王文晶,盛 帥,任建濤,黃旭東

0 引言

研究表明,波段為400～500nm的藍(lán)光是導(dǎo)致視網(wǎng)膜光損傷的主要危險因素[1-3],低照度藍(lán)光可誘發(fā)慢性視網(wǎng)膜光損傷,高照度(>1000lx)藍(lán)光亦可致急性視網(wǎng)膜光損傷,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變[4-6]和血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞[7]。目前針對視網(wǎng)膜光損傷[8]的研究主要集中于分子機(jī)制[6, 9-11]及組織細(xì)胞學(xué)改變,但對于較為直觀的影像、功能及活體形態(tài)學(xué)的檢查研究較少,本研究采用眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)和石蠟病理組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色法對不同時長強藍(lán)光照射導(dǎo)致的大鼠視網(wǎng)膜損傷進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選擇8周齡健康無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠48只,購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司(合格證號:37072610100978471),實驗前大鼠進(jìn)行眼底篩查,排除原有眼部疾病,實驗動物的飼養(yǎng)和使用均遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定,本研究經(jīng)濰坊眼科醫(yī)院動物實驗倫理委員會審批(批文號:2020-院內(nèi)倫審-01-01)。

1.1.2主要試劑及儀器主要試劑:蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司);歷設(shè)得熒光素鈉注射液(Cardinal Health Manufacturing Services B.V.公司);玻璃酸鈉滴眼液(URSAPHARM Arzneimittel GmbH,德國);無水乙醇(江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司)。主要儀器:多聚賴氨酸黏附載玻片(江蘇世泰實驗器械有限公司);病理組織包埋盒(江蘇世泰實驗器械有限公司);10%中性福爾馬林組織固定液(江蘇世泰實驗器械有限公司);FFA(海德堡同步共焦激光眼底熒光造影儀,德國);OCT(海德堡SPECTRALIS光學(xué)相干斷層掃描儀,德國);465nm LED藍(lán)光燈板(徐州愛佳電子科技有限公司);石蠟病理切片機(jī)、石蠟病理包埋機(jī)、攤片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1實驗設(shè)備的制作采用545mm×395mm×200mm的PP塑料飼養(yǎng)籠,飼養(yǎng)籠四周內(nèi)側(cè)壁安裝反光面板,定制波長為465±5nm可調(diào)節(jié)功率的面陣式LED燈藍(lán)光發(fā)光板[12],將發(fā)光板置于飼養(yǎng)籠上方,調(diào)節(jié)LED燈亮度與高度,根據(jù)預(yù)實驗中不同藍(lán)光光照度下大鼠眼底改變情況,且考慮到本實驗研究因素為強藍(lán)光,將1000±100lx作為本研究的光照度值。

1.2.2實驗分組選取8周齡SPF級健康SD雄性大鼠48只,隨機(jī)分為對照組(n=12)和實驗組(n=36),其中對照組大鼠每日接受自然光照;實驗組大鼠根據(jù)光照時間不同分為3個組,每組12只,每日分別接受波長465±5nm、光照度1000±100lx的藍(lán)光照射3、6、12h,照射過程中每隔3h人為攪動大鼠,使之處于活動狀態(tài),以盡量保證大鼠眼睛接受足夠時長的光照。本研究采取標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)方法,連續(xù)光照8wk,采用OCT、FFA和石蠟病理組織切片觀察不同方位及不同分層視網(wǎng)膜厚度、視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和功能變化。

1.2.3OCT檢查對照組和實驗組大鼠采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳,2%戊巴比妥鈉麻醉劑(2mL/kg)腹腔注射麻醉,玻璃酸鈉滴眼液濕潤角膜,OCT掃描測量大鼠視盤上方、下方、鼻側(cè)、顳側(cè)距視盤邊緣約2mm處的視網(wǎng)膜總厚度,使用系統(tǒng)自帶軟件手動測量各方位視網(wǎng)膜總厚度,即視網(wǎng)膜內(nèi)界膜(internal limiting membrane,ILM)至視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)層的厚度,取各方位視網(wǎng)膜總厚度的平均值作為平均視網(wǎng)膜總厚度(mean total retinal thickness,mTRT)。為進(jìn)一步分析大鼠視網(wǎng)膜不同分層厚度的變化,分別于上述相同位置測量視網(wǎng)膜ILM-內(nèi)核層(inner nuclear layer,INL)、外叢狀層(outer plexiform layer,OPL)-光感受器外節(jié)段(outer segment,OS)和RPE層厚度,取4個方位視網(wǎng)膜各層厚度的平均值作為該層視網(wǎng)膜最終厚度值。

1.2.4FFA檢查對照組和實驗組大鼠快速腹腔注射10%熒光素鈉注射液(0.8mL/kg)后,立即拍攝眼底視盤及其余各方位視網(wǎng)膜血管造影圖像,保存圖片進(jìn)行影像學(xué)分析。

1.2.5視網(wǎng)膜石蠟病理組織切片制備對照組和實驗組大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉劑麻醉致死,快速摘取眼球,剪除多余組織,生理鹽水沖洗眼球后置于10%中性福爾馬林組織固定液中24～48h。取出眼球于1×PBS中性緩沖液中浸泡約1h,沿角膜緣剪除角膜,摘除晶狀體,將眼球剩余組織依次浸入由低濃度到高濃度的梯度乙醇溶液及二甲苯溶液中脫水,60℃浸蠟2h,將眼球矢狀面平行于包埋盒進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟標(biāo)本垂直固定于切片機(jī),調(diào)整切片厚度4μm,平行于視神經(jīng)進(jìn)行切片,于45℃溫水中將切片展平,鋪于多聚賴氨酸黏附性載玻片后標(biāo)記,置于60℃溫箱中烘干1.5h。取出載玻片,再依次置于二甲苯溶液、由高濃度到低濃度的梯度乙醇溶液內(nèi)脫蠟、復(fù)水,HE染色,脫水、透明,中性樹膠封片,電子顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層組織形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠OCT檢查結(jié)果采用OCT掃描檢查各組大鼠視網(wǎng)膜,對照組和3h實驗組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)信號清晰,神經(jīng)纖維層和RPE層為高反射信號,內(nèi)叢狀層、外叢狀層為中等反射信號,內(nèi)核層、外核層和感光細(xì)胞層為低反射信號(圖1A、B);6h和12h實驗組大鼠外核層厚度明顯變薄,光感受器內(nèi)外段(inner segment/outer segment,IS/OS)表現(xiàn)為不規(guī)則高反射信號,局部RPE層信號減弱(圖1C、D)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜OCT檢查結(jié)果 A:對照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰,RPE層呈均勻高反射信號(綠箭頭),可清晰分辨脈絡(luò)膜層;B:3h實驗組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰,外核層(紅箭頭)厚度明顯大于內(nèi)核層(黃箭頭),RPE層信號連續(xù);C:6h實驗組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度明顯變薄,IS/OS界限模糊(藍(lán)箭頭),RPE層信號模糊;D:12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層見多個點團(tuán)狀高反射信號(紫箭頭),外核層(紅箭頭)厚度明顯小于內(nèi)核層,IS/OS和RPE層明顯萎縮,視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜界限模糊。

各組大鼠組內(nèi)4個方位視網(wǎng)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但各組大鼠組間4個方位視網(wǎng)膜厚度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且對照組和3h實驗組大鼠上方視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.071),其余各方位視網(wǎng)膜厚度組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。各組大鼠平均視網(wǎng)膜總厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各組大鼠ILM-INL厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且對照組與3h和12h實驗組大鼠ILM-INL厚度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其余各組間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);各組大鼠OPL-OS厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且各組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各組大鼠RPE層厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且對照組與3h和6h實驗組、3h與6h實驗組大鼠RPE層厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),12h實驗組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表1 各組大鼠不同方位視網(wǎng)膜厚度比較

表2 各組大鼠各層視網(wǎng)膜厚度比較 μm

2.2各組大鼠FFA檢查結(jié)果FFA檢查結(jié)果顯示,所有大鼠視盤均位于視網(wǎng)膜后極部正中央,視網(wǎng)膜血管走行呈放射狀,對照組(圖2A～C)和3h實驗組(圖2D～F)大鼠視網(wǎng)膜動靜脈血管粗細(xì)均勻且連續(xù),動靜脈管徑比值為1∶2～2∶3,視盤及視網(wǎng)膜未見明顯熒光滲漏;6h實驗組大鼠視網(wǎng)膜血管充盈,動靜脈粗細(xì)均勻,走行正常,視盤無熒光滲漏,中周部視網(wǎng)膜可見點片狀熒光滲漏(圖2G～I(xiàn));12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜動靜脈血管變細(xì),毛細(xì)血管走行紊亂,全視網(wǎng)膜散在熒光滲漏、彌漫點團(tuán)狀低熒光及透見熒光,脈絡(luò)膜背景熒光增強(圖2J～L)。

圖2 各組大鼠FFA檢查結(jié)果 A～F:對照組(圖A～C)和3h實驗組(圖D～F)大鼠視網(wǎng)膜血管充盈、走行正常,無明顯熒光滲漏;G～I(xiàn):6h實驗組大鼠視網(wǎng)膜視盤處無熒光滲漏,中周部視網(wǎng)膜可見點片狀熒光滲漏(紅箭頭)及少量點團(tuán)狀低熒光區(qū)(黃箭頭);J～L:12h實驗組大鼠全視網(wǎng)膜散在點團(tuán)狀低熒光(黃箭頭)、斑片狀透見熒光及大面積熒光滲漏(紅箭頭),脈絡(luò)膜背景熒光增強。

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜組織形態(tài)學(xué)變化情況,對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)正常,層次分明(圖3A);3h實驗組大鼠視網(wǎng)膜視細(xì)胞排列約8～9層,細(xì)胞數(shù)目較對照組稍減少,間隙增大,排列紊亂,未見其他明顯病理組織學(xué)改變(圖3B);6h實驗組大鼠視網(wǎng)膜與3h實驗組相比,視細(xì)胞層細(xì)胞排列明顯紊亂,細(xì)胞間隙增大,層數(shù)減少至5～6層,部分細(xì)胞核染色欠均勻,出現(xiàn)核固縮、核碎裂病理學(xué)表現(xiàn),RPE層局部萎縮變薄,細(xì)胞排列稀疏,脈絡(luò)膜纖維結(jié)締組織疏松水腫(圖3C);12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見少量細(xì)胞核淡染,視細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目明顯減少,局部視細(xì)胞消失,RPE層細(xì)胞排列稀疏紊亂,可見脈絡(luò)膜結(jié)締組織疏松、水腫,節(jié)細(xì)胞及雙極細(xì)胞層未見明顯病理改變(圖3D)。

圖3 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化 A:對照組大鼠視細(xì)胞層排列緊密,細(xì)胞排列整齊,視網(wǎng)膜RPE層連續(xù),脈絡(luò)膜為富含血管的疏松結(jié)締組織;B:3h實驗組大鼠視網(wǎng)膜視細(xì)胞層細(xì)胞排列稍紊亂,核間隙增大(綠箭頭);C:6h實驗組大鼠視網(wǎng)膜視細(xì)胞排列明顯紊亂,細(xì)胞間隙增大,可見細(xì)胞核固縮、核碎裂,感光細(xì)胞層內(nèi)外段排列稀疏(黃箭頭),部分RPE層萎縮變薄(紅箭頭),脈絡(luò)膜結(jié)締組織疏松水腫(藍(lán)箭頭);D:12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)明顯紊亂,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層部分細(xì)胞核淡染(黑箭頭),視細(xì)胞數(shù)量明顯減少,局部視細(xì)胞消失(綠箭頭),局部RPE層萎縮變薄,脈絡(luò)膜纖維結(jié)締組織疏松水腫(藍(lán)箭頭)。

每組隨機(jī)選取10張帶有視盤組織的視網(wǎng)膜組織切片,利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量距離視盤邊緣約2mm處視網(wǎng)膜視細(xì)胞數(shù)目,以50μm為1個單位長度,計算單位長度內(nèi)視細(xì)胞數(shù)目,結(jié)果顯示對照組、3h實驗組、6h實驗組、12h實驗組視網(wǎng)膜單位長度內(nèi)視細(xì)胞數(shù)目分別為189.30±17.67、107.20±13.83、84.90±8.48、50.40±11.91個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=194.49,P<0.05),且各組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

藍(lán)光導(dǎo)致的視網(wǎng)膜光損傷是目前研究的熱點。既往研究發(fā)現(xiàn),長期低強度藍(lán)光(<100lx)照射可引起慢性視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)損傷,損傷程度隨累積的光照時間延長而加重[13];急性光損傷可導(dǎo)致不可逆的視功能急劇下降伴視網(wǎng)膜局灶性損傷,這種損傷在光照停止后隨著時間推移繼續(xù)發(fā)展,可持續(xù)數(shù)周之久,但與損傷相關(guān)的致病因子則逐漸減少[14-15]。以往研究多主要集中于分子機(jī)制及組織細(xì)胞學(xué)改變[16-19],但對于較為直觀的影像、功能及活體形態(tài)學(xué)的檢查研究少有報道。

本實驗除了通過石蠟病理組織切片HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)改變,還比較了單位長度視網(wǎng)膜視細(xì)胞數(shù),發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠視網(wǎng)膜RPE層萎縮變薄,視細(xì)胞數(shù)目減少、排列紊亂,出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核碎裂,12h實驗組內(nèi)核層也出現(xiàn)局部細(xì)胞核淡染和較少數(shù)細(xì)胞核固縮、核碎裂,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層部分細(xì)胞核淡染。既往研究多集中于對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層及RPE層的損傷和分子機(jī)制的研究[20-25],近年來針對藍(lán)光照射導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的研究越來越受關(guān)注,多項研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不可逆的損傷[26-27]。Ziókowska等[26]研究發(fā)現(xiàn)強藍(lán)光誘導(dǎo)有色素大鼠內(nèi)在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(intrinsically photoreceptive retinal ganglion cells,ipRGCs)中視黑素的免疫反應(yīng)性降低,ipRGCs數(shù)量顯著減少,神經(jīng)纖維層軸突和內(nèi)叢狀層樹突損傷,正常神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦出現(xiàn)輕微損傷。Guo等[27]研究也發(fā)現(xiàn)藍(lán)光照射后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞活力下降,出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡和壞死。本研究發(fā)現(xiàn),強藍(lán)光可誘導(dǎo)RPE層、光感受器細(xì)胞層、外核層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、壞死的病理學(xué)表現(xiàn),但病變輕重程度不同,與上述研究結(jié)果一致。此外,本研究通過比較各組視網(wǎng)膜視細(xì)胞數(shù)目更直觀地體現(xiàn)了藍(lán)光照射對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞造成的損傷,且視細(xì)胞數(shù)目呈時間依賴性減少。Nakamura等[24]研究證實在高照度藍(lán)光致視網(wǎng)膜損傷中,RPE層病理變化早于外核層,本研究中12h實驗組與3、6h實驗組相比,RPE層萎縮明顯,相對應(yīng)的視細(xì)胞層也出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變,視細(xì)胞數(shù)目減少甚至消失,也體現(xiàn)了RPE層損傷對視細(xì)胞凋亡的影響。

既往關(guān)于光損傷致視網(wǎng)膜厚度變化的研究多集中于對視網(wǎng)膜病理切片的測量,本研究采用OCT測量大鼠視網(wǎng)膜厚度及分層測量視網(wǎng)膜厚度,相對于離體的病理組織切片,對不同方位視網(wǎng)膜厚度的變化進(jìn)行了活體實時觀察,其準(zhǔn)確性更高,觀察更細(xì)致。本研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)光照射至第8wk,對照組與3h實驗組大鼠上方視網(wǎng)膜厚度比較無差異,但各組大鼠下方、鼻側(cè)、顳側(cè)視網(wǎng)膜厚度比較均具有顯著差異,故推測光照對不同方位視網(wǎng)膜厚度的影響不一致,但需要更多的數(shù)據(jù)支持。本研究還發(fā)現(xiàn),各實驗組大鼠ILM-INL層厚度變化不明顯,即ILM-INL層厚度受光照時間影響較小,而各實驗組大鼠OPL-OS層厚度組間兩兩比較均有顯著差異,表明光照對視網(wǎng)膜損傷主要集中于OPL-OS層,此結(jié)果與視網(wǎng)膜病理組織切片觀察的視細(xì)胞數(shù)目減少結(jié)果一致。此外,本研究發(fā)現(xiàn),與3、6h實驗組相比,12h實驗組大鼠RPE層厚度明顯變薄,相對應(yīng)的外核層和光感受器內(nèi)外段也出現(xiàn)更明顯的病理學(xué)改變,提示視網(wǎng)膜損傷程度呈時間依賴性加重。

本研究中,FFA檢查結(jié)果示,6、12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)熒光滲漏和透見熒光,結(jié)合OCT和HE染色結(jié)果,3h實驗組大鼠在強藍(lán)光照射第8wk時視網(wǎng)膜組織已出現(xiàn)病理學(xué)改變,且厚度變薄,但FFA檢查結(jié)果無明顯異常,提示3h實驗組視網(wǎng)膜發(fā)生了組織形態(tài)學(xué)改變,而血管通透性未改變,隨著藍(lán)光照射時間的延長,6、12h實驗組大鼠視網(wǎng)膜及小血管功能逐漸受損。

綜上所述,強藍(lán)光照射可導(dǎo)致視網(wǎng)膜視細(xì)胞萎縮、凋亡及RPE層萎縮,視網(wǎng)膜厚度變薄,血管屏障功能破壞,其變化程度受光照時間影響。本研究不足之處在于未對光照導(dǎo)致的視網(wǎng)膜變薄進(jìn)行動態(tài)的測量研究,下一步研究將會擴(kuò)大樣本量,研究早期視網(wǎng)膜變薄的具體過程,并對光照后損傷的視網(wǎng)膜修復(fù)過程進(jìn)行研究。