謝曉娟, 蘭天, 高晶

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染管理處(河北張家口 075000)

醫(yī)院感染是指患者住院期間發(fā)生的感染和院內(nèi)獲得后在院外發(fā)生的感染,雖然不斷的有新的抗菌藥物被開發(fā)出來,但細(xì)菌耐藥性也在增加[1],而且臨床篩檢手段落后難以及時(shí)針對性用藥,導(dǎo)致感染發(fā)生率居高不下,感染并發(fā)癥也提高了患者的死亡率[2-3]。由于高強(qiáng)度應(yīng)用抗菌藥物以及廣泛開展介入操作導(dǎo)致凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)感染率逐年上升,CNS在革蘭陽性菌群中檢出率高達(dá)30%[4],且CNS中耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)占比90%[5],MRCNS具有多重耐藥性,在藥物應(yīng)用和選擇方面受到諸多限制,提高了臨床治療難度與成本。葡萄球菌在自然界廣泛存在,多為非致病腐物寄生菌[6],金黃色葡萄球菌是常見的病原菌,在人鼻咽部及頭發(fā)上大量存在,報(bào)道稱普通人鼻咽部葡萄球菌帶菌率為30%左右[7],醫(yī)務(wù)人員金黃色葡萄球菌帶菌率在50%～70%[8]。CNS是指不含凝固酶的葡萄球菌,該菌由于缺乏凝固酶無法促使血漿凝固以及纖維蛋白沉積,使感染容易擴(kuò)散[9]。CNS對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等抗菌藥物均有不同程度的耐藥,其耐藥機(jī)制復(fù)雜,當(dāng)菌株本身的耐藥基因被激活或者引入外來耐藥基因均可以表現(xiàn)出耐藥[10]?；诖?本研究對2020年10月1日至2021年9月30日全院醫(yī)院感染患者CNS的藥敏情況及相關(guān)耐藥基因進(jìn)行研究,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年10月1日至2021年9月30日全院臨床分離的CNS株共267株,菌株分離自患者痰液微生物送檢標(biāo)本,患者94例,男65例,女29例;年齡41～77歲,平均(65.34±4.82)歲。本次研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 按照第四版《全國檢驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)程》對菌株進(jìn)行分離,之后使用采用PHOENIX 100全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(美國BD公司)對菌株進(jìn)行鑒定,采用增菌培養(yǎng)法對菌株進(jìn)行培養(yǎng)。通過Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法(Oxoid公司)與E-test法(鄭州安圖生物工程股份有限公司)對分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),分別檢測菌株對青霉素G、苯唑西林、慶大霉素、利福平、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素、四環(huán)素13種抗菌藥物的敏感度。藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷,分為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。敏感率=敏感菌株數(shù)/總株數(shù)×100%,耐藥率=耐藥菌株數(shù)/總株數(shù)×100%。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(國家臨床檢驗(yàn)中心)。

1.2.2 耐藥基因 首先制備菌株DNA,將凍存的菌株復(fù)溫后接種于MH營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)16 h,之后選取MH平板上的單個(gè)CNS菌落并將其全部溶于含有溶菌酶的核酸緩沖液中,37℃恒溫30 min,100℃恒溫15 min,之后12 000 r/min離心10 min并取上清液。檢測基因包括mecA(耐β-內(nèi)酰胺類)、aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ(耐氨基糖苷類)、tetM(耐四環(huán)素類)、ermA和ermC(耐大環(huán)內(nèi)酯類)、qacA/B/C(耐消毒劑類)、gyrA(耐喹諾酮類),基因引物設(shè)計(jì)、訂購于上海生工有限公司。擴(kuò)增體系為25 μL(mix 2×12.5 μL、Taq 1 μL、正反引物各1 μL、DNA樣本1 μL,dd水8.5 μL),適度離心混勻放入擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)置陰性對照與陽性對照。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)35次,72℃延伸10 min。

1.2.3 基因測序 采用RT-PCR對一個(gè)CNS菌株進(jìn)行測序,首先制備菌株DNA,將凍存的菌株復(fù)溫后接種于MH營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)16 h,之后選取MH平板上的單個(gè)CNS菌落并將其全部溶于含有溶菌酶的核酸緩沖液中,37℃恒溫30 min,100℃恒溫15 min,之后12 000 r/min離心10 min并取上清液。

2 結(jié)果

2.1 CNS菌種分布 CNS共267株,其中占比最大的菌種為表皮葡萄球菌共140株,占比52.43%;其次為人葡萄球菌共39例,占比14.61%。見表1。

表1 CNS菌種分布

2.2 CNS藥敏試驗(yàn)情況 CNS共267株,其中MRCNS 204株,占比76.40%,未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥株。見表2。

表2 CNS藥敏試驗(yàn)情況 %

2.3 CNS耐藥基因分析 CNS共267株,其中94.75%的菌株攜帶mecA耐藥基因,74.15%攜帶ermA耐藥基因,69.66%攜帶tetM耐藥基因。見表3。

2.4 臨床結(jié)局單因素logistic回歸分析 臨床結(jié)局分為:治愈、好轉(zhuǎn)、無效與惡化;其中治愈與好轉(zhuǎn)為良好臨床結(jié)局。分析患者年齡、性別、耐藥基因?qū)α己门R床結(jié)局的影響,由研究結(jié)果可知年齡、mecA基因耐藥基因、qacA/B/C耐藥基因?yàn)镃NS良好臨床結(jié)局的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 良好臨床結(jié)局單因素logistic回歸分析

3 討論

由于高強(qiáng)度應(yīng)用抗菌藥物以及開展中心靜脈置管等介入操作,醫(yī)院感染率近年呈現(xiàn)上升趨勢,臨床常常經(jīng)驗(yàn)性給予患者青霉素及頭孢類抗菌藥物,非針對性用藥不僅難以達(dá)到理想的療效也會導(dǎo)致耐藥菌株增加,引發(fā)患者自身菌群失調(diào)使病情變得復(fù)雜[11]。革蘭陽性菌占所有致病菌的44%,金黃色葡萄球菌與CNS為革蘭陽性菌的主要致病菌,CNS在空氣、皮膚表面等廣泛存在,屬于正常菌群,臨床常規(guī)多作為污染菌株處理,但是介入操作等侵入性操作的增多使CNS成為醫(yī)院感染的重要病原菌[12],染色體胞間黏附基因能夠使CNS吸附在光滑材料表面,之后胞間凝集素能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附,細(xì)菌包埋于黏附物之中形成生物膜。生物膜能夠阻斷抗生素與細(xì)菌接觸[13],使抗菌藥物的實(shí)際有效濃度下降,同時(shí)生物膜能夠覆蓋細(xì)菌表面的抗原位點(diǎn),表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性。CNS可以導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥等[14]。

本次研究分離CNS共267株,其中占比最大的菌種為表皮葡萄球菌共140株,占比52.43%;其次為人葡萄球菌共39例,占比14.61%。在267株CNS中,MRCNS 204株,占比76.40%,未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥株;臨床可以將萬古霉素及利奈唑胺作為抗菌首選藥物,MRCNS 呈現(xiàn)高度耐藥性和多重耐藥性,對青霉素G、苯唑西林、克林霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等都具有60%以上的耐藥率,其中對青霉素、苯唑西林耐藥率極高,應(yīng)該避免將其作為首選治療藥物。267株CNS中,94.75%的菌株攜帶mecA耐藥基因,74.15%攜帶ermA耐藥基因,69.66%攜帶tetM耐藥基因。分析患者年齡、性別、耐藥基因?qū)εR床結(jié)局的影響,由研究結(jié)果可知年齡、mecA基因耐藥基因、qacA/B/C耐藥基因?yàn)镃NS臨床結(jié)局的影響因素(P<0.05)。mecA 基因可以編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白,使細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺酶親和力下降,引發(fā)耐藥,菌株質(zhì)?？梢越閷?dǎo)產(chǎn)生大量 β-內(nèi)酰胺酶,其可以水解 β-內(nèi)酰胺使 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物失效[15-17]。 攜帶有mecA以外的耐藥基因,使菌株具有多重耐藥性。aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ能夠編碼氨基糖苷類修飾酶[16],能夠使菌株對慶大霉素等高度耐藥,兩種耐藥基因單獨(dú)或共同存在均可以產(chǎn)生耐藥作用,目前仍有不同的觀點(diǎn)認(rèn)為兩者為氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要基因。ermA、ermC耐藥基因可以編碼產(chǎn)生紅霉素甲基化酶,能夠促進(jìn)病原菌生物膜表型發(fā)生變化產(chǎn)生耐藥性[18-19],有研究發(fā)現(xiàn)ermC基因表達(dá)水平越高,菌株對紅霉素的抗性會隨之升高[20]。有研究顯示90%以上的紅霉素耐藥菌株會攜帶一種以上的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因,但是仍由部分紅霉素耐藥菌株無erm、msr等基因,提示存在其他耐藥機(jī)制[21-22]。有研究調(diào)查顯示50%以上的CNS菌株質(zhì)粒中均存在qacA/B/C基因,其可以表達(dá)消毒劑外排蛋白,其表達(dá)會顯著提高菌株對消毒劑的耐力,提示臨床消毒并無法徹底除菌,應(yīng)該注意自身防護(hù)[23-24]。

綜上所述,感染CNS可首選萬古霉素、利奈唑胺進(jìn)行抗菌治療,CNS耐藥涉及多種耐藥機(jī)制,且單個(gè)菌株常合并表達(dá)多個(gè)耐藥基因,經(jīng)單因素logistic回歸分析結(jié)果顯示mecA與qacA/B/C耐藥基因?yàn)榛颊吲R床結(jié)局的獨(dú)立影響因素。

利益相關(guān)聲明:所有作者無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:謝曉娟、蘭天負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)與論文撰寫;高晶負(fù)責(zé)病例收集與統(tǒng)計(jì)分析。