陳子杰,毛禹凱,樊 寧,洪燕芬,劉旭陽

0 引言

Wolfram綜合征(Wolfram syndrome,WS)是一種少見的常染色體隱性遺傳性疾病,主要特征是青少年糖尿病(diabetes mellitus,DM)、視神經(jīng)萎縮(optic atrophy,OA)、耳聾(sensorineural hearing loss, D)、尿崩癥(diabetes insipidus, DI),所以又稱為DIDMOAD綜合征。有研究者分析了412例Wolfram綜合征患者的臨床及遺傳學(xué)研究資料,發(fā)現(xiàn)98.2%的患者患有糖尿病,82.1%的患者患有視神經(jīng)萎縮,而出現(xiàn)耳聾或尿崩癥的僅有40%[1]。該病發(fā)病率在不同的種族群體間為1/770000～1/54478[2],前期研究表明與Wolfram綜合征有關(guān)的兩個致病基因,即位于4p16.1上的WFS1基因和位于4q22-4q24上的CISD2基因。前者編碼wolframin跨膜蛋白,后者則編碼Miner1蛋白[3]。由于Wolfram綜合征起病隱匿,基因型和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)尚不完全明確,故當前并無針對性的療法。該病的診斷目前主要依靠臨床表現(xiàn),且利用基因測序可早期識別該綜合征,并及時干預(yù),改善預(yù)后,對后代的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷也有重要意義。本研究通過全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)的方法,討論1個常染色體隱性遺傳WS家系WFS1基因的復(fù)合雜合變異,并進行臨床表型及分子遺傳學(xué)分析。

1 對象和方法

1.1對象于2022-12在廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心收集一個2代3例中國家庭成員的Wolfram綜合征家系信息。本研究遵循《赫爾辛基宣言》且通過倫理與道德委員會批準,所有檢測方法均征得患者及家屬知情同意并簽署同意書。

1.2方法對所有患者進行詳細的病史詢問和眼部檢查,包括視力、眼壓、眼底檢查、視野、視覺誘發(fā)電位(VEP)等檢查明確臨床診斷。告知先證者及家屬基因測序。采取先證者及其母親5mL全血,采取其兄的口腔黏膜。從樣本中獲得基因組DNA,對先證者進行全外顯子組檢測。利用探針雜交捕獲目標基因外顯子及毗鄰剪接區(qū)域,使用高通量測序儀檢測。去除不符合條件的內(nèi)容,比對UCSC提供的hg38版本人類基因體參考序列。通過HaplotypeCaller尋找其中的突變位點。使用xhmm和clamms算法對探針覆蓋區(qū)進行高拷貝數(shù)突變解析。用Polyphen-2,VarSite在線網(wǎng)站分析基因變異引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能變化。根據(jù)常染色體隱性遺傳或復(fù)合雜合遺傳模式,篩選家系的外基因組測序數(shù)據(jù)。過濾后得到同一基因的純合變異體和兩個或兩個以上雜合變異體。依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)遺傳變異分類標準與指南來解釋序列變異部分,獲得該家系的候選基因和變異體的信息[4]。

2 結(jié)果

2.1先證者及其哥哥的臨床檢查結(jié)果先證者,男性,31歲。因“雙眼視力下降5a”就醫(yī)。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)右眼裸眼視力0.03,矯正視力-5.25DS/-1.00DC×180=0.1;左眼裸眼視力0.04,矯正視力-5.25DS/-1.50DC×180=0.3。右眼瞳孔對光反應(yīng)略遲鈍。雙眼視盤色白,右眼杯盤比0.9,左眼杯盤比0.8。余雙眼檢查無明顯異常。VEP檢查提示右眼P100潛伏期重度延遲,P100波幅中度降低;左眼P100潛伏期中度延遲,P100波幅中度降低,見圖1。既往史:7歲時發(fā)現(xiàn)有色弱。25歲配鏡后視力無法矯正到正常水平。30歲于體檢時發(fā)現(xiàn)血糖10mmol/L,隨后診斷為糖尿病,服用雙胍類藥物可控制血糖。聽力無異常。

先證者哥哥,39歲。右眼裸眼視力1.0,矯正視力-0.75DC×5=1.0;左眼裸眼視力1.0,矯正視力1.0。右眼杯盤比0.6,左眼杯盤比0.5。VEP檢查提示右眼P100波幅重度降低;左眼P100波幅中度降低。視野檢查發(fā)現(xiàn)右眼平均缺損-4.11dB,左眼平均缺損-4.55dB。余雙眼檢查無明顯異常,見圖1 。既往史:19歲時感到夜尿多并一直持續(xù)到現(xiàn)在。29歲時因“多飲、多尿、體質(zhì)量減輕”就醫(yī),診斷為糖尿病,通過服用雙胍類藥物和注射長效胰島素控制血糖。無聽力損傷。

家族史:父親已去世。母親無糖尿病、色弱、視力減退。否認近親婚配。

2.2先證者及其哥哥的基因檢測結(jié)果兄弟二人的WFS1基因8號外顯子上均發(fā)現(xiàn)兩種雜合變異:c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)。前者gnomAD東亞人群數(shù)據(jù)庫收錄為0,未有文獻報道,為新發(fā)現(xiàn)的無義變異;后者已有作者發(fā)現(xiàn)并報道過WS相關(guān)錯義變異[5]。Sanger測序發(fā)現(xiàn)先證者母親只檢測到c.2309T>G(p.F770C)變異,另一個位點為野生型,見圖2。

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南,這兩個變異位點均被認為是“意義不明確的”,支持致病性證據(jù)包括:(1)PM2: ESP 數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC 數(shù)據(jù)庫中正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異;(2)PP1: 突變與疾病在家系中共分離;(3)PP3: 多種統(tǒng)計方法預(yù)測出該變異會對基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響。

生物信息學(xué)分析:預(yù)測軟件Mutation Taster預(yù)測這兩個變異位點均是致病的。Polyphen-2將p.F770C變異列為“可能具有破壞性”,評分1.0。第314位的色氨酸殘基保守(不同生物體蛋白序列中保守值=0.8,表明它對蛋白質(zhì)的功能有重要意義);相比之下第770位的苯丙氨酸殘基相對保守(不同生物體蛋白序列中保守值=0.7,其改變可能不會引起蛋白質(zhì)功能明顯改變,圖3)。

3 討論

Wolfram綜合征臨床表現(xiàn)錯綜復(fù)雜,主要包括以下幾種:(1)初發(fā)癥狀多為學(xué)齡前期或?qū)W齡期發(fā)生的糖尿病;(2)隨后為學(xué)齡期左右出現(xiàn)的視神經(jīng)萎縮,部分患者可伴色覺障礙;(3)高頻段受累嚴重的感音性耳聾;(4)中樞性尿崩癥。其他少見的癥狀有:胃腸道不適、部分腺體功能減退如性腺、甲狀腺、智力或發(fā)育遲緩、先天性心臟病等[6]。但并不是所有Wolfram綜合征患者都會出現(xiàn)這4個典型表型,或者是表型出現(xiàn)的先后順序不是固定不變的。比如在一項對8個純合子的研究報告中,患者診斷為糖尿病的平均年齡為18歲,而且僅有1例患者出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮,或者有報道部分患者在三十歲左右才被診斷為糖尿病和視神經(jīng)萎縮[7-8]。

本例先證者以色弱、視力下降為首發(fā)癥狀。早期僅診斷為屈光不正,當配鏡無法提高視力時前來就診,經(jīng)檢查診斷為視神經(jīng)病變。其糖尿病由正常體檢時發(fā)現(xiàn),此前無糖尿病相關(guān)癥狀,服用雙胍類藥物控制穩(wěn)定。其兄以夜尿增多、尿崩癥為首發(fā)癥狀。隨后發(fā)現(xiàn)有糖尿病,使用長效胰島素聯(lián)合雙胍類藥物血糖控制好。多尿表現(xiàn)一直持續(xù)到現(xiàn)在。盡管視力正常,但視覺誘發(fā)電位及視野檢查顯示仍存在視神經(jīng)病變。

兄弟二人無感染性疾病史,無視力急性下降病史,視野無中心暗點,眼底視乳頭無充血水腫、無毛細血管擴張,可排除視神經(jīng)炎。眼底檢查記錄未發(fā)現(xiàn)新生血管,未見視網(wǎng)膜微動脈瘤及出血滲出,可排除糖尿病導(dǎo)致的眼底及視神經(jīng)的病變?；驒z測發(fā)現(xiàn)二人的WFS1基因突變,未發(fā)現(xiàn)OPA1基因和線粒體突變,也可排除Leber遺傳性視神經(jīng)病變。因此,根據(jù)二人的基因檢測結(jié)果,相關(guān)臨床表型,并排除了可能會出現(xiàn)的其他疾病后,均可以確定為Wolfram綜合征。

根據(jù)文獻報道,一些Wolfram綜合征的青少年患者僅表現(xiàn)為糖尿病,并且通常被誤診為1型或2型糖尿病,患者使用一些糖尿病藥物,如胰高血糖素樣肽1受體激動劑(GLP-1RAs)和雙胍類藥物,可以緩解胰島細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,延緩糖尿病進展[9-10]。這與本文中的2例患者相似。本文2例患者均是在20歲之后被診斷為糖尿病,因此我們認為WFS1基因突變導(dǎo)致的糖尿病與傳統(tǒng)的1型糖尿病相比存在一些差異。WS相關(guān)性糖尿病不是由胰島β細胞功能缺陷引起的,而是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的β細胞破壞,突變的wolframin激活胰島β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),導(dǎo)致細胞周期進展受損和細胞凋亡[11]?；颊咄ǔＷ陨砜贵w陽性率低,其起病隱匿、臨床表現(xiàn)輕、進展慢、不易發(fā)生酮癥酸中毒、急性和慢性并發(fā)癥少,且使用胰島素聯(lián)合口服降糖藥物后控制好,因此WS相關(guān)性糖尿病的表型有時是非典型的,可能會被誤診斷為2型糖尿病。所以在出現(xiàn)自身免疫性糖尿病抗體陰性合并其他相關(guān)臨床癥狀時可以進行遺傳學(xué)分析[12]。本文患者的糖尿病表現(xiàn)也和其基因型有關(guān)。在另一項包括82例診斷為1型糖尿病患者的研究中,有4例(4.9%)攜帶WFS1純合或復(fù)合雜合變異,這4例患者除了糖尿病外,沒有出現(xiàn)其他Wolfram綜合征表型;且他們使用雙胍類藥物可以良好的控制血糖,這與本文患者相同[10]。

本文的2例患者目前并沒有出現(xiàn)聽力障礙,這與基因型有關(guān)。一項包含68例Wolfram綜合征患者的研究顯示只有80.89%的患者會出現(xiàn)聽力障礙,其中有77%的患者出現(xiàn)重度聽力損失,他們是由于WFS1基因第8外顯子或第4外顯子的純合突變導(dǎo)致的;相反,那些聽力正?；蚴艿捷p微影響的人有90%是雜合突變,因此Esteban-Bueno等[13]認為純合基因突變的患者更有可能出現(xiàn)聽力損害或聽力缺失更嚴重。

Wolfram綜合征是由WFS1或CISD2基因變異引起的。前者突變導(dǎo)致Wolfram綜合征1型;后者則導(dǎo)致2型[3],且1型更為多見。WFS1基因位于4p16.1上,由8個外顯子組成,編碼wolframin蛋白。wolframin蛋白是一種嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì),在胰腺β細胞、心、肺、腦組織中廣泛表達,由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮重要作用,WFS1中的致病變異導(dǎo)致錯誤折疊蛋白的積累,最終導(dǎo)致細胞凋亡[7]。目前已報道的致病性變異大部分位于WFS1的第8外顯子,因為該外顯子編碼wolframin蛋白的跨膜和c端結(jié)構(gòu)域,這是該蛋白重要的功能結(jié)構(gòu)[14]。CISD2定位于4q24,由3個編碼NAF-1蛋白的外顯子組成,編碼Miner1蛋白。

當前遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)WFS1中有200多種致病變異,且在WFS1基因中呈不均勻分布。有學(xué)者認為疾病出現(xiàn)的時間、程度、發(fā)展變化可能與基因變異的位置及種類存在關(guān)系。比如錯義變異,是由于堿基替換使原氨基酸變?yōu)榱硪环N,導(dǎo)致wolframin蛋白輕微降解,引起的臨床表型較輕;或無義變異,是由于終止密碼子的提前出現(xiàn)而合成不完整的肽鏈以及移碼突變,由于某位點的堿基插入或缺失使下游一串密碼子改變從而合成另一種肽鏈。兩者均可導(dǎo)致wolframin蛋白的完全耗竭,所引起的臨床表現(xiàn)可能較重[15]。日本學(xué)者對 Wolfram 綜合征患者 WFS1 突變的基因型-表型相關(guān)性的研究表明,WFS1 突變可以根據(jù)臨床表型嚴重程度分為兩組,其中無義突變、移碼突變和/或兩個等位基因中多個氨基酸插入/缺失的變異比錯義突變和/或兩個等位基因中單個氨基酸插入的變異更嚴重[16]。

本文兄弟二人的WFS1基因上均檢測到第8號外顯子存在c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)雜合變異,通過家系驗證符合常染色體隱性遺傳模式。其中c.2309T>G(p.F770C)是已發(fā)表的Wolfram綜合征基因變異,為錯義變異。該變異使得原苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?導(dǎo)致原蛋白質(zhì)的編碼錯誤而使功能缺失。該位點在一個Wolfram綜合征家系中以復(fù)合雜合的形式被查出,文獻中的患者是存在c.1522_1523delTA(p.Tyr508Cysfs*34)和 c.2309T>G(p.F770C)的復(fù)合雜合突變,且c.2309T>G (p.F770C)也是來自于母親,該患者與本文中的兩位患者在視力、眼底、視覺誘發(fā)電位的表現(xiàn)均相似,比如矯正視力差、VEP波形延遲、輕微視野缺損等,且都沒有聽力損害[5]。本文中的另一個變異c.941G>A(p.W314X)為新發(fā)現(xiàn)的一個變異,該變異為一種無義變異,使原色氨酸密碼子變成了終止密碼子,導(dǎo)致多肽鏈的合成到此停止,產(chǎn)生了一條不完整的肽鏈,改變蛋白質(zhì)的功能。查閱有關(guān)文獻并未報道過這種變異。但有文獻中描述過1例由c.940T>C(p.Trp314Arg)雜合突變導(dǎo)致的Wolfram綜合征。該突變與本文的第二個突變位點相似,改變的都是第314位的色氨酸。但不同的是,本文患者的突變是由色氨酸密碼子變成了終止密碼子,翻譯終止,而文獻中是由色氨酸突變?yōu)榫彼?下游的密碼子還可以繼續(xù)翻譯。該研究者認為p.Trp314Arg這個改變似乎降低了WFS1抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的能力,這可能會隨著時間的推移損害β細胞的功能,導(dǎo)致相對胰島素不足和糖尿病的發(fā)生[9]。先證者母親只檢測到c.2309T>G(p.F770C)雜合變異,另一個位點為野生型。由此可知,兄弟二人的c.2309T>G(p.F770C)雜合變異由其母親傳下來,而c.941G>A(p.W314X)雜合突變可能是由其父親傳下來。該家系中先證者及其哥哥被診斷為Wolfram綜合征,先證者母親為c.2309T>G(p.F770C)雜合攜帶者,臨床表型與基因型共分離。

綜上所述,本研究在一個常染色體隱性遺傳WS家系中檢測出WFS1基因的c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)雜合變異。前者尚未報道,豐富了WFS1基因變異譜。Wolfram綜合征臨床表現(xiàn)復(fù)雜,診斷較為困難。因此,對于一些無法查明原因的視神經(jīng)萎縮合并有糖尿病、聽力障礙、尿崩癥等相關(guān)癥狀之一的患者,均應(yīng)該考慮是否為Wolfram綜合征,可做基因檢測來進一步明確診斷。Wolfram綜合征的基因變異對臨床表現(xiàn)的影響較為復(fù)雜,需要長期的探索研究來找尋它們之間的關(guān)系,為能夠早期的診斷以及治療奠定基礎(chǔ)。