趙愛蘭 余琴 俞南 張愛潔 夏輝 徐偉

北京市肺結(jié)核發(fā)病率與全國相比處于較低水平,2008—2016年北京市肺結(jié)核發(fā)病率為40.00/10萬～25.47/10萬(全國發(fā)病率為72.95/10萬～52.18/10萬)[1],但要實現(xiàn)無結(jié)核社區(qū)及終結(jié)結(jié)核病的目標仍然需要加強結(jié)核病防治工作。朝陽區(qū)是北京市人口大區(qū),學生、外來人口和流動人口較多,極易造成肺結(jié)核的傳播[2]。北京市基層結(jié)核病檢測機構(gòu)主要應用的實驗室檢測方法仍然是涂片鏡檢和固體培養(yǎng),涂片鏡檢檢測敏感度低,固體培養(yǎng)耗時較長。2011年,世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦將GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)用于結(jié)核病的快速診斷和利福平的耐藥性檢測[3],在終止結(jié)核病策略中明確提出要提高新發(fā)和復發(fā)結(jié)核病患者中快速診斷方法作為初始檢測方法的比例,同時要提高病原學陽性患者中耐藥檢測的可及性。然而,2022年全球結(jié)核病報告顯示,2021年我國登記的結(jié)核病患者中僅有57%的患者將WHO推薦的快速診斷方法作為初始檢測方法。目前,大多數(shù)已發(fā)表的有關(guān)GeneXpert檢測方法的文獻集中在其與涂片鏡檢、固體培養(yǎng)敏感度和特異度方面的比較。本研究側(cè)重于探索在基層結(jié)核病防治機構(gòu)(簡稱“結(jié)防機構(gòu)”)中應用涂片鏡檢和固體培養(yǎng)的基礎上加入GeneXpert后對活動性肺結(jié)核患者中病原學陽性檢出率的影響及早期診斷利福平耐藥性的應用價值。

對象和方法

一、研究對象

按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[4]標準,納入在北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部2018年1月至2022年12月初次就診登記的3060例肺結(jié)核可疑癥狀者,按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]留取3份痰液,分別為即時痰、夜間痰和晨痰,每份要求≥1 ml,痰液的性狀有干酪痰、血痰、黏液痰和唾液痰。3份痰標本均進行抗酸染色涂片鏡檢,分枝桿菌固體培養(yǎng)使用即時痰和夜間痰,2018年1月至2021年12月對晨痰進行GeneXpert檢測,2022年1—12月將每例患者的3份痰標本混合后進行GeneXpert檢測。

二、實驗室檢測方法

1. 抗酸分枝桿菌(簡稱“抗酸桿菌”)涂片鏡檢:按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》中萋-尼抗酸染色方法進行涂片鏡檢,3份標本中任一份發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌即判定為涂片陽性。涂片鏡檢結(jié)果報告為陰性、實際條數(shù)、+、++、+++、++++。

2. 分枝桿菌固體培養(yǎng)及菌種鑒定:按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》固體培養(yǎng)法,對每例可疑癥狀者的即時痰和夜間痰依次進行固體培養(yǎng),將培養(yǎng)陽性菌株進行涂片抗酸染色,鏡檢后的可疑菌株接種對硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid,PNB)/噻吩-2羧酸肼(thiophene-2 carboxylic hydrazine,TCH)進行初步菌種鑒定,PNB生長試驗陰性,TCH生長試驗陽性判斷為結(jié)核分枝桿菌(MTB)。2份標本任一份培養(yǎng)出陽性菌株即判定為培養(yǎng)陽性,結(jié)果報告為陰性、實際菌落數(shù)、+、++、+++、++++,2個月沒有菌落生長判定為培養(yǎng)陰性。

3. GeneXpert 方法:按照產(chǎn)品說明書進行操作,將晨痰或混合后的標本吸取1 ml加入至含有2 ml 痰消化液的前處理管中,振蕩混勻15～20 s,靜置15 min后吸取2 ml加入至反應盒中,上機進行檢測,檢測結(jié)束后,在檢測系統(tǒng)窗口讀取結(jié)果,檢測結(jié)果分為陰、極低陽、低陽、中陽、高陽5個量級。

4. 比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”):按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》中固體比例法藥敏試驗操作流程開展利福平表型藥敏試驗,臨界濃度為40 μg/ml。每批試驗均使用質(zhì)控菌株H37Rv進行室內(nèi)質(zhì)量控制。

5. 質(zhì)量控制:按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》,每年定期進行痰涂片的室間和室內(nèi)質(zhì)量評價,均為合格。酸性羅氏培養(yǎng)基和藥敏培養(yǎng)基按照要求儲存于4 ℃冰箱并在有效期內(nèi)使用。GeneXpert檢測系統(tǒng)定期進行校準,定期接受國家疾病預防控制中心開展的結(jié)核病分子檢測方法熟練度測試,結(jié)果均為優(yōu)秀。

三、診斷原則

按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[4]標準,肺結(jié)核的診斷以病原學(包括細菌學和分子生物學)檢測結(jié)果為主,結(jié)合流行病學史、臨床表現(xiàn)、胸部影像特征、相關(guān)輔助檢查及鑒別診斷等,進行綜合分析后做出診斷?？顾釛U菌涂片鏡檢陽性、分枝桿菌固體培養(yǎng)陽性,經(jīng)菌種鑒定為MTB或GeneXpert檢測MTB陽性中任意一項結(jié)果為陽性,該患者均被診斷為病原學陽性患者。

四、統(tǒng)計學處理

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理,采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料以“頻數(shù)”和“百分率/構(gòu)成比(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗,各年間“百分率/構(gòu)成比”的趨勢變化采用趨勢χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考標準,計算GeneXpert檢測的敏感度、特異度、一致率和Kappa值,其中Kappa值在0.41～0.60為一致性較低,0.61～0.80為一致性較高,0.81～1.00為高度一致性。

結(jié) 果

一、肺結(jié)核可疑癥狀者實驗室檢測結(jié)果

2018—2022年北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部共登記肺結(jié)核可疑癥狀者3060例,全部進行涂片鏡檢和固體培養(yǎng)檢測,其中2557例(83.56%)進行了GeneXpert檢測。排除18例固體培養(yǎng)陽性經(jīng)菌種鑒定后被診斷為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)感染的患者,29例分枝桿菌固體培養(yǎng)污染的患者,49例GeneXpert檢測錯誤或無檢測結(jié)果的患者,最終3種檢測方法均有結(jié)果的肺結(jié)核患者共2496例(圖1)。

圖1 肺結(jié)核可疑癥狀者檢測及結(jié)果分布圖

二、GeneXpert檢測效能分析

(一)以固體培養(yǎng)為參考標準分析GeneXpert的檢測效能

涂片鏡檢、固體培養(yǎng)及GeneXpert結(jié)果均有效的2496例患者中,以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考,GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為79.39%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27%～94.51%),兩種方法Kappa值為0.73,具有較高的一致性(表1)。涂片陽性標本中GeneXpert檢測的敏感度為98.73%(95%CI:97.50%～99.96%),涂片陰性標本中的敏感度為59.34%(95%CI:53.83%～64.85%),涂陽和涂陰患者敏感度差異有統(tǒng)計學意義(Fisher精確概率檢驗,P<0.001),見表1和表2。

表1 以固體培養(yǎng)為參考標準分析GeneXpert MTB/RIF的檢測效能

表2 以固體培養(yǎng)為參考標準分析不同涂片結(jié)果GeneXpert MTB/RIF的檢測效能

不同年度GeneXpert檢測的敏感度顯示,2020年最低,為72.18%(95%CI:64.55%～79.81%),2022年最高,為90.48%(95%CI:84.20%～96.76%),各年度敏感度差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.148,P=0.025)。特異度范圍為90.91%(95%CI:87.76%～94.06%)～94.82%(95%CI:92.98%～96.76%),各年度間特異度差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.960,P=0.202),見表1。

(二)GeneXpert與經(jīng)菌種鑒定后的固體培養(yǎng)檢測不一致結(jié)果分析

252例患者GeneXpert與經(jīng)菌種鑒定后的固體培養(yǎng)結(jié)果不一致,其中GeneXpert檢測陽性/培養(yǎng)陰性124例,GeneXpert檢測陰性/培養(yǎng)陽性128例。GeneXpert檢測陽性/培養(yǎng)陰性的124例患者中,極低陽性結(jié)果71例(57.26%),明顯高于GeneXpert檢測陽性/培養(yǎng)陽性患者的20.49%(101/493),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=66.632,P<0.001)。128例GeneXpert檢測陰性/培養(yǎng)陽性的患者中,121例(94.53%)固體培養(yǎng)結(jié)果為1～3個菌落,另7例(5.47%)為+。

(三)病原學陽性患者結(jié)果分析

1. 不同年份病原學陽性患者發(fā)現(xiàn)情況:2018年肺結(jié)核可疑癥狀者中使用GeneXpert檢測的比例僅為47.54%,自2019年開始檢測比例明顯上升,至2022年達到98.11%。肺結(jié)核可疑癥狀者中,GeneXpert檢測陽性率5年平均為29.89%,范圍在27.37%～32.80%,見表3。

表3 肺結(jié)核可疑癥狀者中病原學檢測情況

2. GeneXpert提高涂片陰性或涂陰培陰患者的病原學陽性情況:2018—2022年,3種方法均有有效結(jié)果的病原學陽性肺結(jié)核患者共746例,各年度3種方法的病原學陽性患者陽性檢出比例見表4。3種方法對病原學陽性患者的陽性檢出比例差異有統(tǒng)計學意義(χ2=320.000,P<0.001)。GeneXpert的陽性檢出比例(82.71%)明顯高于涂片鏡檢(46.51%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=213.691,P<0.001),與固體培養(yǎng)(83.24%)比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.076,P=0.783)。

表4 病原學陽性患者中各檢測方法陽性患者檢出情況 [例(檢出率,%)]

在746例病原學陽性患者中,涂片陰性而GeneXpert檢測陽性的患者比例為36.86%,涂片和固體培養(yǎng)均為陰性但GeneXpert檢測陽性患者比例為12.60%,見表4。

(四)GeneXpert檢測利福平耐藥及探針突變類型分析

GeneXpert檢測的2496例標本中共檢出MTB陽性617例,其中利福平耐藥46例,耐藥不確定

23例,利福平敏感548例,利福平耐藥率為7.46%(46/617)。檢測試劑盒中,A、B、C、D、E 5個探針突變共檢測到10個基因突變型,其中3例不同時間標本檢出兩種突變型(無/E、ABE/AB、無/B),10個基因突變類型分別為A(6.12%,3/49)、B(6.12%,3/49)、C(2.04%,1/49)、D(8.16%,4/49)、E(63.27%,31/49)、AB(4.08%,2/49)、AD(2.04%,1/49)、DE(2.04%,1/49)、ABE(2.04%,1/49)和無探針突變(4.08%,2/49)。各突變探針的突變頻率為探針E(63.27%,31/49)>聯(lián)合突變(10.20%,5/49)>探針D(8.16%,4/49)>探針A(6.12%,3/49)=探針B(6.12%,3/49)>無突變(4.08%,2/49)>探針C(2.04%,1/49),探針E突變型屬于優(yōu)勢型別,在各年度也是優(yōu)勢型別,見表5。

表5 GeneXpert技術(shù)檢測利福平耐藥情況分析

46例GeneXpert檢測利福平耐藥患者中僅有36例為培養(yǎng)陽性患者,其菌株經(jīng)比例法藥敏試驗,顯示32例耐藥,4例敏感。4例比例法藥敏試驗敏感但GeneXpert檢測耐藥的3例患者為同一個探針A突變型,另1例為探針E突變型。

548例GeneXpert檢測利福平敏感的患者中,447例培養(yǎng)陽性,其中170例患者的菌株進行了比例法藥敏試驗,結(jié)果顯示均為敏感。

討 論

分子生物學方法對于提高病原學陽性率具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,隨著GeneXpert技術(shù)在肺結(jié)核可疑癥狀者中應用比例的提高,提高痰標本質(zhì)量并優(yōu)化GeneXpert檢測對象(從挑取1份痰標本轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌霞磿r痰、夜間痰和晨痰3份痰標本),活動性肺結(jié)核患者中病原學陽性比例明顯提高,從2018年的45.07%提升到2022年的69.39%,與其他研究結(jié)果相似[6-8]。且進一步研究發(fā)現(xiàn),通過實施GeneXpert,可以進一步檢測出36.86%的涂片陰性而最終病原學為陽性的患者,以及12.60%的涂片和培養(yǎng)均為陰性的病原學陽性患者。由此證實GeneXpert在臨床實踐中的重要性,此點也與楊超等[9]的研究結(jié)果相似,同時也提示在可疑癥狀者中,聯(lián)合使用固體培養(yǎng)、涂片鏡檢和GeneXpert 3種檢測方法,結(jié)合本文中優(yōu)化的標本操作對象,活動性肺結(jié)核患者病原學陽性率達到約70%(2022年為69.39%),基本是最佳數(shù)據(jù)。

在本研究中,除了2018年GeneXpert檢測比例較低外,自2019年開始,GeneXpert的檢測率均達到90%以上,但研究發(fā)現(xiàn)2019年病原學檢測陽性率與2018年相比并沒有明顯差異,分析原因可能為2018年臨床醫(yī)生選取的檢測患者均為高度疑似肺結(jié)核患者且選取的均為性質(zhì)最好的痰標本進行GeneXpert檢測,而2019年因采取盡檢原則,其中不合格痰標本較多,一定程度上影響了敏感度和病原學檢測陽性率。WHO總結(jié)了全球各項研究的GeneXpert總敏感度和特異度,分別為85%和98%[10]。本研究以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考,GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為79.38%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27～94.51),其中2022年敏感度最高,并且與2019—2021年相比差異明顯,可能是由于2022年進行GeneXpert檢測的標本為取3份標本混合后進行檢測所致。本研究是一項基于常規(guī)實驗室工作的回顧性分析,痰標本質(zhì)量控制無法達到前瞻性研究的嚴格標準,這也提示在基層結(jié)防機構(gòu)痰標本質(zhì)量依然是影響肺結(jié)核患者病原學檢測陽性率的重要因素之一。Sinshaw等[11]的研究表明,痰質(zhì)量是影響GeneXpert陽性檢出率的重要因素,以唾液痰為參考,干酪痰和血痰GeneXpert陽性率分別提高1.39倍和6.9倍,另一項研究也提示GeneXpert敏感度在唾液痰中明顯低于膿性痰(82.5%vs. 95.8%)[12]。在基層結(jié)核病檢測機構(gòu)中,在無法嚴格控制痰標本質(zhì)量的情況下,將3份標本均量混合再進行GeneXpert檢測可能會提高肺結(jié)核患者的病原學檢測陽性率。

在本研究中,GeneXpert和固體培養(yǎng)不一致主要發(fā)生于細菌載量低的患者。為了排除由于固體培養(yǎng)質(zhì)量造成的培養(yǎng)假陽性問題,筆者查驗原始記錄,這些患者并不集中于某一時間段或時間點,也不局限于某些陽性標本同一操作時間。因此,排除了由于固體培養(yǎng)操作質(zhì)量發(fā)生交叉污染的可能性,這些不一致的結(jié)果確實是由于標本中含菌量極低所致。

GeneXpert技術(shù)以rpoB基因為靶標檢測MTB對利福平的耐藥性,通過檢測A～E等5個分子探針對rpoB基因81 bp核心區(qū)的覆蓋情況來判斷是否對利福平耐藥。其與表型藥敏試驗檢測利福平耐藥性的一致性很好,僅出現(xiàn)4例兩種方法檢測不一致的患者,且主要發(fā)生在GeneXpert結(jié)果為A突變型的患者,既往研究也顯示Leu511Pro的位點突變是造成臨床MTB基因型與表型藥敏試驗結(jié)果不一致的主要原因之一[13],其他原因還包括基因突變?yōu)橥x突變(即不引起表型改變);耐藥水平較低,用現(xiàn)有利福平臨界濃度無法檢測到;表型藥敏試驗由于操作步驟較多,極個別患者可能因操作偏差引起結(jié)果不完全準確。本研究結(jié)果顯示,北京市朝陽區(qū)僅GeneXpert檢測陽性肺結(jié)核患者的利福平耐藥率為7.46%,高于北京市昌平區(qū)2019年僅GeneXpert檢測陽性肺結(jié)核患者的利福平耐藥率(6.3%)[14],以及21世紀初期北京地區(qū)羅氏固體培養(yǎng)陽性菌株比例法藥敏試驗檢測的利福平耐藥率(5.5%)[15],可能是由于地區(qū)和人口差異,另外方法學的差異也會影響檢測結(jié)果,如安燕生等[15]應用固體培養(yǎng)分離菌株再進行表型藥敏試驗,會丟掉部分培養(yǎng)陰性但耐藥的患者,而GeneXpert可以彌補此缺陷。本研究對利福平耐藥肺結(jié)核患者的耐藥基因型進行進一步分析顯示,本地區(qū)各年度以探針E突變型耐藥為主,與林永通等[16]的研究結(jié)論一致,但與其探針突變頻率的順序有所不同,這說明不同地區(qū)所流行的菌株利福平耐藥基因型略有不同。

綜上所述,北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部在2018—2022年期間,GeneXpert的逐步廣泛應用,不僅提高了活動性肺結(jié)核患者的病原學檢測陽性率,也能及時發(fā)現(xiàn)利福平耐藥肺結(jié)核患者?；旌?份痰標本進行GeneXpert檢測可能有助于提升檢測陽性率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻趙愛蘭:醞釀和設計實驗、實施研究、論文撰寫和修改、分析和解釋數(shù)據(jù);余琴:實施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析;俞南和張愛潔:實施研究、采集數(shù)據(jù);夏輝:文章修改和指導、分析和解釋數(shù)據(jù);徐偉:行政/技術(shù)/材料支持、支持性貢獻和指導