何 娜,王麗麗,高 虹,張麗穎,唐志強,付 亮,王昌華,隋國民,鄭文靜,馬作斌

(遼寧省水稻研究所, 遼寧 沈陽 110101)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一,養(yǎng)活了全球一半以上的人口,但每年因稻瘟病菌引起的稻瘟病(Magnaportheoryzae)對水稻生產(chǎn)造成了嚴重的損失[1]。 利用抗稻瘟病基因選育抗病品種是控制稻瘟病大面積發(fā)生最經(jīng)濟有效的途徑[2]。 國內(nèi)外很多育種家將常規(guī)育種方法與分子標記輔助選擇技術相結合,利用主效的抗稻瘟病基因?qū)λ酒贩N的稻瘟病抗性進行定向改良,取得了令人矚目的成績[3～5]。 截至目前為止,已至少報道了114 個主效基因,半數(shù)以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色體區(qū)域[6]。其中,最大的4 個基因簇分別位于第6、9、11 和12 染色體上[7]。 通過不斷深入研究,目前已有39個基因成功克隆,包括第6 染色體上的Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t、Pid2、Pid3、Pi25;第9 染色體上的Pi5/Pi3/Pi-i、Pi56;第11 染色體上的Pia、Pi-CO39、Pi1/Pik/Pik-h/Pi54/Pikp/Pikm、pb1;以及第12 染色體上的Pita和Ptr[8]。

Piz-t位于水稻6 號染色體短臂,是一個具有對稻瘟病生理小種具有廣譜抗性的基因[9],對于培育具有廣譜抗性的水稻品種具有巨大的利用價值,但該基因所在染色體區(qū)段包含多個對不同稻瘟病生理小種具有抗性的等位基因,如Pi9、Pi-z、Pi-2 以及感病等位基因[10],水稻抗稻瘟病基因Pizt對我國不同稻區(qū)的稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性,在水稻育種中具有較高的利用價值。

水稻抗病育種是通過抗性鑒定對植株進行表型選擇,耗費時間長,且易受環(huán)境條件的限制,鑒定結果容易造成誤差,選擇效率較低。 育種家開展了大量分子標記輔助選擇抗稻瘟病基因,改良現(xiàn)有水稻品種的稻瘟病抗性的實踐,如聚合3 個稻瘟病基因改良金23B 的稻瘟病抗性[11],利用分子標記轉(zhuǎn)育3 個基因改良空育131 稻瘟病抗性[12],利用分子標記技術聚合Pi-1 和Pi-2 基因改良三系不育系榮豐A 的稻瘟病抗性[13],表明利用分子標記輔助選擇育種簡單有效,可以降低育種成本,縮短選育周期,亦可進行有目的的多基因聚合,提高育種效率,帶來巨大的社會經(jīng)濟效益。

本研究根據(jù)Piz-t與其等位基因Pi2、Pi9、Pigm、Pi50 的序列差異,開發(fā)了一套基于PARMS檢測技術(Penta-primer amplification refractory mutation system)的熒光分子標記。 該標記能夠準確的檢測出育種后代材料中Piz-t基因型,以及是否純和,結合高通量DNA 提取和熒光檢測技術能夠為水稻抗稻瘟病分子標記輔助育種提供簡便、可靠、低價高通量的基因鑒定技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為國家作物種質(zhì)資源庫遼寧分庫提供的水稻資源98 份,以龍粳31 為父本遼星21 號為母本構建的后代材料。

1.2 DNA 提取

DNA 提取采用SDS 裂解法,首先將植物葉片用打孔器取8 片放入取樣盤中,加入鋼珠,-80 ℃凍存,用組織研磨儀研磨葉片后加入1.5% SDS裂解液,65 ℃孵育裂解,再用醋酸鈉沉淀離心,獲得上清液,加入異丙醇沉淀出DNA,用70%酒精漂洗2 次,晾干,得到干凈的DNA,加入TE 溶劑溶解,放入4 ℃待用。

1.3 PARMS 反應測試

10 μl PCR 反應體系。 在PCR 反應板中加入20 ng DNA 樣品,烘干后加入PARMS Master Mix反應混合液(武漢市景肽生物科技有限公司生產(chǎn)),反應體系見表1。 PCR 擴增在ABI 7500 熒光定量PCR 系統(tǒng)中完成,Touchdown PCR 反應條件為:94 ℃預變性15 min;第一步擴增反應,94 ℃變性20 s,65～57 ℃退火并延伸60 s,10 個循環(huán),每個循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8 ℃;第二步擴增反應,94 ℃變性20 s,57 ℃退火并延伸60 s,32 個循環(huán)。 PCR 反應完成后進行熒光數(shù)據(jù)讀取,熒光數(shù)據(jù)的結果轉(zhuǎn)化成圖形。

表1 標記引物序列Table 1 Primers infornation of marker in this study

2 結果與分析

2.1 分子標記引物設計

抗稻瘟病基因Piz-t(GenBank:DQ352040.1)物理位置是的第6 號染色體10.38-10.39 Mb 區(qū)間內(nèi)(日本晴MSU 7.0),該位點有4 個已克隆的等位基因包括:來自小粒野生稻Pi9(GenBank:DQ285630.1);Pi2(GenBank: DQ352453)、Pigm(GenBank: KU904633.2) 和Pi50 (GenBank:KP985761.1),通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)Piz-t的第2348、2349 位堿基為TG 而其他基因為CT。 提該區(qū)間的SNP 位點和側翼序列,并利用在線引物設計網(wǎng)站http:/ /www.snpway.com/對其進行引物設計。 每組標記有3 條引物,在其中兩條特異性引物5’端分別連接FAM 和HEX 熒光序列。 標記引物F-TG 能跟PARMs master mix 中的FAM熒光特異結合,而F-CT 能夠與HEX 熒光特異結合,根據(jù)PCR 反應后產(chǎn)物的熒光信號的不同,判斷樣品的基因型。 如果樣品攜帶抗稻瘟病基因Piz-t,產(chǎn)物的熒光信號為FAM,否則為HEX(表1)。

2.2 抗稻瘟病基因Pizt 在遼寧省水稻品種中的分布

根據(jù)上述檢測方法,用標記Pizt-M1 對94 個水稻資源進行鑒定(表2)。 分子標記Pizt-M1 的分型圖,如圖2A 所示,橫坐標為FAM 熒光值,縱坐標為HEX 熒光值,每個點代表一個樣品,部分樣品HEX 熒光較強FAM 熒光較弱,位于圖的左上角,該部分樣品表示的基因型為CT,即非Pizt抗病基因。 位于左下角的樣品HEX 熒光和FAM熒光都較弱,為陰性對照,即非Pizt抗病基因。 檢測樣品中僅2 個表現(xiàn)出FAM 熒光較強,這兩個樣品為龍粳31 和遼開79,表示這2 個樣品在標記位點的基因型為TG,攜帶Pizt抗病基因。 綜合檢測結果表明Pizt基因未在檢測的粳稻品種中廣泛應用,后續(xù)可以導入Pizt基因定向改良稻瘟病抗性,Pizt-M1 可用于水稻Pizt基因的高效檢測。

表2 水稻資源中Pizt 基因的的鑒定Table 2 QTL of blast resistance

圖1 分子標記位點的序列比對Figure 1 Sequence alignment of molecular marker sites

圖2 分子標記Pizt-M1 的分型Figure 2 Shows the results of genotyping using the molecular marker Pizt-M1

2.3 分子標記在水稻分子輔助育種中的應用

為利用抗稻瘟病基因Pizt改良水稻品種的稻瘟病抗性,本研究以攜帶抗稻瘟病基因Pizt的龍粳31 與不攜帶抗稻瘟病基因Pizt遼星21 雜交,經(jīng)田間篩選后獲得55 個后代材料,利用Pizt-M1對這些后代進行檢測(圖2B)。 后代樣品中有一部分材料HEX 熒光較強而FAM 熒光較弱,該部分樣品的基因型為CT,即非Pizt抗病基因。 在后代材料里能夠檢測到攜帶純和抗病基因Pizt的后代材料,表現(xiàn)出FAM 熒光較強,位于圖的右下角。

與不同品種的分型圖比較發(fā)現(xiàn)多出了一部分位于圖片中間的樣品,這部分樣品HEX 熒光和FAM 熒光都較強,表明該位置的樣品即攜帶非Pizt抗病基因(CT)同時也攜帶Pizt抗病基因(TG),說明處于這個位置的水稻樣品攜帶Pizt的雜合基因型。 結果表明利用SNP 標記Pizt-M1 對Pizt基因的檢測準確,能夠檢測出攜帶的基因是否純合。 在利用SNP 標記Pizt-M1 進行分子標記輔助育種時能夠有效快速篩選到攜帶純合抗病基因Pizt的水稻株系。

3 結論與討論

本研究通過對Piz位點的5 個等位基因進行序列比對,找到了1 個能夠區(qū)分出Piz-t的SNP 位點,開發(fā)出相應的PARMS SNP 鑒定標記Pizt-M1。應利用該標記對水稻材料進行Piz-t基因檢測,可在秈稻、粳稻等不同種質(zhì)資源中快速、精準的檢測水稻稻瘟病抗性基因Piz-t,在育種后代材料的檢測中能夠很好的區(qū)分雜合基因型和純和基因型能夠有效的開展分子標記輔助選擇育種。 檢測過程中不需要酶切、電泳及測序等繁瑣的程序,減少PCR 產(chǎn)物氣溶膠的污染以及EB 等有毒物的使用,同時可在分子標記輔助育種的早期進行前景選擇和背景選擇,提高背景回復率,減小育種群體的規(guī)模,加快育種進程,有利于Pizt基因高效、環(huán)保的應用于水稻商業(yè)化分子育種中。

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻主要病害之一,嚴重影響水稻產(chǎn)量,威脅世界糧食安全[14]。 在水稻生產(chǎn)中,利用抗病水稻品種中的主效抗稻瘟病基因改良水稻品種抗性是最經(jīng)濟有效的辦法[15～16]。 至少報道了114 個主效基因,半數(shù)以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色體區(qū)域。 其中,最大的4 個基因簇分別位于第6、9、11 和12 染色體上[7]。 通過不斷深入研究,目前已有39 個基因成功克隆,包括第6 染色體上的Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t/Pi50、Pid2、Pid3、Pi25;第9 染色體上的Pi5/Pi3/Pii、Pi56;第11 染色體上的Pia、PiCO39、Pi1/Pik/Pik-h/Pi54/Pikp/Pikm、pb1;以及第12 染色體上的Pita和Ptr[8]。 育種家們利用分子標記輔助選擇技術已將部分基因?qū)氩煌脑耘嗟局袘糜谒旧a(chǎn)[11,13]聚合抗病基因?qū)⑻岣咚緦Φ疚敛〉目剐浴?有些重要的抗病位點存在多個不同的等位基因,而不同的等位基因的抗譜不同。 利用這些基因進行抗病育種,需要準確的、低成本、高通量的鑒定方法,才能夠在育種中大量應用。Piz位點具有5 個不同抗譜的抗病基因Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t/Pi50,因此如想有效利用該位點的抗病基因,需要開發(fā)能夠區(qū)分不同等位基因的特異性分標記,從而針對不同疫區(qū)生理小種選用不同的等位基因。

有學者利用水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性SNP 位點,開發(fā)了基于PCR 擴增產(chǎn)物條帶大小判斷其不同等位基因的分子標記,并成功應用與水稻資源的鑒定和分子標記輔助選擇育種中[17]。但是這種PCR 方法不能實現(xiàn)高通量、自動化操作,限制了其應用的前景。 PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system,五引物擴增受阻突變體系是由武漢市景肽生物科技有限公司自主研發(fā)的新型SNP 分子標記檢測技術,具有完全自主的知識產(chǎn)權[18]。 相比于目前最常用的基于PCR+電泳的SSR 技術,PARMS SNP 檢測技術免去了耗時費力的電泳技術,采用熒光掃描的方式直接讀取等位基因的基因型信號,配合數(shù)據(jù)分析軟件,可快速完成基因型分析工作,工作效率具有數(shù)量級的提升。 而且PARMS 技術非常適用于檢測自動化,配合GeneMatrix 高通量基因分型系統(tǒng),可以做到每天10 萬個數(shù)據(jù)點的超高通量,已成功應用在水稻抗稻瘟病分子輔助育種中[19]。