劉志強,李亞坤,白 玫,郭向東,梁春利

0 引言

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是一種嚴重的視網膜血管疾病,涉及血管生成和黃斑水腫等并發(fā)癥,可導致視力減弱甚至失明[1]。玻璃體腔注射抗VEGF藥物、皮質類固醇和激光療法已被用于治療繼發(fā)于視網膜中央RVO和分支RVO的黃斑水腫[2-3],但治療效果和應用具有局限性[4],仍有15%～40%患者視力無反應或僅部分反應[5],因此積極探索治療效果顯著且副作用小的其他藥物具有重要意義。丹酚酸B是傳統(tǒng)中藥丹參的主要有效水溶性成分,具有抑制血管新生的作用[6],但關于其是否可通過影響血管生成發(fā)揮對RVO損傷的改善作用尚未見報道,故本研究擬構建RVO大鼠模型,并經丹酚酸B治療,探討丹酚酸B對RVO大鼠視網膜組織病理、功能和血管生成相關因子的表達影響,以期為RVO抗VEGF藥物選擇提供一定參考資料。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠35只,6～8周齡,體質量為200±20g,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[SCXK(魯)2019-0003]。經裂隙燈檢查,所有大鼠均排除眼部疾患。在室溫(23±3)℃,濕度40%～65%環(huán)境下普通飼養(yǎng),12h光-暗交替,給予充足水和普通飼料,適應性飼養(yǎng)1wk。本研究經河北北方學院實驗動物倫理學委員會審批。

1.1.2藥品和主要試劑及儀器丹酚酸B(純度≥98%)(YRD029)購自成都儀睿生物科技有限公司;孟加拉玫瑰紅(純度≥95%)(632-69-9)購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1 α,HIF1α)(ab216842)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)(ab68153)、p-STAT3(ab267373)、VEGF(ab46154)抗體購自美國Abcam公司;YZ5T型裂隙燈顯微鏡購自蘇州六六視覺科技股份有限公司;GYC1000眼底激光儀購自英國Optoprobe公司;Invitrogen iBright凝膠成像系統(tǒng)購自賽默飛世爾生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1造模和分組及給藥隨機選取10只SD大鼠作為對照組,剩余25只均利用孟加拉玫瑰紅聯合激光光動力法誘導RVO大鼠模型[7-8]：腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠,0.4%鹽酸奧布卡因和1%丁卡因進行局部麻醉,復方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分擴瞳(為防止角膜表面干燥和視網膜視野受損,在實驗過程中定期使用氯化鈉9mg/mL滴眼),后經尾靜脈注射0.25mL孟加拉玫瑰紅(50mg/kg),3～5min后,大鼠左眼角膜上放置滴加氧氟沙星眼膏的蓋玻片,采用波長532nm的眼底激光儀沿著視網膜分支靜脈進行激光照射以縮小血管,照射點距離視神經乳頭1.5～3.0視盤直徑(papilla disc,PD),功率60mW,光斑60μm,時間0.4s,見激光處靜脈變細約1PD后,調整功率為80mW,光斑100μm,時間0.5s至視網膜靜脈血流中斷,遠端靜脈擴張,即造模成功。對照組僅尾靜脈注射生理鹽水,不施以激光誘導。成模大鼠21只,隨機剔除1只,剩余大鼠隨機分為模型組和丹酚酸B組,每組各10只,避光12h后次日給藥。其中丹酚酸B組大鼠腹腔注射丹酚酸B 50mg/(kg·d),對照組及模型組大鼠僅注射等量生理鹽水,連續(xù)21d。

1.2.2熒光素眼底血管造影技術觀察視網膜靜脈結構給藥前和給藥21d后腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠,復方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分擴瞳,腹腔注射10%熒光素鈉0.3mL,結膜顏色呈黃色變化后,利用F-10共焦激光掃描檢眼鏡進行熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查,觀察眼底情況并拍照。

1.2.3視網膜電圖評估視網膜功能給藥21d后,各組大鼠暗適應12h,麻醉及散瞳操作方法同前,視網膜電圖(electroretinogram,ERG)[9]中,記錄電極為氯化銀電極,固定在角膜中央,不銹鋼電極針分別作為參考電極和接地電極分別放在頰部和尾根部,暗光ERG使用RET Iport系統(tǒng)進行,LED閃光強度為-0dB(3.00cds/m2),刺激頻率為0.15Hz,繪圖時間為150ms,記錄a波和b波振幅(μV)。其中光刺激下,開始的一個負波為a波,后出現一個正波為b波;a波振幅指從基線到b波波谷谷底部的垂直距離;b波振幅指a波波谷到b波波峰的垂直距離。

1.2.4HE染色觀察視網膜組織學變化給藥21d后,腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠并施行安樂死,迅速摘除各組大鼠左眼球,鏡下使用手術顯微剪去除角膜和晶狀體,取5只置于4℃含4%多聚甲醛的固定液中固定48h以上。根據靜脈阻塞部位常規(guī)制備石蠟切片,蘇木精染色5min,0.5%鹽酸乙醇分化10s,伊紅液復染30s,水洗后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,晾干后中性樹膠封片,鏡下觀察并利用Image pro plus軟件測量視網膜總層(RTL)、內核層(inner nuclear layer,INL)和外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度。

1.2.5VEGFA免疫熒光染色評估血管生成石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水,于3% H2O2中孵育10min以阻斷內源性過氧化物酶活性,磷酸鹽緩沖鹽水漂洗3次,1%牛血清白蛋白孵育1h以阻斷非特異性抗體,后將切片與VEGFA抗體(1∶200稀釋)在4℃下孵育過夜,磷酸鹽緩沖鹽水洗滌3次,與Cy3標記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(1∶200稀釋)室溫下孵育1h,漂洗3次后,DAPI染核5min,熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。以相對于對照組的VEGFA熒光強度(%)評估血管生成情況。

1.2.6Westernblot檢測視網膜組織中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表達給藥21d后,取各組5只大鼠視網膜組織(液氮中保存?zhèn)溆?,預冷RIPA裂解液勻漿裂解,4℃下高速離心后取上清,BCA法測定蛋白濃度,調整蛋白為統(tǒng)一濃度,加熱變性蛋白。SDS-PAGE分離等量蛋白并濕轉至PVDF膜上,5%脫脂牛奶37℃封閉2h,一抗4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育2h,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光并成像。Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1丹酚酸B對RVO大鼠視網膜靜脈的影響FFA顯示,治療前對照組大鼠視網膜熒光在血管內均分布均勻;而模型組大鼠視網膜光凝部位可見明顯靜脈阻塞,遠端視網膜靜脈擴張、迂曲并伴有出血,毛細血管灌注破壞,21d后部分血管熒光不完整,有效側支循環(huán)豐富,但形狀不規(guī)則,見有熒光滲漏;丹酚酸B組大鼠治療前視網膜病變同模型組,而經過丹酚酸B治療21d后視網膜靜脈循環(huán)恢復,形狀逐漸規(guī)則,血管側支減少,見圖1。

圖1 給藥前后大鼠視網膜靜脈結構觀察。

2.2丹酚酸B對RVO大鼠a波和b波振幅的影響與對照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠ERG a波和b波振幅降低(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B大鼠ERG a波和b波振幅升高(均P<0.05),見圖2,表1。

表1 各組大鼠a波和b波振幅比較

圖2 各組大鼠ERG圖像。

2.3丹酚酸B對RVO大鼠視網膜組織病理變化的影響HE染色結果顯示,對照組大鼠視網膜組織結構完整、各層排列整齊、界限清晰,視網膜神經節(jié)細胞呈單層排列,未見明顯病理學損傷;模型組大鼠可見明顯視網膜神經節(jié)細胞減少,分層排列紊亂,部分細胞壞死溶解,存在空泡化,INL和ONL明顯變薄;丹酚酸B組大鼠視網膜組織病理損傷相對于模型組有所改善。與對照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠RTL、INL和ONL厚度均降低(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠RTL、INL和ONL厚度均升高(均P<0.05),見圖3,表2。

表2 各組大鼠視網膜RTL、INL和ONL厚度比較

2.4丹酚酸B對RVO大鼠視網膜血管新生的影響三組大鼠視網膜組織中VEGFA熒光強度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=190.806,P<0.001)。與對照組(100±0)%比較,模型組(305.57±24.62)%和丹酚酸B組(172.93±15.74)%大鼠視網膜組織中VEGFA熒光強度增強(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠視網膜組織中VEGFA熒光強度減弱(P<0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠視網膜組織中VEGFA熒光染色圖。

2.5丹酚酸B對RVO大鼠視網膜HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表達的影響組間STAT3蛋白相對表達量無顯著性變化(P>0.05);與對照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠視網膜組織中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相對表達量升高(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠視網膜組織中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相對表達量降低(均P<0.05),見圖5,表3。

表3 各組大鼠視網膜組織中被檢蛋白相對表達量比較

圖5 各組大鼠視網膜組織中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白條帶 A:對照組;B:模型組;C:丹酚酸B組。

3 討論

視網膜需要大量氧氣來維持其生理功能,RVO通常會引起血流量減少和毛細血管脫落,導致視網膜缺氧進而誘發(fā)VEGF表達上調,而VEGF可增加血管通透性并導致血-視網膜屏障破壞,在黃斑水腫和視網膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用[10]。因此,靶向VEGF的藥物被認為是一種有前途的治療方法。目前,抗VEGF主要通過直接干預降低VEGFA表達,臨床研究證實有效,然而,抗VEGF藥物仍然不可避免地表現出一些潛在缺點[11],因此促進血流恢復同時降低VEGF表達,減弱血管通透性、抑制血管過度新生可作為RVO藥物治療策略的靶點。

丹酚酸B為丹參水溶性成分丹酚酸的有效單體之一,體外實驗已證實有較強的抗氧化、抗血栓生成及心腦血管保護作用[12-13]。RVO模型旨在成功實現視網膜靜脈閉塞,導致缺氧缺血性損傷、血視網膜屏障破裂、神經元死亡和視網膜水腫,本研究模型組大鼠視網膜光凝部位可見明顯靜脈阻塞,遠端視網膜靜脈擴張、迂曲并伴有出血,毛細血管灌注破壞,經過21d后可見部分血管熒光不完整,有效側支循環(huán)豐富,但形狀不規(guī)則,見有熒光滲漏。相關臨床研究同樣表明視網膜分支靜脈阻塞患者脈絡膜血管指數升高,而抗VEGF治療可減小脈絡膜血管指數[14]。分析本研究中模型組大鼠視網膜病變可能是由于光凝造成血流阻斷,血管壓力升高,使得血管破裂,阻塞位置出現熒光滲漏,而阻塞部位遠端血液充盈不足,使得大量毛細血管新生。此外,激光光凝對視網膜光凝區(qū)產生熱效應、光化學效應和器質性損傷,對細胞內蛋白質結構造成一定程度的破壞,從而使毛細血管的管壁通透性升高,血管內容物滲出,導致視網膜缺血缺氧,誘導大量毛細血管新生,建立起豐富的毛細血管側支網絡[15-16]。丹酚酸B組大鼠治療前視網膜病變同模型組,而經過21d丹酚酸B治療后視網膜靜脈循環(huán)恢復,形狀逐漸規(guī)則,血管側支減少,可能是由于丹酚酸B具有一定的溶栓作用,通過促進眼底視網膜阻塞血管再通減輕血管阻塞引起的病變[17-18]。

ERG是視網膜對光刺激的電反應,其組成部分a波、b波和振蕩電位的振幅和時間模式取決于視網膜的功能完整性、到達視網膜的測試閃光強度和環(huán)境照明,其中a波測量視網膜感光器響應,b波是較為敏感的視網膜缺血指標,可反映視網膜INL細胞的電活動,均可用于評估視網膜功能[19]。研究發(fā)現,a波、b波振幅降低提示視網膜功能障礙[20]。ONL由感光視錐細胞和視桿細胞組成,INL有助于光信號轉導,ONL感光細胞丟失可用于評估視網膜功能和視網膜敏感性[21]。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠ERG a波和b波振幅均下降,同時INL和ONL厚度均降低,提示視網膜功能障礙;經丹酚酸B治療后,模型大鼠ERG a波和b波振幅均升高,結合大鼠視網膜組織學變化結果,提示丹酚酸B可能通過促進血流恢復,減輕大鼠視網膜缺血缺氧性病理損傷進而改善視網膜功能。

HIF-1α是對氧變化最敏感的轉錄因子,在缺氧誘導的視網膜色素上皮細胞血管生成中起重要作用。當機體缺氧時,HIF-1α與HIF-1β結合形成化合物,可激活下游靶基因,調節(jié)一系列血管活性因子和細胞因子的基因表達和蛋白質合成[22]。據報道,HIF-1α可通過激活STAT3分子促進病理性新生血管形成,STAT3分子進一步調節(jié)其下游基因,包括VEGF[23]。而VEGF過表達是視網膜新生血管形成和血管滲漏的主要原因,可加重視網膜病理損傷及視覺障礙[24]。Yu等[25]基于化學計量學方法和譜效關系研究補腎活血方治療糖尿病視網膜病變的Q標志物,發(fā)現丹酚酸B可顯著抑制VEGF和HIF-1α表達。本研究經VEGFA免疫熒光染色和Western blotting法檢測,發(fā)現模型組大鼠視網膜組織中VEGFA、HIF-1α和p-STAT3蛋白相對表達量均升高,而經丹酚酸B作用后,三者蛋白表達均下調,結合上述實驗結果,提示丹酚酸B可能通過促進RVO大鼠靜脈阻塞血流恢復,減輕視網膜組織缺氧性損傷,抑制HIF-1α/STAT3/VEGF信號通路激活,降低VEGFA表達進而減少病理性新生血管形成,改善視網膜功能。本研究結果與許琳等[26]研究報道的叔丁基對苯二酚通過下調HIF-1α和VEGF蛋白表達,可抑制糖尿病視網膜病變大鼠視網膜血管新生具有一致性。

綜上所述,丹酚酸B可減輕RVO大鼠視網膜組織病理學損傷,改善視網膜功能,這可能與抑制HIF-1α/STAT3/VEGFA途徑激活,減少血管新生有關。