張琰,李越

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院,山西 太原 030012;2.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山西 太原 030012)

酸棗是多年生落葉灌木植物,原產(chǎn)于中國(guó),分布于湖北、四川、河南、河北、山東、山西、遼寧等地,是我國(guó)北方較為常見(jiàn)的一種野生經(jīng)濟(jì)果樹(shù)資源[1-4]。酸棗葉為鼠李科棗屬植物酸棗的干燥葉子。酸棗葉野生生物資源非常豐富,具有抗氧化、改善睡眠等許多保健保養(yǎng)功能,它是極具開(kāi)發(fā)潛能的藥用植物資源[5]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),酸棗葉中含有多種成分且含量豐富,如皂苷[6]、黃酮[7]、氨基酸[8]、核苷類(lèi)[9]、微量元素[10]等營(yíng)養(yǎng)成分。由于酸棗葉有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及較大的藥用價(jià)值,近年來(lái)對(duì)酸棗葉的研究也較多,于慶利[11]研究了一種酸棗葉茶的加工生產(chǎn)方法。車(chē)勇等[12]對(duì)酸棗葉化學(xué)成分進(jìn)行了研究,研究表明具有黃酮類(lèi)成分和五環(huán)三萜類(lèi)成分。白莉等采用紫外可見(jiàn)分光光度法,測(cè)定了山西九個(gè)不同地區(qū)的酸棗葉中總黃酮的含量,試驗(yàn)結(jié)果表明酸棗葉中總黃酮含量達(dá)到了8.04%[7]。張倩倩等研究發(fā)現(xiàn)酸棗葉中黃酮類(lèi)成分含量高于酸棗仁,酸棗葉可能具有更強(qiáng)的抗氧化作用[13]。張強(qiáng)等[14]研究了南酸棗葉的抗氧化活性,結(jié)果表明南酸棗葉多糖對(duì)DPPH清除率的IC50值為0.57 mg/mL,其值弱于VC,期望為天然抗氧劑的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。朱廣龍[15]研究發(fā)現(xiàn)酸棗葉與許多植物富含葉蛋白相似,其富含可溶性蛋白9.99 mg/g。莊福金等[16]研究表明了山東嶗山酸棗芽茶與酸棗葉對(duì)小鼠睡眠均具有明顯的改善作用。Bai等[17]研究發(fā)現(xiàn)酸棗葉中黃酮類(lèi)成分可能是保護(hù)肝臟的有效成分。本試驗(yàn)對(duì)山西酸棗嫩葉提取物清除DPPH自由基及對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用進(jìn)行研究,旨在為山西酸棗嫩葉抗氧化活性的研究提供試驗(yàn)依據(jù),也在初步探索提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,為開(kāi)發(fā)天然新型降糖藥物奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料

山西酸棗嫩葉于2022年5月份采自山西省太谷縣酸棗種植基地。

1.2 試劑

1,1二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社);乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)、均為國(guó)產(chǎn)分析純。α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、PNPG(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、碳酸鈉溶液、PBS緩沖液、麥芽糖。

1.3 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)U-2900(日本Hitachi)、旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀(RE2000B,上海亞榮生化儀器廠)、電子分析天平(FA2004,上海衡平儀器儀表廠)、KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、HWS-28電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、96微孔板、Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀 (Tecan公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 山西酸棗嫩葉醇提物清除DPPH自由基的方法

2.1.1 山西酸棗嫩葉提取方法

取干燥的酸棗嫩葉100 g,研細(xì)碎,放置于圓底燒瓶中,加入80%乙醇溶液1 000 mL,加熱回流煮沸3.5 h,抽濾,濾液保存?zhèn)溆?。濾渣同法再抽提兩次,合并濾液,真空蒸發(fā)至干燥,得浸膏。

2.1.2 醇提物各組分的制備

將浸膏溶于100 mL蒸餾水中,用超聲波微加熱助其溶解。將100 mL乙醇提取液倒入分液漏斗中,加入相等體積的石油醚,進(jìn)行充分振蕩,然后放至分層,將石油醚層分離出來(lái),乙醇提取液繼續(xù)用石油醚萃取至石油醚顏色清淡為止。隨后合并石油醚層萃取液,減壓蒸餾至干,得到石油醚萃取的浸膏。加100 mL蒸餾水,即得到相當(dāng)于原藥材1 g/mL的石油醚層萃取物水溶液。

繼續(xù)將石油醚萃取后的提取液加入100 mL乙酸乙酯,同上萃取方法,得到乙酸乙酯萃取的浸膏。加100 mL蒸餾水,即得到相當(dāng)于原藥材1 g/mL的乙酸乙酯層萃取物水溶液。將乙酸乙酯萃取后的提取液中,加入100 mL正丁醇,同上萃取方法,得正丁醇萃取的浸膏。加100 mL蒸餾水,即得到相當(dāng)于原藥材1 g/mL的正丁醇層萃取物水溶液。將萃取完的水層,加入蒸餾水至100 mL,得到相當(dāng)于原藥材1 g/mL的水層提取物水溶液。各試劑稀釋成適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行自由基清除率的實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 DPPH法清除自由基的原理

DPPH是一種自由基,性質(zhì)很穩(wěn)定,其以氮原子為中心。并在515 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰。當(dāng)DPPH溶液中加入抗氧化劑時(shí),DPPH會(huì)和抗氧化劑相結(jié)合,DPPH溶液顏色變成淺色,在515 nm處的吸光度也變小,故此種方法用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的清除自由基能力。吸光度如果越小,那么清除率則越大,抗氧化能力則越強(qiáng)[18]。

2.1.4 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 mg DPPH,用甲醇定容至100 mL,配置成質(zhì)量濃度為2.5×10-2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于冰箱中備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。然后分別取濃度梯度為0,2,4,6,8,10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇定容至10 mL,最終質(zhì)量濃度分別為0,5,10,15,20,25 μg/mL。測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)515 nm處的吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)[18]。由圖1得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程Y=0.022 7x+0.051 3,R2=0.995 9,此標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示良好的線性。

圖1 DPPH濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.5 測(cè)定方法和清除率的計(jì)算

對(duì)DPPH自由基清除方法的測(cè)定參閱Brand-William(1995)[19]。取以上不同萃取物組分水溶液各20,40,60,80,100 μL,量取質(zhì)量濃度為2.5×10-2mg/mL的DPPH溶液至4 mL,兩者立即混勻。放置比色皿里面,在波長(zhǎng)515 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定,直到顯示的讀數(shù)穩(wěn)定為止。測(cè)定值代入以下公式計(jì)算出自由基清除率即為:

自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

(1)

公式中A0為未加試樣的DPPH在波長(zhǎng)515 nm處的吸光度,A1為抗氧化性物質(zhì)與DPPH反應(yīng)后在515 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2.1.6 IC50的計(jì)算

IC50表示清除50%DPPH自由基時(shí)所需要的抗氧化劑濃度。根據(jù)山西酸棗葉醇提物不同濃度的各組分與DPPH自由基清除率,制作關(guān)系曲線圖,然后進(jìn)行線性回歸分析,并得到線性回歸方程。最后根據(jù)線性回歸方程,計(jì)算出清除50%DPPH時(shí)各組分的濃度即IC50,IC50值越小,清除自由基能力即抗氧化能力越強(qiáng)。

2.2 山西酸棗嫩葉醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2.2.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率的試驗(yàn)

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成PNP(對(duì)硝基苯酚),在堿性條件下PNP于波長(zhǎng)405 nm處有最大吸收值,再用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度,可以檢測(cè)加入的待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酸棗嫩葉醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)方法參照王賀[20]研究方法、結(jié)合96微孔板法[21],以PNPG為底物的酶-抑制劑篩選模型稍作改動(dòng),測(cè)定山西酸棗嫩葉醇提物各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。分別設(shè)置了背景組、空白組、實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組含有待測(cè)樣品與阿卡波糖對(duì)照組,每組6孔。為了使試驗(yàn)結(jié)果更加可靠,對(duì)各組濃度進(jìn)行調(diào)整使其抑制率曲線均通過(guò)50%。乙酸乙酯萃取物、阿卡波糖質(zhì)量濃度梯度均為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL;正丁醇萃取物、水層萃取物質(zhì)量濃度梯度均為0.6,0.8 ,1.0 ,1.2 ,1.4,1.6 mg/mL,石油醚萃取物濃度梯度為0.8,1.0 ,1.2 ,1.4,1.6,1.8 mg/mL。在96孔微孔板上,按照表1準(zhǔn)確移取0.01 mol/L PBS緩沖液(pH值6.8)112 μL,以及一定濃度梯度待測(cè)樣品8 μL,0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20 μL,然后輕微振蕩混勻。于37.0 ℃恒溫放置10 min,再加入濃度為1.0 mmol/L PNPG底物溶液20 μL,在恒溫37.0 ℃下反應(yīng)20 min,最后加入濃度為0.2 mol/L碳酸鈉溶液80 μL進(jìn)行終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度值,用阿卡波糖做陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)處理組各重復(fù)測(cè)試三次,取各組吸光度平均值代入公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。其公式如下:

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)反應(yīng)體系 單位:μL

α-葡萄糖苷酶抑制率=[1-(A樣-A樣空)/(A陰-A空)]×100%

(2)

其中不加樣品的陰性對(duì)照組為A陰,不加樣品、酶的空白對(duì)照組為A空,同時(shí)加了樣品與酶的為A樣,以PBS(磷酸鹽)緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液的樣品空白組為A樣空,表1為α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)反應(yīng)體系。

2.2.2 乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型的研究

參考Lee等[22]的方法,稍作改動(dòng)。底物為麥芽糖,且其濃度遞增梯度為0.125,0.25,0.5,1,2 mol/L,加入不同質(zhì)量濃度的乙酸乙酯萃取物,其濃度梯度為600,300,150 mg/mL,然后分別測(cè)定在15 min時(shí)的吸光度。以橫坐標(biāo)為底物濃度的倒數(shù)1/[s],縱坐標(biāo)為反應(yīng)速率的倒數(shù)1/v進(jìn)行作圖,即雙倒數(shù)Lineweaver-Burk作圖法,確定乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)的類(lèi)型。每個(gè)濃度做三個(gè)平行試驗(yàn)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 山西酸棗嫩葉醇提物清除DPPH自由基的試驗(yàn)結(jié)果與分析

原藥材濃度計(jì)算公式為:

原藥材質(zhì)量濃度=加樣體積×1/反應(yīng)體系總體積×稀釋倍數(shù)

(3)

如圖2～5各個(gè)組分的線性回歸方程分別為:

圖2 山西酸棗嫩葉石油醚萃取物清除DPPH自由基的比率

圖3 山西酸棗嫩葉萃后水層萃取物清除DPPH自由基的比率

圖4 山西酸棗嫩葉正丁醇萃取物清除DPPH自由基的比率

圖5 山西酸棗嫩葉乙酸乙酯層萃取物清除DPPH自由基的比率

石油醚層萃取物:Y=0.873 1X+1.653 3,IC50=55.37 mg/mL;

萃后水層萃取物:Y=15.201X-2.598 7,IC50=3.46 mg/mL;

正丁醇層萃取物:Y=17.183X-3.846,IC50=3.13 mg/mL;

乙酸乙酯層萃取物:Y=65.59X+2.356,IC50=0.73 mg/mL。

從試驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出,山西酸棗葉醇提物的各組分都具有對(duì)DPPH自由基的清除能力,并且隨著濃度的梯度增加,其清除DPPH自由基的能力也不斷增強(qiáng),呈現(xiàn)出顯著的劑量和效應(yīng)關(guān)系。醇提物各組分清除DPPH自由基能力的強(qiáng)弱順序是乙酸乙酯層>正丁醇層> 萃后水層>石油醚層,其IC50分別為0.73,3.13,3.46,55.37 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山西酸棗葉醇提物清除DPPH自由基的成分主要存在于乙酸乙酯層當(dāng)中,其清除能力強(qiáng)。其次在正丁醇和水層也存在有清除DPPH自由基的成分,其清除能力較弱。最后是在石油醚層中也存在清除DPPH自由基的成分,但能力最弱。而且正丁醇層與水層中清除DPPH自由基的成分其清除能力基本相當(dāng)。

3.2 山西酸棗嫩葉醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果與分析

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種通過(guò)減緩多糖的分解來(lái)降低血糖在餐后過(guò)高的口服降糖藥物,其作用原理是在多糖消化的最后一個(gè)步驟來(lái)抑制雙糖分解成單糖。山西酸棗嫩葉醇提物各組分在不同梯度濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性如圖6所示。

由圖6分析可知,山西酸棗嫩葉醇提物各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著濃度升高,抑制效果增強(qiáng),表現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。阿卡波糖的抑制率最強(qiáng),然后依次是乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層萃取物、石油醚萃取物。

由圖7可知,以IC50即抑制50%酶活性所需的抑制劑濃度作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),山西酸棗嫩葉醇提物各組分的半抑制率表現(xiàn)為阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照(0.256±0.02)mg/mL>乙酸乙酯萃取物(0.385±0.02)mg/mL>正丁醇萃取物(0.542±0.03)mg/mL>水層萃取物(0.766±0.036)mg/mL>石油醚萃取物(1.178±0.042)mg/mL。其中IC50越小,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用越強(qiáng)。從結(jié)果看出,各組分抑制活性均差異顯著,其中乙酸乙酯萃取物的抑制作用最強(qiáng),但比阿卡波糖的抑制作用稍弱。

圖7 山西酸棗嫩葉醇提物各組分的IC50

3.3 乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的類(lèi)型分析

由酶濃度-反應(yīng)初速率圖8得到兩條近似通過(guò)原點(diǎn)的直線,因而可以得出乙酸乙酯提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型是可逆性抑制。由于不加乙酸乙酯萃取物的直線斜率大于加乙酸乙酯萃取物的直線斜率,究其原理是抑制劑與酶和酶底物復(fù)合物通過(guò)非共價(jià)鍵進(jìn)行的可逆性結(jié)合。

圖8 山西酸棗嫩葉乙酸乙酯萃取物的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山西酸棗嫩葉醇提物用三種不同的有機(jī)溶劑萃取之后,乙酸乙酯相對(duì)DPPH的清除能力較強(qiáng)。應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選模型,對(duì)山西酸棗嫩葉醇提物各組分在不同梯度濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物的抑制活性最高。這些試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究山西酸棗嫩葉的抗氧化性和降糖作用奠定了初步基礎(chǔ),也為酸棗嫩葉的合理有效利用探索了一些路徑。