王見璋, 李煒霞, 黃金鳳, 何志明

廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院病理科(廣東佛山 528333)

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是僅次于肝細(xì)胞癌的第二大原發(fā)性肝癌,占肝臟原發(fā)腫瘤的5%～15%,近年來發(fā)病率逐漸升高[1]。ICC惡性程度高,發(fā)病隱匿,侵襲性強(qiáng),5年生存率低[2]。ICC起源于二級膽管及其以上肝內(nèi)膽管分支上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。近年來有關(guān)研究顯示肝祖細(xì)胞甚至成熟的肝細(xì)胞也可能發(fā)展成為ICC。ICC明顯的異質(zhì)性導(dǎo)致缺乏有效的靶向療法。目前ICC分子靶向治療研究包括成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、異檸檬酸脫氫酶(IDH)抑制劑、內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、RAS/RAF/MEK/MAPK等信號通路、微小RNA靶點等[3-9]。但多數(shù)分子靶點研究尚處于臨床研究實驗階段。神經(jīng)營養(yǎng)性受體酪氨酸激酶(NTRK)是負(fù)責(zé)編碼原肌球蛋白相關(guān)激酶(Trk)的基因。近年研究發(fā)現(xiàn),Trk激酶與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡化有關(guān),Trk是腫瘤治療的重要靶點,將靶向治療納入治療方案將會提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。有研究發(fā)現(xiàn)ICC中存在RAS/RAF/MEK/MAPK等信號通路發(fā)生改變[9],這些通路與Trk激酶通路有部分是重疊的通路。因此,我們設(shè)想Trk通路也許在ICC中也會發(fā)生改變。本研究旨在通過檢測pan-TRK蛋白在ICC中的表達(dá)情況,探討ICC中是否存在Trk信號通路的改變,為ICC的尋找新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月至2023年1月在本院治療的并已行病理組織學(xué)檢查的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌病例126例,根據(jù)是否存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組及對照組,其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組83例,對照組43例。126例男99例,女27例;年齡19～79歲,平均(64±10.7)歲,中位年齡66歲;所有病例均未行相關(guān)分子靶向治療。研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院倫理委員會審查通過(KY2022049)。

1.2 方法 所有標(biāo)本均用10%甲醛溶液固定6 h以上。后經(jīng)取材、脫水、包埋、切片、HE染色、光鏡下觀察組織形態(tài)。免疫組化采用EnVision法,運(yùn)用LUMATAS BIOSYSTEMS 全自動免疫組化檢測平臺,檢測ICC細(xì)胞pan-TRK蛋白的表達(dá)。pan-TRK抗體(兔單克隆抗體,克隆號:EPR17341)購自英國Abcam公司,稀釋比例為1∶500;Lumatas專用二抗及顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。pan-TRK的判讀標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10],以組織內(nèi)的周圍神經(jīng)組織為內(nèi)在陽性對照,星形細(xì)胞瘤組織為外在陽性對照(圖1-A)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師獨(dú)立閱片判斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。pan-TRK蛋白表達(dá)的陽性率比較采用Pearson2檢驗分析,pan-TRK蛋白與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌相關(guān)臨床病理因素Ki67指數(shù)之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pan-TRK蛋白在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)模式 126例ICC中有8例表達(dá)pan-TRK蛋白,其中有4例表現(xiàn)為細(xì)胞漿均勻的中等強(qiáng)度至弱的棕黃色顆粒(圖1-B);有3例表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)中等強(qiáng)度棕黃色顆粒(圖1-C);有1例表現(xiàn)為散在的胞漿中等強(qiáng)度棕黃色顆粒(圖1-D)。

2.2 pan-TRK蛋白在不同組別的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中表達(dá)的差異 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組83例標(biāo)本中有8例表達(dá)pan-TRK蛋白,陽性率為9.64%;對照組43例標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)陽性病例,陽性率為0%;兩組pan-TRK蛋白表達(dá)的陽性率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=4.426,P=0.035,表1)。

表1 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與對照組pan-TRK蛋白陽性率的比較 例

2.3 pan-TRK蛋白與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌相關(guān)臨床病理因素的相關(guān)性 pan-TRK蛋白表達(dá)與ICC患者性別、年齡、腫瘤病理分型、分化程度等臨床病理因素的相關(guān)性,Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示pan-TRK蛋白與上述臨床病理因素均無顯著相關(guān)性(P>0.05),見表2。

表2 pan-TRK蛋白與ICC患者臨床病理因素的相關(guān)性分析 例

2.4 pan-TRK蛋白與肝內(nèi)膽管細(xì)胞Ki67指數(shù)的相關(guān)性 分析pan-TRK蛋白表達(dá)與ICC組織Ki67指數(shù)的相關(guān)性,pan-TRK蛋白陽性病例與陰性病例相對應(yīng)的ICC組織Ki67指數(shù)主要集中在6%～50%之間,Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示pan-TRK蛋白與Ki67指數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05),表3。

表3 pan-TRK蛋白與ICC 組織Ki67指數(shù)的相關(guān)性分析 例

3 討論

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)是一種高度惡性的難治性肝臟惡性腫瘤,預(yù)后較肝細(xì)胞癌差,總體5年生存率不足10%。根治性手術(shù)切除仍然是ICC患者獲得長期生存率的主要治療手段。但是,只有不到30%的患者可以獲得根治性手術(shù)切除的機(jī)會。目前ICC缺乏有效的靶向療法。對分子發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解以及靶向治療方法的發(fā)展為我們提供了改善 ICC 預(yù)后的希望。

神經(jīng)營養(yǎng)性受體酪氨酸激酶(neurotrophic receptor tyrosine kinase,NTRK)基因是新型抗癌藥拉羅替尼(larotrectinib)的靶點,包括NTRK1、NTRK2、NTRK3三位家族成員,分別位于染色體1q22、9q21、15q25不同區(qū)段,負(fù)責(zé)編碼原肌球蛋白相關(guān)激酶(tropomyosin-relatedkinase,Trk)家族蛋白 TrkA、TrkB 和 TrkC[11]。當(dāng)TrkA、TrkB和TrkC與其相應(yīng)的配體結(jié)合后觸發(fā)受體二聚體化和磷酸化,激活下游PI3K、RAS/MAPK/ERK 和PLC-γ的信號級聯(lián)通路,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等生物學(xué)過程[12]。Trk 激酶與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NTRK基因改變有多種形式,其中已明確與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的最常見形式是NTRK基因融合[13]。NTRK基因融合在多種實體瘤中出現(xiàn)[14-16],包括肺癌、乳腺分泌性癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、梭形細(xì)胞腫瘤等。與NTRK發(fā)生融合的伙伴基因眾多,包括最常見的ETV6-NTRK3和TPM3-NTRK1,還有LMNA-NTRK1、PAN3-NTRK2、BCAN-NTRK1、BTBD1-NTRK3等[17]。

目前檢測NTRK基因融合的方法有IHC(免疫組化)、FISH、RT-PCR、NGS等,其中pan-TRK蛋白IHC被認(rèn)為是可靠、快捷的篩選方法。Hechtman等[10]收集了明確有NTRK基因融合的病例進(jìn)行pan-TRK蛋白免疫組化檢測,證實pan-TRK蛋白免疫組化檢測對于NTRK基因融合具有很高的敏感性和特異性,同時發(fā)現(xiàn)pan-TRK蛋白不同表達(dá)模式提示不同的NTRK基因融合組合形式。半數(shù)的ETV6-NTRK3及全部TPM3-NTRK1表現(xiàn)為胞漿陽性,半數(shù)ETV6-NTRK3及全部LMNA-NTRK1表現(xiàn)為核及核膜染色等。其表達(dá)模式也許與相對應(yīng)的基因編碼蛋白的定位相關(guān)。本研究126例標(biāo)本中有8例發(fā)現(xiàn)pan-TRK蛋白表達(dá),總陽性率為6.35%。提示ICC發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在NTRK基因融合及Trk信號通路的改變。不同的表達(dá)模式提示ICC中可能存在不同的NTRK基因融合。8例陽性病例中有4例表現(xiàn)為均勻的胞漿染色,提示這些病例有可能存在ETV6-NTRK3或TPM3-NTRK1等NTRK基因融合改變;3例表現(xiàn)為核染色,提示這些病例可能存在ETV6-NTRK3、LAMNA-NTRK1等融合;1例表現(xiàn)為胞漿散在顆粒狀染色,提示可能存在其他類型的NTRK融合。但這些融合改變是否存在仍需進(jìn)一步深入研究證實。

值得注意的是,本研究所有陽性病例均為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的病例,與對照組的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示ICC可能存在NTRK基因改變及Trk信號通路改變,并且與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們進(jìn)一步分析了pan-TRK蛋白的表達(dá)與ICC病例的性別、年齡、病理分型、腫瘤分化程度的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)pan-TRK蛋白與ICC相關(guān)臨床病理因素?zé)o相關(guān)性。

Ki67是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核蛋白,由MKI67基因編碼,在維持細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。Ki67表達(dá)于細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期,G0期不表達(dá)。Ki67與許多腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),是臨床工作中運(yùn)用最為廣泛的重要的預(yù)后指標(biāo)。我們分析pan-TRK蛋白的表達(dá)與腫瘤Ki67指數(shù)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)兩者之間無顯著的相關(guān)性,提示NTRK基因在ICC中的作用機(jī)制可能與細(xì)胞增殖的關(guān)系不大。但由于陽性病例數(shù)相對不足,研究結(jié)果還需進(jìn)一步研究證實。

我們的研究發(fā)現(xiàn)了ICC病例中存在pan-TRK蛋白的表達(dá),并出現(xiàn)不同的表達(dá)模式,且似乎與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但I(xiàn)CC病例中pan-TRK蛋白的陽性率低,ICC與NTRK基因及Trk信號通路改變的相關(guān)性需待更廣泛的病例研究證實。此外,雖然我們的病例出現(xiàn)pan-TRK蛋白表達(dá),但這些病例目前尚未進(jìn)行相關(guān)NTRK基因檢測,這是我們研究的不足。下一步我們將對pan-TRK陽性的ICC病例進(jìn)行更加深入的研究。為進(jìn)一步闡明ICC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及尋找新的分子治療靶點提供依據(jù)。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:王見璋負(fù)責(zé)論文設(shè)計、結(jié)果分析及論文撰寫;李煒霞負(fù)責(zé)免疫組化檢測; 黃金鳳負(fù)責(zé)文章修改及行政支持;何志明負(fù)責(zé)切片制作。