郭靖,張麗,王紀(jì)清,白文軒

(衡水學(xué)院 化工學(xué)院,河北 衡水 053000)

款冬花(FarfaraeFlos)又名款花、九九花,俗稱連三朵,是菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾,其性辛、溫、味微苦,歸肺經(jīng),具有潤肺下氣、止咳化痰之功效,常用于治療新舊咳嗽、喘咳痰多和勞嗽咳血等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明款冬花主要含有黃酮類、萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、多糖類、揮發(fā)油類等生物活性成分[2],具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[3]。黃酮類化合物具有優(yōu)良的抗炎、抗氧化作用,在食品、藥品、化妝品領(lǐng)域具有極廣泛的應(yīng)用。劉彩紅等[4]研究結(jié)果表明款冬花中的黃酮化合物對自由基有較好的清除作用,可作為潛在的抗氧化活性的天然產(chǎn)物。本文以款冬花為原料,利用響應(yīng)面Box-Behnken Design中心組合設(shè)計對其總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過回歸方程探究最優(yōu)提取工藝條件,并研究影響因素對款冬花總黃酮含量的交互作用,以期為溶劑浸提款冬花總黃酮的產(chǎn)業(yè)化研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

722紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、 恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)、Re-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器公司)、蘆丁(中國藥品生物制品檢定所)、硝酸鋁(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、亞硝酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、無水乙醇(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠,分析純);款冬花(購于安徽亳州市佰林堂藥業(yè)有限公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL蘆丁溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL分別于10 mL容量瓶中,分別加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液,3 min后加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液,靜置6 min后加入4 mL的10%氫氧化鈉溶液,用蒸餾水定容,搖勻放置15 min后于最大吸收波長507 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),擬合得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.970 9x+0.012 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,范圍為 0～50 μg/mL。

1.2.2 款冬花總黃酮的含量測定

精確稱取款冬花1.00 g,加入一定濃度的乙醇溶液,在一定溫度和料液比下,加熱回流一段時間,過濾得濾液,將濾液定容至一定量體積。取一定體積樣品溶液稀釋后,按1.2.1法測定吸光度,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算款冬花的總黃酮含量(mg/g)。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

精確稱量1.00 g款冬花,采用乙醇回流浸提法,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù) (50%,60%,70%,80%,90%)、料液比1∶25,1∶30,1∶35,1∶40,1∶45(g∶mL)、提取時間 (60,90,120,150,180 min)、提取溫度 (50,60,70,80,90 ℃)四個變量對款冬花總黃酮的提取含量影響。

1.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上,篩選出款冬花總黃酮含量影響較大的三個因素,采用響應(yīng)面設(shè)計實驗共29組,以款冬花的總黃酮含量為響應(yīng)指標(biāo),探討各變量及其相互作用對提取總黃酮含量的影響。表1顯示中心組合設(shè)計各變量水平。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗對總黃酮含量的影響

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

從圖1可知,隨乙醇濃度的增加,款冬花總黃酮含量先升后降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,總黃酮含量最高為50.10 mg/g?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)增加,黃酮類化合物在醇溶液中溶解增大,60%醇溶液使黃酮溶解度達(dá)最大,隨乙醇濃度繼續(xù)增加,醇溶性雜質(zhì)溶出量增大,與黃酮類物質(zhì)競爭溶出,使總黃酮類化合物含量降低。故本實驗選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%范圍內(nèi)比較合適。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

2.1.2 提取溫度對總黃酮含量的影響

由圖2可知,提取溫度與款冬花總黃酮含量成正相關(guān),當(dāng)提取溫度為80 ℃時達(dá)最高值49.90 mg/g。繼續(xù)升溫至90 ℃時,總黃酮含量卻略有降低,原因可能是由于高溫導(dǎo)致熱敏性黃酮化合物降解,從而使總黃酮含量降低。故提取溫度選擇70～90 ℃為優(yōu)化實驗范圍。

圖2 提取溫度對總黃酮含量的影響

2.1.3 提取時間對總黃酮含量的影響

由圖3分析可知,隨提取時間的增加,款冬花總黃酮含量先升后降。當(dāng)提取時間150 min時,款冬花總黃酮含量達(dá)最高,為49.57 mg/g。因此優(yōu)化實驗的提取時間范圍為120～180 min。

圖3 提取時間對總黃酮含量的影響

2.1.4 液料比對總黃酮含量的影響

由圖4可知,當(dāng)料液比處于 1∶40 mL/g 時,款冬花總黃酮含量達(dá)到峰值,液料比繼續(xù)增大,總黃酮含量開始降低。可能的原因是當(dāng)溶劑量過小時,較少的提取溶劑不能夠?qū)⒖疃ㄍ耆?總黃酮溶出不徹底; 隨著液料比的增加,總黃酮開始溶出徹底,總黃酮含量迅速增加。當(dāng)溶劑量過多時,款冬花的其他溶質(zhì)開始析出,款冬花中總黃酮含量減少了。故將液料比在 1∶35～1∶45(g∶mL)作為優(yōu)化試驗的范圍。

圖4 液料比對總黃酮含量的影響

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.2.1 回歸方程擬合

Design-Expert 12.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得到二次回歸模型擬合及方差分析見表3。

表3 方差分析表

款冬花總黃酮含量=50.70+1.23A+1.19B+0.7083C+1.34D+1.39AB+0.5090AC+1.18AD-0.7225BC+1.71BD+0.5175CD-5.05A2-3.31B2-5.31C2-5.13D2。

由方差分析可知,乙醇濃度、料液比和提取溫度的一次項及二次項對款冬花總黃酮的提取均達(dá)到了極度顯著水平(P<0.01);料液比和提取溫度的交互效應(yīng)對款冬花黃酮含量的影響達(dá)到了極顯著水平(P<0.01);提取時間的一次項、乙醇濃度與料液比及乙醇濃度與提取溫度的交互作用對總黃酮提取影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05),提取時間與其余因素的兩兩交互項均為不顯著。根據(jù)回歸方程系數(shù)及方差表可知,四個變量中對款冬花總黃酮含量(Y)影響最大的是提取溫度(D),其次為乙醇濃度(A),料液比(B),而提取時間(C)對總黃酮含量影響最小。

2.2.2 響應(yīng)面分析

兩兩交互效應(yīng)對款冬花總黃酮提取含量影響的響應(yīng)面及其等高線如圖5～7所示。等高線圖表示在同一橢圓曲線上,款冬花總黃酮的含量是相同的。響應(yīng)面坡度越陡峭,相應(yīng)的等高線排列越密,說明該坐標(biāo)軸因素變化對款冬花總黃酮含量影響越大。相反響應(yīng)曲面坡度越緩,等高線排列越稀,則該因素條件變化對響應(yīng)值的影響也越小。等高線的形狀也可體現(xiàn)因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,形狀越趨向橢圓或橢圓軸線與坐標(biāo)軸間角度越大,表明因素間的交互效應(yīng)越顯著,對提取款冬花總黃酮含量的影響越大。反之等高線形狀越接近圓形或橢圓軸線與坐標(biāo)軸角度越小,則表明因素間的交互效應(yīng)比較弱,對款冬花總黃酮含量的影響較小。

圖5 提取溫度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

分析圖5等高線圖,提取溫度的等高線比料液比排列緊密,表明提取溫度的主效應(yīng)大于料液比。圖5中等高線與圖6、圖7比較,更趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸角度更大,表明提取溫度和料液的交互作用要明顯強(qiáng)于圖6和圖7中兩兩交互效果。驗證了方差顯著性檢驗中,BD交互效果極顯著,而AB、AD交互作用顯著的結(jié)果。

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

圖7 提取溫度和乙醇濃度交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

2.3 優(yōu)化提取的驗證實驗

響應(yīng)面優(yōu)化款冬花總黃酮含量的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)61.81%,提取時間152.06 min,提取溫度81.96 ℃,料液比為1∶41.34(g∶mL),款冬花總黃酮含量的預(yù)測值51.13 mg/g?？紤]實際限制,對最優(yōu)條件進(jìn)行調(diào)整:乙醇體積分?jǐn)?shù)62%,提取時間152 min,提取溫度82 ℃,料液比1∶41(g∶mL),進(jìn)行款冬花總黃酮提取,重復(fù)實驗3次,實際款冬花總黃酮含量為50.11 mg/g,為模型理論預(yù)測值的98%,與模型預(yù)測值高度相符。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.54%,說明此方法測得款冬花總黃酮含量的精密度較高。故采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的款冬花總黃酮提取工藝穩(wěn)定,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,可用于提取款冬花總黃酮的大規(guī)模生產(chǎn)。

3 結(jié)論

依據(jù)響應(yīng)面法得到的回歸模型探討得到最佳的工藝條件為: 提取溫度82 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)62%,提取時間152 min,料液比1∶41(g∶mL),款冬花總黃酮含量可達(dá)50.11 mg/g,理論含量為51.13 mg/g?；貧w模型擬合度高。優(yōu)化了款冬花總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明,此工藝條件良好可行,能夠為款冬花總黃酮在醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。