楊平平, 李琳瑄, 劉新正, 宋沙偉, 馮新娜, 魏立

河南科技大學(xué)附屬黃河三門峽醫(yī)院檢驗(yàn)科(河南三門峽 472000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng),但其作為一種全身性自身免疫疾病,常累及心臟、肺臟、血液以及外周神經(jīng)等多種其他組織器官,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)相關(guān)性心腦血管病變作為RA的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵因素[1]。而多種脂肪因子可參與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)并發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)作為載脂蛋白家族的重要成員之一,其在正常生理狀態(tài)下主要由骨髓釋放,但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),受累器官將合成和釋放大量的NGAL入血,表現(xiàn)為血漿中NGAL濃度明顯增加,且NGAL濃度常與炎癥反應(yīng)程度存在顯著正相關(guān)性[2]。致動脈硬化指數(shù)(atherogenic index of plasma,AIP)是通過對三酰甘油(triglycerides,TG)與高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL-C)兩者比值進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換得到的參數(shù)值,臨床常用于動脈硬化易感程度的評估[3]。AS病理改變基礎(chǔ)即為脂代謝紊亂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷以及血管慢性炎癥反應(yīng),且頸動脈內(nèi)膜中層厚度(intima-media thickness,IMT)增厚與AS發(fā)生風(fēng)險存在正相關(guān)性,提示NGAL可能與AS發(fā)生、發(fā)展間存在密切聯(lián)系,特別是NGAL和AIP的關(guān)系尚且需要進(jìn)一步研究[4]。因此本研究通過觀察RA患者的血清NGAL、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)以及AIP變化情況,分析其與IMT以及相關(guān)炎性因子之間的相關(guān)性,以探討NGAL在AS中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院于2017年1月至2020年9月期間收治的192例RA患者作為研究對象,根據(jù)患者頸動脈IMT超聲檢查結(jié)果分為無斑塊組(98例)和斑塊組(94例),并以同期98例健康體檢者作為對照組。3組研究對象性別、年齡等一般資料對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均簽署知情同意書,本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)(K182739)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均符合RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];(2)斑塊組患者經(jīng)影像學(xué)和臨床檢查結(jié)果證實(shí)存在頸動脈粥樣病變且IMT>0.9 mm,且入組前3個月內(nèi)未接受過頸動脈粥樣病變相關(guān)治療;(3)無斑塊組患者影像學(xué)檢查結(jié)果顯示IMT≤0.9 mm[6];(4)所有患者均自愿參與研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入組前3個月內(nèi)發(fā)生過心源性腦栓塞、急性心肌梗死、腦出血等疾病者;(2)患有全身性感染、惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾病者;(3)伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能異?；驀?yán)重精神疾病者。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 全面收集所有研究對象的臨床資料,包括性別、年齡、病程、身高體重等信息。并統(tǒng)計患者入組后相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo):包括紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體等。

1.3.2 頸動脈IMT測量方法 采用CT彩色多普勒超聲顯像儀(生產(chǎn)廠家:飛利浦,型號:HDI 5000 sono)對所有研究對象頸部進(jìn)行超聲檢查,設(shè)置探頭頻率范圍為7.5～11.0 MHz。檢查時患者取平臥位,將頸部位置充分暴露出來后將探頭置于被檢查者頸部,從上而下方向、先縱后橫方向使用探頭對頸動脈斑塊進(jìn)行仔細(xì)探查,并分別對左、右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈以及頸動脈分叉部位的IMT值,每個位置各測定3次取平均值。

1.3.3 血漿 NGAL表達(dá)水平測定 分別于所有研究對象入組后,采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(廠家:Abcam中國)檢測所有研究對象的血漿 NGAL表達(dá)水平。所有操作均按照按試劑盒操作說明進(jìn)行,使用酶標(biāo)儀(生產(chǎn)廠家:賽默飛,型號:Varioskan LUX)進(jìn)行樣品檢測,并計算濃度。

1.3.4 實(shí)時定量PCR法檢測NF-κB mRNA表達(dá)量 取所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL,離心取血漿,將樣品轉(zhuǎn)移于EP管中并加入異丙醇0.5 mL,混勻并于室溫條件下靜置10 min。然后使用Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廠家:賽默飛)將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。NF-κB引物序列分別為正向5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′、反向5′-GGACATCTAAGGGCATCACA-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s,連續(xù)循環(huán)40次, 并于72 ℃ 條件下延伸10 min。最后均采用2-ΔΔct計算組織中NF-κB mRNA相對表達(dá)量(RQ)[7]。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、TC、TG對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),3組病程、HDL-C、LDL-C、ESR、CRP、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體、頸動脈IMT對比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,斑塊組和無斑塊組TG、LDL-C、CRP、ESR、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體、頸動脈IMT升高,HDL-C降低(P<0.001);且斑塊組病程、LDL-C、ESR、CRP、抗環(huán)瓜氨酸抗體、類風(fēng)濕因子以及頸動脈IMT高于無斑塊組(P<0.001),HDL-C低于無斑塊組(P<0.001),見表1。

表1 3組一般資料比較

2.2 3組NGAL水平、NF-κB mRNA表達(dá)量以及AIP指數(shù)比較 3組NGAL水平、NF-κB mRNA表達(dá)量以及AIP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),斑塊組和無斑塊組患者NGAL水平、NF-κB mRNA相對表達(dá)量及AIP指數(shù)高于對照組(P<0.05),且斑塊組NGAL水平、NF-κB mRNA相對表達(dá)量及AIP指數(shù)高于無斑塊組(P<0.05),見表2。

表2 三組NGAL水平、NF-κB mRNA表達(dá)量以及AIP指數(shù)比較

2.3 RA患者血漿 NGAL、 NF-κB mRNA水平與其他臨床指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,RA患者血漿 NGAL水平與中性粒細(xì)胞 NF-κB mRNA均與TG、LDL-C、ESR、CRP、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體、頸動脈IMT以及AIP呈正相關(guān)(P<0.05),與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 RA患者血漿 NGAL、 NF-κB mRNA水平與其他臨床指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析

2.4 影響IMT的多元逐步回歸分析 以頸動脈IMT為因變量,以性別(男性=0,女性=1)、年齡、病程體質(zhì)指數(shù)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ESR、CRP、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體、NGAL、NF-κB mRNA以及AIP為自變量,采用逐步回歸法篩選自變量,結(jié)果表明TG、HDL-C、LDL-C、NGAL、NF-κB、AIP、類風(fēng)濕因子均為影響頸動脈IMT的獨(dú)立因素(P<0.05)。見表4。

表4 響IMT的多元逐步回歸分析

3 討論

RA是一種慢性且需長期藥物干預(yù)治療的自身免疫性疾病,雖不具有直接致死性,但嚴(yán)重影響機(jī)體勞動能力;且近來大量研究證實(shí)RA患者發(fā)生AS、心肌梗死以及心力衰竭等相關(guān)心血管疾病的風(fēng)險明顯提高,大大縮短了RA患者壽命,而AS則為RA患者最重要的死因[8]。頸動脈粥樣硬化是由于頸總動脈管壁發(fā)生內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)沉積和斑塊生成,進(jìn)而導(dǎo)致血管管腔變窄和發(fā)生硬化的疾病;其病變過程主要包括三個階段,發(fā)展進(jìn)程依次為內(nèi)皮功能發(fā)生損害、內(nèi)膜厚度增加和血管內(nèi)形成斑塊,頸動脈粥樣硬化的典型早期病理改變是頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)增加,且IMT增厚程度與頸動脈粥樣硬化程度存在明顯正相關(guān)[9]。研究證實(shí)RA與頸動脈粥樣硬化之間具有共同的發(fā)病機(jī)制,兩者關(guān)系密切,特別是慢性炎癥反應(yīng)屬于兩種疾病的發(fā)病基礎(chǔ),均在兩種疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。吳瑞荷等[11]研究結(jié)果證實(shí)促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等不僅參與RA發(fā)生、發(fā)展過程,且對于RA心血管病具有一定預(yù)測價值。一方面,促炎因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以一定程度上改變RA患者HDL-C、LDL-C的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)AS以及其他相關(guān)心血管事件進(jìn)展。另一方面,RA會導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度增加,進(jìn)而誘導(dǎo)AS發(fā)生[12]。

近年來,脂肪相關(guān)因子在RA以及AS中的作用逐漸受到關(guān)注。NGAL是廣泛存在于機(jī)體多個組織器官中的一種多肽分子,可參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多種生物學(xué)過程[13]。NGAL對紅細(xì)胞前體細(xì)胞分化的抑制作用以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用已經(jīng)被充分證實(shí),且NGAL在多種惡性腫瘤組織中存在過度表達(dá),有學(xué)者認(rèn)為其可能屬于一種潛在的致癌基因[14]。黃星等[15]研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體發(fā)生胰腺炎等炎癥反應(yīng)過程中,粒細(xì)胞及炎癥反應(yīng)受累器官會大量釋放NGAL入血,且可以作為反映炎癥反應(yīng)程度的一種特異性標(biāo)志物。中性粒細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平是公認(rèn)的一種可炎癥損傷的關(guān)鍵標(biāo)志物,NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用,已有研究揭示TNF-α可通過NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)LDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)量,從而進(jìn)一步促進(jìn)AS進(jìn)展[16]。另外,當(dāng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致下游NF-κB信號通路被激活,可進(jìn)一步活化各種炎癥因子,被活化的炎癥因子活化又會進(jìn)一步加劇淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚集,進(jìn)而促進(jìn)炎癥損傷[17]。本文研究結(jié)果顯示,斑塊組和無斑塊組患者NGAL水平及NF-κB mRNA相對表達(dá)量高于健康對照組(P<0.05),且斑塊組NGAL水平及NF-κB mRNA相對表達(dá)量高于無斑塊組組(P<0.05)。與以往研究一致,提示RA作為一種系統(tǒng)性炎癥性疾病,表現(xiàn)為機(jī)體NGAL水平及NF-κB mRNA高表達(dá),且斑塊組患者的病情較無斑塊組患者嚴(yán)重,因此NGAL水平及NF-κB mRNA表達(dá)量高。此外,本文研究結(jié)果顯示,RA患者血漿NGAL水平與中性粒細(xì)胞NF-κB mRNA均與TG、LDL-C、紅細(xì)胞沉降率、CRP、類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體、頸動脈IMT以及AIP呈顯著正相關(guān),與HDL-C呈負(fù)相關(guān)。提示炎癥反應(yīng)可促進(jìn)RA患者AS的發(fā)生、發(fā)展,可能是NGAL通過激活NF-κB通路并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生和升級。而AIP是TG與HDL比值對數(shù)轉(zhuǎn)換值,研究發(fā)現(xiàn)AIP與LDL顆粒大小之間存在良好相關(guān)性[18],認(rèn)為AIP是可以有效反映AS危險程度的一種關(guān)鍵指標(biāo)。本研究進(jìn)一步多元逐步回歸分析顯示,TG、HDL-C、LDL-C、NGAL、NF-κB、AIP、類風(fēng)濕因子均屬于影響頸動脈IMT的獨(dú)立危險因素,說明上述因素均在AS的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮重要作用。我們推測:NGAL作為一種急性時相反應(yīng)蛋白,可募集炎癥細(xì)胞并誘導(dǎo)白細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放,進(jìn)而發(fā)揮抗炎抑菌功效;而慢性炎癥反應(yīng)貫穿于RA和AS啟動、形成和進(jìn)展整個病理過程,NGAL可能是通過調(diào)控NF-κB信號通路參與慢性炎性反應(yīng)過程,在AS病理過程中發(fā)揮作用[19]。

綜上所述,RA患者血漿中NGAL水平呈顯著高表達(dá),且與AS病變程度以及AIP之間具有密切相關(guān)性,其可能是通過激活NF-κB信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程參與AS發(fā)生和發(fā)展。但是此次研究存在一定局限性,RA患者NGAL參與AS發(fā)生和發(fā)展的具體作用機(jī)制尚不明確,仍需深入開展基礎(chǔ)研究進(jìn)行論證。

利益相關(guān)聲明:本研究無利益沖突!

作者貢獻(xiàn)說明:楊平平、劉新正:研究實(shí)施,撰寫論文;李琳瑄、宋沙偉:數(shù)據(jù)整理分析,統(tǒng)計學(xué)分析;馮新娜、魏立:論文修改,研究指導(dǎo),資金支持。