席懿璇,葉亞婷,竇國睿,常天芳,牛亞麗1,,周子義,儲昭節(jié)

0 引言

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是20世紀(jì)90年代從紅豆杉中分離提純出的四環(huán)二萜類天然抗腫瘤藥物,具有聚合和穩(wěn)定微管的作用,致使快速分裂的腫瘤細胞在有絲分裂階段被牢牢固定,使癌細胞復(fù)制受阻斷而死亡[1]。PTX對于食道癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病等多種疾病具有一定的療效,但隨著臨床的不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)PTX在腫瘤疾病的治療過程中可導(dǎo)致一系列不良反應(yīng),骨髓抑制、神經(jīng)毒性、消化道反應(yīng)、過敏反應(yīng)和肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛等均為常見不良反應(yīng)[2]。近年來關(guān)于PTX化療導(dǎo)致的黃斑水腫病例偶有報道[3-4],但并未對其具體發(fā)生機制進行闡述。而推測集中于PTX干擾Müller細胞所維持的視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺滲透梯度,對Müller細胞具有潛在毒性[5]。為明確PTX對Müller細胞的影響,本研究將體外培養(yǎng)的Müller細胞作為實驗對象,觀察PTX對Müller細胞增殖、細胞周期、形態(tài)及屏障功能的影響,為闡明PTX導(dǎo)致黃斑水腫的具體機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料鼠Müller原代細胞為自行提取。DMEM 培養(yǎng)基(高糖)購于Gibco公司(美國)。PTX購于MedChemExpress(MCE)公司(美國)。流式細胞儀及配套試劑盒購自Invitrogen(美國)。Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自武漢華美公司(美國)。IL-6(ab259341)、TNF-α(ab307164)、碳酸酐酶十四(CA XIV,ab184180)、MCP-1 (ab308522)、VEGF (ab32152)、鬼筆環(huán)肽(ab176753)抗體購自Abcam公司(英國)。β-actin(81115-1-RR)抗體及其二抗購自武漢三鷹公司。酶標(biāo)儀(ELX800,Bio-Teck,美國)。

1.2方法

1.2.1細胞的提取及分組將新生第6～8d C57BL/6J小鼠腹腔麻醉后,摘取眼球浸泡在10% DMEM中2h左右。在37℃下消化45min(消化液:DMEM 0.5mL,0.25%胰蛋白酶1mL,膠原蛋白酶Ⅰ 1mL)。消化完成后剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜并制成細胞懸液,500g離心5min,用10% DMEM重懸后通過100μm篩,密度按每6～9只眼接種在100mm培養(yǎng)皿中孵育。當(dāng)細胞融合至70%左右,進行后續(xù)傳代培養(yǎng)或后續(xù)實驗。使用免疫熒光鑒定小鼠視網(wǎng)膜中提取的Müller細胞。免疫熒光結(jié)果顯示Müller細胞特異性標(biāo)記物AQP4和GS呈陽性(圖1A)。將Müller細胞分為兩組:對照組(正常培養(yǎng))、PTX藥物處理組,藥物處理濃度依次為0.005、0.05、0.5、5mg/L。

圖1 PTX藥物刺激后對Müller細胞增殖和凋亡的影響 A:Müller細胞鑒定圖;B:各濃度細胞不同時間點增殖圖;C:各濃度細胞不同時間點凋亡圖。

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖情況100μL的Müller細胞以每毫升7×104個接種于96孔板中,將96孔板放置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)至細胞貼壁后,更換培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,按照對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L藥物濃度梯度分別培養(yǎng)12、24、36、48、72h,每個孔中加入CCK-8溶液10μL繼續(xù)孵育3h;酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度(OD)值。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況將對數(shù)生長期的Müller細胞以每毫升7×104個接種于96孔板中,將其放置37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h,按照對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L藥物濃度梯度分別培養(yǎng)12、24、36、48、72h,0.1%胰蛋白酶消化Müller細胞,1000r/min離心5min;加入Annexin V-FITC,室溫下避光孵育20min,加入碘化丙啶(PI)染色液混勻,冰浴避光孵育5min。使用流式細胞儀檢測熒光染色后的細胞,并使用BD FACSuite軟件進行分析,綠色熒光為Annexin V-FITC,紅色熒光為PI。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期細胞培養(yǎng)方法與1.2.3相同,細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,然后按照對照組、0.05mg/L藥物濃度培養(yǎng)24h,0.1%胰蛋白酶消化,加入預(yù)冷70%乙醇并固定24h,固定后加入Trition X-100、RNA酶,37℃水浴30min,PI染色。流式細胞儀檢測以標(biāo)準(zhǔn)程序進行測定,測定結(jié)果計數(shù),對測定結(jié)果進行整理與分析。

1.2.5免疫熒光觀察細胞形態(tài)將Müller細胞以每毫升2×105個的接種密度接種到細胞共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng),細胞培養(yǎng)至70%時更換培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,將對照組、0.05mg/L PTX的培養(yǎng)基以換液方式加入共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h;4% PFA室溫固定20～30min,然后在1%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和0.5% Trition X-100[磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋]的封閉溶液中封閉30min。加入鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)染料(1∶200),并用上述封閉液稀釋, 4℃濕盒中孵育24h。PBS洗滌共聚焦培養(yǎng)皿,用含4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole,DAPI)封片液進行染色密封,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6Westernblot檢測蛋白表達水平分別收集對照組、0.05mg/L PTX處理24h后的細胞至Ep管,加入適量的RIPA細胞裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑(100∶1)進行離心,吸取上清為細胞總蛋白;加入30μg蛋白進行電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白自身分子量決定;轉(zhuǎn)膜后放置在TBST配制的5%脫脂牛奶中,常溫條件下封閉2h;將封閉完成的PVDF膜與IL-6、TNF-α、CA XIV、MCP-1、VEGF抗體(1∶1000)4℃下孵育24h,孵育后用TBST洗膜;孵育完成的PVDF膜與同源二抗(1∶10000)進行共同孵育,常溫條件下共同孵育2h,孵育后用TBST洗膜。在PVDF膜上淋灑適量ECL化學(xué)發(fā)光液,在暗室中進行掃膜與成像。利用Image J Program掃描和測量條帶的相對光密度(內(nèi)參β-actin)。

1.2.7qRT-PCR檢測mRNA表達水平收集對照組、0.05mg/L PTX處理24h后的細胞至Ep管(經(jīng)DEPC處理)中,加入適量的Trizol溶液使其完全裂解;加入1/5總體積的氯仿,充分混合并離心;將上層水相移至新管并加入同體積的異丙醇溶液低溫離心,移除上清液后加入無水乙醇再次低溫離心,倒出上清液,使Ep管干燥并加入DEPC水,而后使用TaKaRa試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系為2μL 5×PrimeScript RT Master Mix、2.5μL Total RNA、5.5μL RNase Free dH2O,37℃下反應(yīng)15min。采用TaKaRa PrimeScritTMRT(Perfect Real Time)試劑盒進行qRT-PCR實驗,采用β-actin為作為內(nèi)參對照,qRT-PCR體系為10μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、0.8μL PCR Reverse Primer(10μmol/L)、0.8μL PCR Forward Primer(10μmol/L)、0.4μL ROX Reference Dye、6μL RNase Free ddH2O和2μL cDNA。反應(yīng)程序為95℃變性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s。

統(tǒng)計學(xué)分析:使用軟件GraphPad Prism v9.1.0.221.進行統(tǒng)計學(xué)結(jié)果分析,所有的數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PTX對細胞增殖的影響CCK8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示,PTX組在處理細胞后不同時間點細胞增殖率較對照組均下降(圖1B)。低濃度(0.005、0.05mg/L)PTX處理細胞12h后細胞增殖未受到抑制,細胞存活率為93.1%,高濃度(5mg/L)PTX刺激細胞72h后細胞存活率為37.9%,說明PTX抑制Müller細胞增殖,且與時間和藥物濃度呈依賴性。

2.2PTX對細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,PTX組在刺激細胞后不同時間點細胞凋亡率較對照組均升高(圖1C)。在PTX組不同處理條件中,對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激細胞12h,細胞凋亡率無明顯差異。不同濃度PTX處理細胞48h時,細胞凋亡率較對照組均升高(圖1C)。PTX組處理細胞72h時,細胞壞死。在PTX不同處理條件中,0.05mg/L PTX處理24h細胞凋亡率最低,因此在后續(xù)實驗中選擇該藥物濃度和作用時間。

2.3PTX對細胞周期的影響流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示,0.05mg/L PTX藥物處理細胞24h后,細胞周期較對照組發(fā)生改變(圖2),PTX藥物將細胞阻滯于G2-M期。

圖2 流式細胞儀檢測細胞周期 A:對照組;B:0.05mg/L PTX組。

2.4PTX對細胞形態(tài)的影響0.05mg/L PTX藥物處理細胞24h后,細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖3)。正常細胞呈現(xiàn)細長纖維狀,細胞形態(tài)比較清晰、成簇或平行排列。而在PTX藥物的刺激下,細胞數(shù)量明顯減少且細胞皺縮趨于圓形。

圖3 免疫熒光觀察細胞形態(tài)。

2.5Westernblot和qRT-PCR檢測相關(guān)因子表達結(jié)果Western blot實驗結(jié)果表明,0.05mg/L PTX處理細胞24h后與對照組相比Bcl-2表達降低;Bax表達較對照組升高(圖4A、B,表1),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),CA XIV較對照組表達升高,VEGF較對照組表達降低(圖4C、D,表1),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組細胞間相關(guān)蛋白表達情況比較

Western blot與qRT-PCR實驗結(jié)果表明,0.05mg/L PTX處理細胞24h后細胞炎癥因子IL-6、TNF-α及趨化因子MCP-1蛋白相對表達較對照組均升高(圖5),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。當(dāng)PTX停止處理24～72h后,Western blot結(jié)果顯示炎癥因子IL-6、TNF-α及細胞趨化因子MCP-1蛋白相對表達較0.05mg/L PTX藥物組均降低(圖6),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(FTNF-α=3.712,FIL-6=9.341,FMCP-1=5.142,均P<0.05)。

圖5 PTX刺激Müller細胞后MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白表達水平與mRNA表達水平示意圖 A:蛋白電泳圖;B:IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表達統(tǒng)計圖;C:IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA相對表達統(tǒng)計圖。

3 討論

紫杉醇是在紫衫中提取出的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)[6],Wani等[7]明確了提取物關(guān)鍵成份的結(jié)構(gòu)組成,紫杉醇具有較強的疏水性,在體內(nèi)釋放后可在釋放位置有效保留[8],紫杉醇也具有抑制平滑肌細胞增殖的作用[9-10]。紫杉醇的這些特性使得其在腫瘤方面的療效顯著,但臨床應(yīng)用時也會引起較多不良反應(yīng),黃斑水腫是不良反應(yīng)之一,可對視力造成威脅,發(fā)病率約在0.5%[11]。

黃斑水腫是指血-視網(wǎng)膜屏障(blood-rentinal barrier,BRB)破壞后液體在黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)積聚[12],機制可能是視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞屏障或色素上皮細胞外屏障的功能缺陷而導(dǎo)致細胞外液外漏,在黃斑區(qū)外叢狀層Henle纖維之間積存而形成黃斑水腫[13]。而Müller細胞作為連接視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)元,維持水與K+穩(wěn)態(tài)的重要分子,當(dāng)Müller細胞出現(xiàn)功能障礙時便會造成液體積聚造成黃斑水腫[14]。PTX導(dǎo)致黃斑水腫的機制并不明確,沒有明確推薦的治療方案。在lvarez-Fernández等[15]研究中90%以上的病例的治療方案是停止使用紫杉醇。也有其他的藥物治療手段如碳酸酐酶抑制劑[16]、貝伐單抗[17]和地塞米松玻璃體植入物[18]等,但治療效果欠佳。

黃斑水腫種類多樣,常見的黃斑水腫如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞繼發(fā)黃斑水腫(retinal vein occlusion-macular edema,RVO-ME),但紫杉烷類藥物即PTX所致黃斑水腫臨床特點與上述常見黃斑水腫不同,具有黃斑囊樣水腫(CME)特征;光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)檢查結(jié)果顯示黃斑中心凹厚度增加,黃斑囊樣改變,但熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查結(jié)果顯示無熒光滲漏或滲漏極小[19-20]。PTX引起黃斑水腫的具體機制并不明確,目前已經(jīng)提出了幾種假說:(1) Kanakis等[21]提出的PTX導(dǎo)致的黃斑水腫的潛在原因可能是發(fā)生在中層和深層神經(jīng)叢水平的水通道蛋白被影響,水通道蛋白在細胞中取決于微管的功能,而微管的功能會因為PTX的作用而改變,最終由于這種水運輸?shù)耐緩奖蛔枞霈F(xiàn)水腫;(2)有學(xué)者認為眼底血管造影中的無滲漏或極少滲漏,可能是由于PTX對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷較輕,導(dǎo)致的黃斑水腫可能是PTX對Müller細胞的毒性作用[5],Müller細胞功能出現(xiàn)障礙造成黃斑部分液體積聚[14]。黃斑水腫的發(fā)生機制到底是PTX影響微管功能從而影響水通道蛋白導(dǎo)致黃斑水腫,還是PTX對于Müller細胞的潛在毒性,亦或是二者均參與仍需進一步研究闡明。

而本實驗結(jié)果表明,PTX可以抑制體外培養(yǎng)的Müller細胞,且與時間和藥物濃度呈依賴性。0.05mg/L PTX處理細胞24h,細胞增殖受到明顯抑制,且促進了細胞凋亡。PTX處理Müller細胞后,細胞周期被阻滯于G2-M期,細胞形態(tài)也由形態(tài)清晰、細長纖維狀的正常形態(tài)趨于圓形,細胞數(shù)量顯著減少。長時間使用藥物PTX刺激Müller細胞后,Müller細胞基本壞死,且短時間高濃度的藥物處理Müller細胞使細胞凋亡加快。不同濃度PTX刺激細胞時的炎癥因子如IL-6、TNF-α、MCP-1的表達升高,但這種高表達可通過停止藥物刺激緩解,提示PTX致使黃斑水腫的具體機制可能與細胞炎癥關(guān)系不顯著。目前我們的研究結(jié)果表明PTX對Müller細胞的潛在毒性導(dǎo)致Müller細胞功能出現(xiàn)障礙、視網(wǎng)膜屏障被破壞,造成黃斑部分液體積聚,引起了此類黃斑水腫的發(fā)生。

綜上,紫杉烷類藥物對視網(wǎng)膜存在潛在毒性,其通過抑制Müller細胞的增殖、促進其凋亡、阻滯細胞周期、改變細胞形態(tài)等造成視網(wǎng)膜屏障破壞,可能參與引發(fā)黃斑水腫,具體機制有待進一步研究。