白的加入并不影響IFN-γ處理24 h的細胞上清液中的IL-6含量,而使IFN-γ單獨處理48 h和72 h的細胞上清液中的IL-6含量較同期單獨IFN-γ處理分別顯著降低約13%和38%。由此可見,重組貽貝黏蛋白的加入主要影響IFN-γ處理中期和后期的細胞上清液中的IL-6含量。

圖6 不同處理對HFF-1細胞中炎癥基因表達的影響

由圖6c可知,10 ng/mL IFN-γ處理可顯著誘導細胞上清液中IL-8的產(chǎn)生,且隨著處理時間的延長,該參數(shù)也逐漸增大。與單獨IFN-γ處理相比,IFN-γ+ 30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白復合處理反而使細胞上清液中IL-8含量減少。

從圖6e可以看出,與IFN-γ(10 ng/mL )單獨處理24,48 h和72 h時,HFF-1細胞上清液中MDC含量較對照分別顯著升高約15%,21%和30%。不同的是,IFN-γ+30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白復合處理使IFN-γ單獨處理48 h和72 h的細胞上清液中的MDC含量較同期單獨IFN-γ處理分別顯著降低約17%和29%,但不影響IFN-γ單獨處理24 h的HFF-1細胞上清液中的MDC變化。

2.8 不同處理對HFF-1細胞中IL-6、IL-8和MDC mRNA水平的影響

由圖6b可知,10 ng/mL IFN-γ處理24,48 h和72 h時,IL-6表達明顯上調(diào),分別較同期對照增大約81%,171%和60%。與同期IFN-γ單獨處理相比,10 ng/mL IFN-γ+ 30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白復合處理下該參數(shù)在24 h均沒有明顯變化,而30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白的加入誘導該基因在IFN-γ處理的第48 h和72 h顯著下調(diào)。

圖6d顯示了不同處理下HFF-1細胞中IL-8表達的變化。單獨IFN-γ處理顯著促進細胞中IL-8的表達,在24,48 h和72 h較同期對照分別上調(diào)約62%,109%和125%。與同期IFN-γ單獨處理相比,30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白的加入誘導該基因在IFN-γ處理的第24,48 h和72 h均顯著下調(diào)。

如圖6f所示,MDC的表達在IFN-γ單獨處理24 h和48 h時均較同期對照顯著上調(diào),但處理72 h時該基因的表達與對照無顯著性差異。與同期IFN-γ單獨處理相比,30 μg/mL 重組貽貝黏蛋白的加入誘導該基因在IFN-γ處理的第24,48 h和72 h均顯著下調(diào),較IFN-γ單獨處理相比分別下降約56%,41%和66%。

3 討論

賈貴華和任雪峰[18]的研究證明:樣品的還原力和抗氧化活性具有直接的關系效應。對于創(chuàng)面而言,·DPPH、·O2-和·OH等會導致修復細胞的遷移、增殖能力下降,細胞外基質(zhì)合成障礙[19]。氧化應激失衡也已被證明可以延緩皮膚傷口的愈合[20-21]。本研究結果顯示,在一定濃度范圍內(nèi),隨重組貽貝黏蛋白濃度的升高,總還原力、清除·DPPH以及·OH能力越強。這可能是因為重組貽貝黏蛋白在結構上具有不尋常的氨基酸3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA),這類基團在創(chuàng)面可形成具有抗氧化能力的微觀支架。此外,同濃度下的重組貽貝黏蛋白對·DPPH和·OH自由基的清除率要低于對照品GSH。相似,張艷萍等[22]的研究也表明, MAP酶解物的抗氧化效應與樣品濃度呈顯著正相關關系,即濃度越高,則抗氧化效果越強,且同樣的濃度條件下,對照GSH對自由基的清除作用均強于MAP酶解物。不同的是,重組貽貝黏蛋白對·O2-的清除作用低,幾乎不起作用,說明重組貽貝黏蛋白主要對·DPPH和·OH的清除起作用。以上結果表明,重組貽貝黏蛋白具有良好的清除活性氧的能力,可延緩因活性氧過量誘發(fā)的皮膚輻射損傷、炎癥等自由基傷害,促進皮膚傷口愈合。

創(chuàng)面愈合是多種細胞、細胞因子和生長因子相互作用的過程,其改變會導致愈合過程的延遲[13]。有研究報道,MAP具有促進細胞貼壁,促進創(chuàng)面愈合等特性[8]。Liu等[23]的研究也證實,MAP能顯著抑制UVB誘導的細胞死亡和凋亡。但是,針對重組貽貝黏蛋白的相關報道鮮少。本研究發(fā)現(xiàn),適宜濃度重組貽貝黏蛋白可顯著促進細胞增殖(表2),推斷重組貽貝黏蛋白具有良好的促進傷口愈合能力。TNF-α被認為是傷口愈合過程中的促炎癥細胞因子,參與啟動早期傷口愈合反應[24]。IFN-γ是Th1細胞因子,也可產(chǎn)生炎癥前反應[25]。本研究中,HFF-1細胞在IFN-γ的刺激下,產(chǎn)生的TNF-α增多,且該效應與IFN-γ刺激濃度及作用時間呈顯著正相關,提示IFN-γ可能通過上調(diào)TNF-α表達,使TNF-α含量增加,進而誘發(fā)炎癥反應,延緩創(chuàng)面愈合過程。IL-6、IL-8和IL-1β屬于Th2細胞因子,它們能產(chǎn)生更多的炎癥反應,而MDC是Th2細胞產(chǎn)生的一種趨化因子[26]。本研究采用重組貽貝黏蛋白處理經(jīng)IFN-γ刺激的HFF-1細胞,動態(tài)觀察炎癥細胞因子IL-6、IL-8和MDC在蛋白水平和mRNA水平的變化。結果發(fā)現(xiàn),適宜濃度的重組貽貝黏蛋白可在蛋白水平或mRNA水平抑制IFN-γ刺激的中期和后期的HFF-1細胞中IL-6和MDC的表達,而在處理早期(24 h)就可顯著抑制IL-8的表達,且隨處理時間的延長,抑制效果越好。相似,Jung-Mo Ahn等[8]將fp-151和玻連蛋白VT組成融合蛋白fp-151-VT在大腸桿菌中進行表達后也發(fā)現(xiàn)fp-151-VT可以抑制UVB刺激角質(zhì)細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放。與本研究結果一致,Lee等[27]在TNF-α/IFN-γ-刺激前用抗炎藥物黃芩黃酮II處理HaCaT細胞,也證實其在蛋白水平和mRNA均顯著抑制MDC的表達。上述體外細胞實驗證實,重組貽貝黏蛋白可通過下調(diào)炎癥因子的表達,抑制炎癥反應,在組織修復中發(fā)揮積極作用。

4 結論

綜上所述,IFN-γ刺激致炎有時間和劑量依賴性,而重組貽貝黏蛋白可通過抑制IFN-γ誘導的IL-6、IL-8和MDC表達發(fā)揮抗炎作用。此外,重組貽貝黏蛋白具有較強的還原力,可通過清除·DPPH和·OH等自由基抑制因炎癥反應引起的氧化應激損傷,促進傷口愈合。這些結果為以重組貽貝黏蛋白為原料開發(fā)新型抗氧化及抗炎醫(yī)療器械,進一步應用到日化行業(yè)治療皮膚傷口提供了一定的實驗依據(jù)。