詹建 游國慶 何霞 孔玨穎 劉文果 馮鑫 胡彥

【Fundprogram】 Sichuan Provine Medical Scientific Research Project (19PJ155); Chongqing Tuberculosis Control Institute Medical Scientific Research Project (2022CQJFS03, 2022CQJFS05)

耐藥結(jié)核病是全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]估算,2021年全球新發(fā)耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(multidrug-resistant/rifampicin-resistant tuberculosis,MDR/RR-TB)患者約45萬例,MDR/RR-TB治療成功率僅為60%。氟喹諾酮類藥物[fluoroquinolones,FQs;左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)]是治療MDR-TB的核心藥物[2-3],若結(jié)核分枝桿菌對FQs耐藥,就會成為準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病(pre-extensive drug-resistant tuberculosis,pre-XDR-TB)甚至廣泛耐藥結(jié)核病(extensive drug-resistant tuberculosis,XDR-TB),治療更加困難。因此,FQs耐藥性檢測對pre-XDR-TB和XDR-TB的早期診斷及合理用藥至關(guān)重要。

目前,結(jié)核病耐藥性檢測方法主要有兩大類,表型藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗和分子藥敏試驗。相比一線抗結(jié)核藥物,FQs等二線抗結(jié)核藥物的表型藥敏試驗開展情況并不理想,其耗時長、操作繁瑣且需要專門的生物安全實驗室。分子藥敏試驗由于具有簡便、快速及自動化的特點而受到青睞。筆者擬探討熒光PCR熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)對FQs(Lfx和Mfx)耐藥性的診斷價值,并與表型藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行比較,對不一致結(jié)果的原因進(jìn)行分析。

資料和方法

一、一般資料

1.標(biāo)本來源:采用簡單隨機抽樣的方法,隨機選取2019年1月至2020年6月期間來自重慶市39個區(qū)(縣)結(jié)核病防治機構(gòu)經(jīng)菌種鑒定和比例法藥敏試驗確定為MDR-TB的126例患者的臨床分離株。本研究得到重慶市結(jié)核病防治所倫理委員會的批準(zhǔn)(編號:KY202203)。

2.主要儀器及試劑:SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀(購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司)、結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒(購自廈門致善生物科技股份有限公司)、微量肉湯稀釋法藥敏試劑盒及中性羅氏培養(yǎng)基(均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

二、研究方法

1.菌株傳代復(fù)蘇:選取凍存的126株耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行復(fù)蘇傳代,將凍存菌株放置室溫液化后,用無菌吸管吸取2滴(0.1 ml)接種至中性羅氏培養(yǎng)基中,在36 ℃條件下培養(yǎng)4周,復(fù)蘇成功率為100.0%(126/126)。

2.表型藥敏試驗:采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行表型藥敏試驗,使用7H9液體培養(yǎng)基(7H9∶OADC營養(yǎng)添加劑=9∶1),藥物濃度梯度設(shè)置為0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml。刮取中性羅氏培養(yǎng)基中生長良好的新鮮菌落進(jìn)行磨菌和比濁,制備成1 mg/ml(1.0麥?zhǔn)蠞岫?的菌懸液,通過100倍稀釋后接種到不同藥物濃度梯度的96孔藥敏板孔內(nèi),每孔100 μl,于36 ℃孵育7 d后判讀結(jié)果,肉眼觀察無菌落生長孔對應(yīng)的藥物濃度為其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。設(shè)2孔不加菌懸液的無藥培養(yǎng)孔為陰性對照,2孔加入菌懸液的無藥培養(yǎng)孔為陽性對照,若陰性對照孔無菌生長,陽性對照孔生長良好,則可判讀結(jié)果。若陽性對照孔生長欠佳,則繼續(xù)培養(yǎng)并每天觀察,至14 d。每批試驗以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv;ATCC27294)為敏感參考菌株進(jìn)行質(zhì)量控制。該方法已通過中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室藥敏試驗熟練度測試。Lfx耐藥臨界濃度為1.0 μg/ml,Mfx耐藥臨界濃度為0.25 μg/ml[4]。

3.熔解曲線法:通過單管單色體系,以gyrA為靶基因序列進(jìn)行PCR擴增,根據(jù)靶序列熔點的變化檢測gyrA基因88～94位密碼子是否含有突變,獲得FQs的耐藥信息。按照試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取、擴增和熔解曲線分析。DNA提取:用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)刮取菌體1環(huán),懸于250 μl TB-DNA 提取液中,以99 ℃加熱20 min,14 000×g離心10 min,吸取上清即為DNA模板。PCR反應(yīng)體系為25 μl,包括FQs PCR Mix 19.6 μl、TB酶混合液a 0.4 μl,DNA模板5 μl。PCR反應(yīng)程序:尿嘧啶-N-糖基化酶處理50 ℃ 2 min;預(yù)變性95 ℃ 10 min;降落循環(huán):95 ℃ 10 s,65 ℃ 20 s(每個循環(huán)下降1 ℃),78 ℃ 25 s;PCR循環(huán):變性95 ℃ 10 s,退火55 ℃ 20 s,延伸78 ℃ 25 s,共40個循環(huán)。熔解分析程序:95 ℃ 2 min,40 ℃ 2 min,45～85 ℃熔解曲線分析,每1 ℃采集FAM通道熒光信號。結(jié)果判斷:樣品的熔點與陽性對照的熔點一致(誤差不超過 1 ℃)時判定為野生型,對FQs敏感;樣品的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時(△Tm≥2 ℃)判定為突變型,對FQs耐藥。

4.全基因組測序(WGS):對熔解曲線法和表型藥敏試驗檢測結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行WGS。對菌液樣本以85 ℃金屬浴30 min滅活后送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行WGS。使用Illumina Hiseq 2500測序平臺進(jìn)行雙端測序,基因組平均測序深度100×,10×覆蓋度≥97.0%。利用結(jié)核分枝桿菌全基因組序列分析平臺(SAM-TB;https://samtb.uni-medica.com/index)將測序數(shù)據(jù)與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv全基因組序列(GenBank ID NC_00962.3)進(jìn)行比較,獲得全基因組單核苷酸變異(SNP)、插入和缺失(Indel)突變類型及突變頻率,通過與耐藥基因突變數(shù)據(jù)庫比對獲得菌株的耐藥突變譜。

5.WGS數(shù)據(jù)質(zhì)量控制:本研究所有測序數(shù)據(jù)均通過質(zhì)量控制。SAM-TB“數(shù)據(jù)質(zhì)控”頁會自動給出含接頭序列的reads比例、低質(zhì)量reads比例等數(shù)據(jù)質(zhì)量指標(biāo)及是否通過質(zhì)量控制,根據(jù)基因組平均深度和10×覆蓋度判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量是否滿足耐藥性和敏感性預(yù)測要求。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以“頻數(shù)”和“百分率/構(gòu)成比(%)”描述。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),計算熔解曲線法檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及一致率。診斷試驗可靠性評價采用Kappa一致性檢驗,Kappa值介于0～0.20為一致性較差,介于0.21～0.40為一致性一般,介于0.41～0.60為一致性中等,介于0.61～0.80為一致性良好,介于0.81～1.00為一致性非常好。

結(jié) 果

一、126株臨床分離株的基本情況

126株臨床分離株中,87株(69.0%)來自男性患者,39株(31.0%)來自女性患者;來自初治患者45例(35.7%),來自復(fù)治患者81例(64.3%);患者年齡21～70歲,平均年齡(44.5±22.0)歲。

二、FQs表型藥敏試驗結(jié)果

126株臨床分離株的MIC分布如圖1所示。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株對Lfx和Mfx的MIC分別為0.125 μg/ml 和0.031 μg/ml。在126株臨床分離株中,對FQs敏感35株(27.8%),對FQs耐藥(對Lfx和Mfx任一藥物表型耐藥均視為FQs耐藥)91株(72.2%),其中對Lfx和Mfx均耐藥82株(90.1%,82/91),僅耐Lfx 5株(5.5%,5/91),僅耐Mfx 4株(4.4%,4/91)。

圖1 126株耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Lfx和Mfx的最低抑菌濃度分布

三、熔解曲線法對FQs耐藥的檢測效能

熔解曲線法共檢測到gyrA突變86株,FQs耐藥檢出率為68.3%(86/126),耐藥突變率為94.5%(86/91)。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),熔解曲線法對FQs耐藥檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及一致率見表1。

表1 熔解曲線法對氟喹諾酮類藥物耐藥性的檢測效能

四、熔解曲線法與表型藥敏試驗結(jié)果不一致的情況

熔解曲線法與表型藥敏試驗結(jié)果不一致的有12株,不一致率為9.5%(12/126)。在Lfx和(或)Mfx表型藥敏試驗?zāi)退幎劢馇€法敏感的5株菌中,2株WGS未見gyrA基因突變;2株WGS發(fā)現(xiàn)gyrB基因突變,在WHO耐藥突變目錄中,gyrB_Arg446Leu與FQs耐藥的相關(guān)性不明確,gyrB_Asp461Asn與FQs耐藥中等相關(guān);1株WGS發(fā)現(xiàn)gyrA基因Asp94Ala發(fā)生突變,但突變頻率僅為15.3%。

在Lfx和(或)Mfx表型藥敏試驗檢測結(jié)果為敏感而熔解曲線法檢測結(jié)果為耐藥的7株菌中,經(jīng)WGS發(fā)現(xiàn),5株存在gyrA基因Ala90Val突變,1株存在gyrA基因Asp94Ala突變,1株存在gyrA基因Asp94Asn突變。具體見表2。

表2 氟喹諾酮類藥物表型藥敏試驗和熔解曲線法檢測結(jié)果不一致的情況

討 論

根據(jù)《耐藥肺結(jié)核全口服化學(xué)治療方案中國專家共識(2021年版)》[3],我國MDR/RR-TB患者治療方案分短程和長程治療方案,如患者適合短程治療方案,應(yīng)優(yōu)先選擇含F(xiàn)Qs的短程治療方案。FQs也為長程治療方案A組核心藥物,在MDR/RR-TB的基礎(chǔ)上對任意FQs耐藥即為pre-XDR-TB,根據(jù)FQs耐藥與否,長程方案用藥又有所不同。對FQs耐藥性的檢測,傳統(tǒng)表型藥敏試驗需要近2個月的時間,因此,采用分子藥敏的方法檢測FQs耐藥性,對于早期快速診斷pre-XDR-TB并進(jìn)行合理選藥和盡早治療非常關(guān)鍵。

本研究數(shù)據(jù)表明,熔解曲線法檢測Lfx和Mfx的一致率分別為96.0%和92.1%,Kappa值分別為0.908和0.817,對Lfx的檢測效能略優(yōu)于Mfx。其檢測總的FQs的敏感度和特異度分別為94.5%和100.0%,一致率達(dá)到96.0%,Kappa值為0.905,與表型藥敏試驗的一致性非常高,說明采用熔解曲線法可以早期識別由gyrA喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)突變引起的耐藥。在重慶地區(qū)流行的FQs耐藥株(即pre-XDR-TB株)中,通過熔解曲線法檢出的gyrA突變頻率高達(dá)94.5%,略低于Sirgel等[6]報道的98%,高于西安的87.1%[7],明顯高于北京的79.0%[8],這些研究結(jié)果的差異反映了不同地區(qū)FQs耐藥株gyrA突變流行的多樣性。此外,不同地區(qū)臨床分離株耐藥類型的不同可能是另一個合理的解釋。在北京地區(qū),研究材料僅1/4為MDR-TB臨床分離株[8],而本研究均為MDR-TB臨床分離株,由于MDR-TB患者通常比藥物敏感者接受了更多的FQs暴露,更易積累與FQs耐藥相關(guān)的基因突變[9]。

本研究結(jié)果顯示,熔解曲線法與表型藥敏試驗結(jié)果不一致者共12株,文獻(xiàn)報道其在對利福平和異煙肼的耐藥性檢測中也出現(xiàn)了類似的不一致情況[10-12],分子藥敏試驗并不能檢出所有表型耐藥菌株,且某些突變的基因位點不一定會引起表型特征改變[11,13],也可能與微孔板法自身缺陷有關(guān),如耐藥菌株在液體培養(yǎng)基中生長過緩導(dǎo)致試驗結(jié)果判斷產(chǎn)生假陰性等[10]。本研究兩種檢測方法結(jié)果不一致菌株經(jīng)WGS分析,在Lfx和(或)Mfx表型藥敏耐藥而熔解曲線法敏感的5株菌中:2株WGS未見gyrA基因突變,可能存在除gyrA基因突變外的其他機制引起的耐藥;2株WGS發(fā)現(xiàn)gyrB基因突變,在WHO突變目錄里[5],gyrB_Arg446Leu突變與FQs耐藥的相關(guān)性不明確,所以該Mfx低水平耐藥突變株實際可能對Mfx敏感,gyrB_Asp461Asn突變與FQs耐藥僅中等相關(guān),其引起的低水平耐藥也需更多臨床數(shù)據(jù)支持,而熔解曲線法因未包含gyrB相關(guān)探針而顯示為敏感;1株WGSgyrA基因發(fā)生Asp94Ala耐藥突變,突變頻率僅為15.3%,為異質(zhì)性耐藥,不同方法對異質(zhì)性耐藥的檢出限差異是導(dǎo)致該株菌分子藥敏與表型藥敏不一致的重要原因。異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象是指患者體內(nèi)同時存在敏感菌和耐藥菌,以及不同耐藥譜菌群共存的現(xiàn)象,其產(chǎn)生機制可能包括多重感染及微進(jìn)化等[14]。表型藥敏試驗可以檢測出1%比例的耐藥菌[15],深度測序也可以發(fā)現(xiàn)突變頻率為1%的耐藥突變[16],但由于成本和技術(shù)可及性方面的限制,WGS在資源有限地區(qū)難以推廣應(yīng)用,熔解曲線法可以檢測約20%的耐藥突變亞群[17],結(jié)合本研究,該方法檢測FQs耐藥性的敏感度高達(dá)94.5%,故其可作為FQs異質(zhì)性耐藥檢測的替代方法。

在Lfx和(或)Mfx表型藥敏試驗檢測敏感而熔解曲線法檢測耐藥的7株菌株中,經(jīng)WGS發(fā)現(xiàn),5株有g(shù)yrA基因Ala90Val突變,1株發(fā)現(xiàn)gyrA基因Asp94Ala突變,1株發(fā)現(xiàn)gyrA基因Asp94Asn突變,在WHO突變目錄里,該3種gyrA基因突變與FQs耐藥均明確相關(guān)[5],由于該7株菌株FQs的MIC值均處于臨界濃度或略高,證明結(jié)核分枝桿菌低水平耐藥者表型藥敏試驗有可能顯示為敏感,導(dǎo)致表型藥敏試驗和分子藥敏試驗結(jié)果不一致。WHO報告也指出,FQsgyrA某些突變(如Ala90Val和Asp94Ala等)的MIC分布接近臨界濃度,即低水平耐藥gyrA突變株的MIC分布與野生型臨床分離株之間存在一些重疊,可能導(dǎo)致假敏感的結(jié)果,具有此類突變的菌株表型藥敏試驗結(jié)果的可重復(fù)性差,與基因型藥敏試驗結(jié)果的一致性較低[4]。同時,結(jié)核分枝桿菌gyrA低水平耐藥相關(guān)突變凸顯了熔解曲線法等分子藥敏試驗方法在FQs耐藥性診斷中的價值。

綜上所述,熔解曲線法可以正確識別由gyrA基因QRDR區(qū)突變引起的FQs耐藥,是一種有前途的FQs耐藥結(jié)核病診斷方法。具有g(shù)yrA基因突變的FQs異質(zhì)性耐藥菌的比例及FQs低水平耐藥相關(guān)突變是影響熔解曲線法檢測效能及導(dǎo)致其與表型藥敏試驗結(jié)果不一致的主要原因。此外,本研究尚存在以下不足:一是研究對象為MDR-TB患者臨床分離株,未包含非MDR-TB患者臨床分離株,研究對象選擇的偏倚可能對研究結(jié)論產(chǎn)生影響;二是本研究無MDR-TB患者臨床治療結(jié)果的數(shù)據(jù),可能影響對處于耐藥臨界值附近臨床分離株表型藥敏試驗與熔解曲線法檢測結(jié)果不一致的解釋;三是本研究兩種檢測方法不一致結(jié)果的數(shù)量較少,對研究結(jié)論的解釋可能存在偏倚。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)詹建:實施研究、數(shù)據(jù)采集、文章撰寫;游國慶:實施研究、數(shù)據(jù)采集分析、經(jīng)費支持;何霞:實驗設(shè)計、文章修改、經(jīng)費支持;孔玨穎:實施研究、統(tǒng)計分析;劉文果:樣本收集、實施研究;馮鑫:實施研究、數(shù)據(jù)分析;胡彥:研究設(shè)計、實驗指導(dǎo)、文章審閱