張妙蓮, 李婳婳, 潘焯儀, 趙強

江門市中心醫(yī)院產(chǎn)科、婦產(chǎn)兒生殖醫(yī)學臨床轉(zhuǎn)化及應用重點實驗室(廣東江門 529000)

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)是近年發(fā)展最快的產(chǎn)前染色體疾病篩查手段,檢測的是母體血漿中的胎兒游離DNA,主要來源于胎盤,因此NIPT所檢測到的染色體異常可分為以下3種情況:(1)胎兒染色體及胎盤染色體均異常;(2)限制性胎盤嵌合體(CPM),即只有胎盤染色體異常,胎兒染色體正常;(3)真性胎兒嵌合體(TFM),即異常染色體只存在胎兒組織中,胎盤染色體正常。有部分研究認為,CPM與流產(chǎn)、胎兒生長受限、宮內(nèi)死胎、孕高癥等相關(guān)[1-3]。對于胎兒染色體異常,已有大量病例數(shù)據(jù)及研究以預測胎兒預后情況。但對于CPM,目前國內(nèi)外關(guān)于胎兒妊娠結(jié)局的數(shù)據(jù)仍較少,對臨床遺傳咨詢造成困擾。以往研究一般是通過產(chǎn)前絨毛檢測意外發(fā)現(xiàn)的CPM,檢出率約為1.9%[4],但隨著NIPT在臨床上的廣泛應用,越來越多的CPM被檢出。本研究回顧性分析CPM病例染色體檢測結(jié)果,結(jié)合妊娠年齡、妊娠期合并癥、胎兒出生后情況等病史資料,探討CPM與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 數(shù)據(jù)來源于2017年10月至2021年11月行NIPT結(jié)果提示異常,羊水染色體檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果不一致的孕婦的胎盤組織樣本。剔除羊水染色體檢測結(jié)果異常、拒絕產(chǎn)前診斷、胎盤留取或檢測失敗樣本。剔除羊水染色體檢測結(jié)果異常、拒絕產(chǎn)前診斷、胎盤留取或檢測失敗樣本,共48例納入研究。

研究經(jīng)江門市中心醫(yī)院倫理審查(江心醫(yī)倫理審查[2023]42號)

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢測 抽取孕婦外周血約10 mL,離心采集血漿后提取胎兒游離DNA,使用胎兒染色體非整倍體(2號三體1、18號三體、13號三體)檢測試劑盒,按照實驗室標準操作規(guī)程進行文庫制備,使用BGISEQ-500測序儀進行測序及數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 染色體核型分析 抽取羊水20 mL或外周血3 mL,按照實驗操作規(guī)程進行細胞培養(yǎng)(羊水雙人雙線操作)、收獲、制片和G顯帶,使用全自動掃描儀分析系統(tǒng)掃描(德國蔡司),命名規(guī)則按照人類細胞遺傳學國際命名體制標準。

1.2.3 CMA檢測 抽取羊水10 mL提取基因組DNA,排除母血污染后,按照實驗標準操作規(guī)程進行片段化、PCR擴增、純化及標記,使用Cytoscan 750k芯片(美國Affymetrix公司)進行雜交。拷貝數(shù)目變異判讀規(guī)則按照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)和臨床基因組資源機構(gòu)(ClinGen)2019 年聯(lián)合發(fā)布的共識建議。命名規(guī)則按照人類細胞遺傳學國際命名體制標準。

1.2.4 胎盤染色體組織二代測序檢測 新鮮胎盤沖洗干凈后在胎盤子面及母面上、中、下各取3個黃豆大小胎盤組織,提取基因組DNA后,使用華大基因檢測平臺的低深度全基因組測序(CNV-Seq)進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 羊水染色體檢測結(jié)果 根據(jù)產(chǎn)前診斷及胎盤染色體檢測結(jié)果,分為CPM組及對照組。CPM組樣本NIPT結(jié)果陽性,產(chǎn)前診斷染色體檢測結(jié)果為陰性,但胎盤染色體檢測結(jié)果提示染色體非整倍體。對照組為NIPT結(jié)果陽性,產(chǎn)前診斷及胎盤染色體檢測結(jié)果均為陰性。CPM組有21例,對照組有27例樣本納入研究。

48例羊水細胞核型分析均未檢出異常核型,CPM組21號樣本CMA檢出21q22.3區(qū)域存在1.69 Mb可能致病的缺失片段(表1),其余47例樣本均未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)目變異或覆蓋致病性印記基因的純合區(qū)域(ROH)。

表1 22例CPM染色體檢測及臨床資料

2.2 胎盤染色體檢測結(jié)果 CPM組21例樣本胎盤驗證結(jié)果均涉及染色體非整倍體,結(jié)果見表1,檢出13號染色體三體5例(24%),7號染色體三體4例(19%),X染色體單體3例(14%),2號染色體三體2例(9.5%),X合并21號染色體單體1例,8號染色體三體、12號染色體三體、15號染色體三體、16號染色體三體、18號染色體三體、2號染色體三體0及2號染色體三體1各有1例。

2.3 CPM組及對照組妊娠情況分析 對照組孕婦妊娠年齡21～43歲,平均(31.43±5.02)歲,CPM組孕婦預產(chǎn)期年齡24～42歲,平均為(31.71±5.18)歲。對照組高齡妊娠有6例(22.22%),CPM組有7例(33.33%)。對照組孕婦在妊娠期間發(fā)生合并癥的有5例(18.52%),1例子癇前期,2例為妊娠期糖尿病(GDM),1例妊娠期高血壓,1例妊娠期血小板減少合并水腫。CPM組孕婦妊娠期合并癥有6例(30.00%),4例GDM,1例重度子癇前期,1例血栓前狀態(tài)。

2.4 CPM組及對照組妊娠結(jié)局 對照組無流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎或引產(chǎn),1例胎兒右腎輕度分離(7.2 mm),1例羊水偏少,其余25例胎兒超聲未見異常,27例新生兒順利分娩。分娩時孕周為31.3～40.9周,平均孕周為(38.71±2.0)周。CPM組1例胎兒超聲提示右手多指,3例提示羊水少,其中1例合并胎兒生長受限(FGR)。21號樣本因羊水細胞檢出21q22.3區(qū)域可能存在致病性缺失,孕婦堅決要求引產(chǎn),其余20例新生兒均順利分娩。CPM組分娩時孕周為35～41.3周,平均分娩孕周為(38.63±1.8)周(表2)。

表2 CPM組與對照組妊娠及新生兒出生情況分析

對照組新生兒出生體重1.25～3.68 kg,平均為(2.88±0.5)kg,平均出生體重Z-score為(-0.54±0.28)kg,小于胎齡兒(指出生體重<10%或<-2SD,SGA)有2例(7.41%),出生體重Z-Score分別為-3.01SD及-4.63SD。CPM組新生兒出生體重1.7～3.94 kg,平均為(2.88±0.5) kg,平均出生體重Z-score為(-0.48±0.36)kg,SGA有4例(20%)。4例SGA分別為16號染色體三體 1例(出生體重Z-Score: -2.61SD),13號染色體三體 1例(出生體重Z-Score: -3.29SD),嵌合X染色體單體2例(出生體重Z-Score分別為-2.79SD及-3.47SD)。

3 討論

染色體嵌合的發(fā)生是由于有絲分裂錯誤導致,體細胞有絲分裂染色體不分離,導致三體細胞及單體細胞的形成,但常染色體單體細胞會迅速凋亡,X單體細胞則一般能存活,三體細胞也可能在后續(xù)復制中丟失一條染色體而恢復成整倍體細胞[5]。胚胎組織分化發(fā)生于受精早期,囊胚一小部分細胞分化為胎兒,其他細胞則分化為胚胎外組織,如胎盤。因此,染色體有絲分裂錯誤發(fā)生的時間對異常細胞在胚胎的嵌合部位及嵌合比例影響重大。根據(jù)異常細胞嵌合的部位不同,可分為3種情況,即CPM、TFM及胎兒染色體及胎盤染色體均發(fā)生嵌合。

CPM根據(jù)異常染色體細胞的分布,分為3型。CPM Ⅰ型異常染色體細胞僅限于細胞滋養(yǎng)層,CPM Ⅱ型異常細胞局限于絨毛間質(zhì)核心,CPM Ⅲ型異常細胞同時分布在細胞滋養(yǎng)層及絨毛間質(zhì)層。根據(jù)細胞分布可以推測CPM Ⅰ及CPM Ⅲ會造成NIPT結(jié)果假陽性,Ⅱ型則不會干擾NIPT結(jié)果[6]。Grati等[7]在952例CPM中發(fā)現(xiàn)Ⅱ型CPM發(fā)生頻率最高,約46.73%,Ⅰ型及Ⅲ型分別占41.28%及11.97%。CPM Ⅰ及Ⅲ型三體細胞嵌合比例≥70%時,就有可能被NIPT檢出[7]。

因為只有Ⅰ型及Ⅲ型CPM才會對NIPT造成假陽性結(jié)果,本研究只納入Ⅰ型及Ⅲ型CPM作為研究對象。CPM中不同的異常染色體發(fā)生率差異大,有文獻報道在395例Ⅰ型及Ⅲ型CPM中,非整倍體發(fā)生率最高的依次為X染色體單體、7號染色體三體、13號染色體三體、3號染色體三體及2號染色體三體[6]。本研究CPM組中,發(fā)生率最高的為13號染色體三體、7號染色體三體、X染色體單體及2號染色體三體,共15例(68%)。

孕婦高齡是非整倍體配子形成的高危因素,且年齡越大,染色體異常配子的發(fā)生率越高[8-10],因此高齡也可能是形成CPM的潛在因素。但有多個研究發(fā)現(xiàn)CPM組與正常胎盤妊娠年齡無明顯差異[8-11],也有研究發(fā)現(xiàn)CPM Ⅲ組妊娠年齡更大[(39.7±2.6)歲vs. (37.1±3.2)歲][1]。本研究中CPM組與對照組妊娠年齡差異不大[(31.71±5.18)歲vs. (31.43±5.02)歲],但高齡妊娠比例CPM組要高于對照組(33.33%vs. 22.22%)。

胎盤在妊娠過程中發(fā)揮重要作用,一方面胎盤為胎兒提供發(fā)育所需的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì),同時清除代謝廢物,另一方面胎盤有重要的內(nèi)分泌功能,使母體環(huán)境適應胎兒的生長。CPM在臨床上并不罕見,CPM的胎盤功能是否會發(fā)生改變,從而導致妊娠狀態(tài)改變、胎兒發(fā)育異常及妊娠期合并癥等目前結(jié)論尚不明確。有研究觀察到CPM組妊高癥及CPM Ⅰ型組SGA發(fā)生率明顯高于對照組(10%vs. 2%、15%vs. 5%),而死胎、早產(chǎn)、先兆子癇和GDM的發(fā)生率則相似[1]。Tuohy等[12]報道分娩周數(shù)在正常胎盤與CPM (Ⅱ型+Ⅲ型)中差異無統(tǒng)計學意義,但在單獨的Ⅲ型中分娩周數(shù)明顯小于正常胎盤組[(35.7±3.77)周vs. (39.0±2.14)周]。值得注意的是,不同染色體非整倍體的CPM不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率差別較大。多篇文獻報道16號染色體三體的胎兒及CPM與子癇前期密切相關(guān)[13-14],13號染色體三體胎兒的孕婦罹患妊娠高血壓疾病及子癇前期風險比普通孕婦高2～20倍[15-17]。Spinillo等[18]總結(jié)多個研究的病例,發(fā)現(xiàn)CPM早產(chǎn)風險及低出生體重兒(<2.5 kg)差異無統(tǒng)計學意義,但SGA發(fā)生率是對照組2.45倍,在16號染色體三體 CPM組SGA發(fā)生率是對照組11.64倍。Wolstenholme等[5]研究發(fā)現(xiàn)CPM組不良妊娠結(jié)局風險不會增加,但出生低體重兒及出生高體重兒明顯增加。Eggenhuizen等[19]總結(jié)多篇文獻發(fā)現(xiàn),2、3、7、13、15、16 及22號染色體三體CPM與正常胎盤相比,發(fā)生FGR、早產(chǎn)、SGA風險明顯增高。

本研究通過27例對照組及20例CPM組樣本發(fā)現(xiàn)(第21例樣本孕婦堅決要求引產(chǎn)),CPM組孕期未出現(xiàn)先兆流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎,產(chǎn)程順利,新生兒Apgar評分均為10分。CPM組妊娠期合并癥主要是GDM,重度子癇前期在CPM組發(fā)現(xiàn)1例,為13號染色體三體 CPM。但CPM組妊娠期合并癥、胎兒超聲異常及SGA發(fā)生率均比對照組高,其中CPM組SGA發(fā)生率更是對照組的3.13倍(20%vs. 7.41%),分別為1例16號染色體三體、1例13號染色體三體及2例X染色體單體CPM。文獻[5]總結(jié)了80例CPM樣本,發(fā)現(xiàn)只有16號染色體三體 CPM及2號染色體三體 CPM各有1例宮內(nèi)死胎,其他染色體CPM均未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在流產(chǎn)和宮內(nèi)死胎,FGR則在多種CPM中均能發(fā)現(xiàn),包括16號染色體三體、13號染色體三體、2號染色體三體、15號染色體三體、X染色體單體、7號染色體三體等,與本研究樣本的觀察結(jié)果基本相符。7號染色體三體在CPM中較常見,有部分胎兒可有SGA。本研究有4例7號染色體三體,均是嵌合體,嵌合比例在37%～65%,推測50%左右嵌合型7號染色體三體CPM對胎盤功能影響較小,故未觀察到SGA病例。與宮內(nèi)死胎、妊娠期子癇及SGA高度相關(guān)的16號染色體三體及13號染色體三體 CPM[20-21],本研究受限于樣本量,目前只能收集到1例16號染色體三體 CPM及13號染色體三體 CPM 5例。16號染色體三體 CPM孕期發(fā)現(xiàn)羊水少,無妊高癥,新生兒出生體重為2.25 kg(-2.61SD),與Grau Madsen等[17]報道的1例16號染色體三體CPM癥狀相同,該例同樣孕期羊水過少出生后發(fā)現(xiàn)SGA。涉及13號染色體三體的CPM有4例為嵌合型CPM,除1例發(fā)現(xiàn)GDM外,其余均未發(fā)現(xiàn)妊娠期合并癥及新生兒異常。1例為13號染色體三體 CPM,新生兒右手多指且出生體重為2.12 kg(-3.47SD),目前未檢索到關(guān)于13號染色體三體 CPM出現(xiàn)多指的文獻病例報道。有3例胎兒超聲顯示羊水少(1例16號染色體三體 CPM、1例18號染色體三體 CPM及1例X染色體單體CPM。多篇文獻報道,除了妊娠期高血壓和子癇前期外,羊水減少或增多也常見于CPM病例中[19]。吳小青[21]發(fā)現(xiàn)1例13號染色體三體 CPM胎兒不僅有FGR還合并有大腦中動脈血流異常、左心室偏小、主動脈狹窄、羊水過少,1例2號染色體三體 CPM胎兒重度FGR,1例9號染色體三體 CPM胎兒FGR合并臍動脈阻力增高、大腦中動脈阻力減低、羊水減少、腸管回聲增強?？梢?羊水少在CPM中較常見。此外,CPM胎兒也是多器官先天畸形的高危人群[22-23]。Eggenhuizen等[19]總結(jié)了多個文獻,發(fā)現(xiàn)2號染色體三體、5號染色體三體、13號染色體三體及22號染色體三體等CPM均有胎兒畸形病例報道,癥狀有NT增厚、小頭畸形、搖椅足、脊柱畸形、FGR等,16號染色體三體 CPM胎兒畸形報道的病例最多,癥狀集中在單臍動脈、房室間隔缺損、NF增厚、顱面部畸形、尿道下裂。

文獻報道,在一些特殊的情況下,如異常細胞在不同組織嵌合比例差異大、三體及單體自救等,即使羊水穿刺染色體檢測,胎兒也可能由于低比例染色體非整倍體嵌合及單親二體(UPD)導致印記基因疾病或隱性基因遺傳病而發(fā)生先天性畸形[16]。本研究CPM組羊水均進行CMA檢測,可以排除4例胎兒超聲異常是由于胎兒組織存在UPD導致的隱性遺傳病引起,但難以排除胎兒組織局部出現(xiàn)細胞非整倍體低比例嵌合而沒有被羊水樣本捕獲到或者沒有被CMA及核型分析檢測到。

本研究顯示CPM組妊娠期合并癥、胎兒超聲異常及SGA發(fā)生率均比對照組高,SGA發(fā)生率更是對照組的3倍。由于受限于樣本量因素,并未進行統(tǒng)計學檢驗。上述研究結(jié)果也提示了通過NIPT意外發(fā)現(xiàn)的CPM,特別是對于13號染色體三體、16號染色體三體及X染色體單體CPM,孕期需要密切監(jiān)測妊娠期間生化指標的變化及胎兒B超,注意胎兒生長發(fā)育。

利益相關(guān)聲明:論文全體作者均知曉并同意論文投稿,并承諾無任何利益沖突。

作者貢獻說明:全體作者均參與了論文形成的全程工作。通信作者趙強提出研究選題及指導論文撰寫,張妙蓮負責課題設(shè)計、論文撰寫、數(shù)據(jù)分析工作,李婳婳和潘焯儀參與數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和分析。