衛(wèi)博文，高晶月#，劉 維*，王愛華，岳青云，顧慶香，卡玉秀，林芳芳，茍小平，王 文

金藤清痹顆粒治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究

衛(wèi)博文1, 2，高晶月1, 2#，劉 維1, 2*，王愛華1, 2，岳青云1, 2，顧慶香1, 2，卡玉秀1, 2，林芳芳1, 2，茍小平1, 2，王 文1, 2

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193 2. 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析金藤清痹顆粒治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）的作用機(jī)制，并建立AGA大鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證。在清熱解毒、活血止痛治法指導(dǎo)下，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜集金藤清痹顆粒的活性成分及靶點(diǎn)，利用GeneCards、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)等搜集AGA相關(guān)靶點(diǎn)，與金藤清痹顆粒作用靶點(diǎn)整合后，構(gòu)建共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)和“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點(diǎn)-AGA”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿（0.3 mg/kg）組和金藤清痹顆粒低、中、高劑量（1.05、2.10、4.20 g/kg）組，每組6只，踝關(guān)節(jié)注射單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體建立AGA大鼠模型。采用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)直徑，計(jì)算踝關(guān)節(jié)腫脹度；采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清尿酸（serum uric acid，SUA）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察踝關(guān)節(jié)組織病理變化；采用qRT-PCR、ELISA和Western blotting檢測(cè)踝關(guān)節(jié)組織及血清中關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路的表達(dá)。共檢索到金藤清痹顆粒110種活性成分、212個(gè)作用靶點(diǎn)，272個(gè)AGA治療靶點(diǎn)，共有靶點(diǎn)29個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)有白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及IL-6，涉及TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路等。大鼠踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后明顯腫脹（＜0.01），SUA及CRP顯著升高（＜0.05、0.01），滑膜組織增生明顯、結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、NIMA相關(guān)蛋白激酶7（NIMA-related kinases 7，NEK7）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、IL-18、IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平明顯升高（＜0.01）；秋水仙堿或金藤清痹顆粒治療后，有效緩解踝關(guān)節(jié)腫脹（＜0.05、0.01），SUA及CRP均顯著降低（＜0.05、0.01），關(guān)節(jié)滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均得到改善，同時(shí)顯著抑制IL-1β、TNF-α及IL-6等靶點(diǎn)和NOD樣受體信號(hào)通路的表達(dá)（＜0.05、0.01）。金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NOD樣受體信號(hào)通路的異常激活，降低炎癥因子水平，改善關(guān)節(jié)滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；金藤清痹顆粒；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；NOD樣受體信號(hào)通路；炎癥因子；清熱解毒；活血止痛

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是由于機(jī)體嘌呤代謝異常和（或）尿酸排泄減少，導(dǎo)致血尿酸升高，單鈉尿酸鹽析出、沉積于關(guān)節(jié)所致的疾病，具有高發(fā)病率和致殘率。近年來(lái)，隨著生活水平提高，痛風(fēng)患病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化[1-2]。2020年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)痛風(fēng)管理指南[3]推薦秋水仙堿、非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素為治療AGA的藥物。西醫(yī)可有效緩解患者癥狀，但目前用于治療AGA的藥物會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道不良反應(yīng)[4]，因此有必要尋找安全有效的治療藥物。中醫(yī)藥治療AGA歷史悠久，具有療效顯著、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。

金藤清痹顆粒為“四妙勇安湯”加減化裁而來(lái)，由金銀花、青風(fēng)藤、鹿銜草、山慈菇、蜈蚣等11味中藥組成，有清熱解毒、活血止痛之功，具有抗炎、止痛、解熱和免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。臨床上金藤清痹顆粒也常用于AGA的治療，但相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究以劉維教授的“毒痹論”為指導(dǎo)思想[7-8]，以金藤清痹顆粒作為清熱解毒、活血止痛治法的載體，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9]與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過(guò)踝關(guān)節(jié)注射單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體建立AGA大鼠模型，評(píng)價(jià)金藤清痹顆粒治療AGA的療效，并探索其相關(guān)作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院清潔級(jí)動(dòng)物房，12 h光照循環(huán)，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。所有操作及動(dòng)物處理均嚴(yán)格遵守相關(guān)動(dòng)物保護(hù)及使用規(guī)定，倫理批準(zhǔn)號(hào)NKYY-DWLL-2023-043。

1.2 藥品與試劑

金藤清痹顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20123065，批號(hào)28180061）由魯南厚普制藥有限公司提供；MSU（批號(hào)BCCF5862）、聚山梨酯80（批號(hào)096K00781）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；秋水仙堿片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20113208，批號(hào)20220302）購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為2023032947R、2023032990R、2023032994R、2023032980R）購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)20000671）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號(hào)20000679）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號(hào)00121900）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）抗體（批號(hào)00122309）、β-actin抗體（批號(hào)10025459）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號(hào)5123）購(gòu)自美國(guó)SAB公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體（批號(hào)10w2797）、NIMA相關(guān)蛋白激酶7（NIMA-related kinases 7，NEK7）抗體（批號(hào)59y9138）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)M3211080）購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)0202122021）、熒光定量預(yù)混液（批號(hào)0202010531）北京蘭博利德生物科技有限公司；引物序列由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1.3 儀器

ASP300S型自動(dòng)脫水機(jī)、HistocoreArcadia H包埋機(jī)、RM2265型超薄全自動(dòng)半薄輪式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BX43型正置光學(xué)顯微鏡、AU480型全自動(dòng)生化儀（日本Olympus公司）；Grinder-96型研磨儀（杭州佑寧儀器有限公司）；54178型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Colibri超微量分光光度計(jì)（德國(guó)Berthold Technologies公司）；ABI7500型qRT-PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy II全波段酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；1645050型MINI電泳儀、1703810型垂直電泳系統(tǒng)、1658004型濕法電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/）；Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）；NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// omim.org/）；String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）；微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）；上海生工（https://www.sangon.com/）；Cytoscape v3.7.2軟件；Rv4.2.1軟件；SPSS 20.0軟件。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 金藤清痹顆粒成分及靶點(diǎn)搜集 分別以金藤清痹顆粒的中藥“金銀花”“青風(fēng)藤”“鹿銜草”“山慈菇”“蜈蚣”“白花蛇舌草”“白芍”“當(dāng)歸”“甘草”“生地黃”“玄參”為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中以口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18為條件檢索、篩選活性成分及其靶點(diǎn)，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正。

2.1.2 AGA靶點(diǎn)采集、篩選以“acute gouty arthritis”和“gouty arthritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、NCBI和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索疾病靶點(diǎn)。

2.1.3 共有靶點(diǎn)的篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選金藤清痹顆粒與AGA的共有靶點(diǎn)，上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape軟件呈現(xiàn)，并應(yīng)用R軟件繪制度值直方圖。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，結(jié)果提交至微生信可視化，并應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點(diǎn)-AGA”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 分組、造模及給藥 36只大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、秋水仙堿（0.3 mg/kg）組和金藤清痹顆粒低、中、高劑量（1.05、2.10、4.20 g/kg）組，每組6只。稱取400 mg MSU，加入2 mL聚山梨酯80，以生理鹽水補(bǔ)足至20 mL，超聲溶解后加熱攪拌，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的MSU晶體混懸液。除空白組外，其余各組參照Coderre等[10]方法制備AGA模型，大鼠麻醉后，用碘伏消毒大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)，彎曲踝關(guān)節(jié)成直角，針頭從踝關(guān)節(jié)外側(cè)與脛骨呈45°插入踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每只注射MSU晶體混懸液0.2 mL（空白組注射等量無(wú)菌生理鹽水），用棉簽按壓幾秒避免藥液漏出，以踝關(guān)節(jié)囊的對(duì)側(cè)隆起作為成功注射的標(biāo)準(zhǔn)。造模前2 d開始，各給藥組ig相應(yīng)藥物，模型組和空白組ig等體積蒸餾水，3次/d，連續(xù)給藥5 d。末次給藥2 h后，ip 10%水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置1 h后3000 r/min離心15 min，分離血清，于?20 ℃凍存。取血后處死大鼠，剝離右側(cè)后足踝關(guān)節(jié)進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2.2 踝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量 于造模前及造模后6、24、48 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠右踝關(guān)節(jié)同一部位關(guān)節(jié)直徑，計(jì)算踝關(guān)節(jié)腫脹度。

踝關(guān)節(jié)腫脹度＝(造模后關(guān)節(jié)直徑－造模前關(guān)節(jié)直徑)/造模前關(guān)節(jié)直徑

2.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清尿酸（serum uric acid，SUA）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。

2.2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察踝關(guān)節(jié)病理 大鼠踝關(guān)節(jié)在4%多聚甲醛中固定48 h后，經(jīng)脫鈣、梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木素10 min、分化液2 s、伊紅1 min進(jìn)行染色，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并采集圖像進(jìn)行分析。

2.2.5 qRT-PCR檢測(cè)踝關(guān)節(jié)、、、、、、、、mRNA表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書提取踝關(guān)節(jié)中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.6 ELISA檢測(cè)血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平。

2.2.7 Western blotting檢測(cè)踝關(guān)節(jié)NLRP3、ASC、Caspase-1、NEK7、GSDMD蛋白表達(dá) 取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入RIPA強(qiáng)效裂解液，研磨儀60 Hz研磨3 min，轉(zhuǎn)至冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min后，取上清液，加入上樣緩沖液混勻，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h后顯影曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度，檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1、NEK7、GSDMD蛋白表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)檢索，納入金藤清痹顆粒110個(gè)活性成分及212個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)；經(jīng)Genecard、OMIM和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共獲得AGA相關(guān)靶點(diǎn)271個(gè)，兩者共有靶點(diǎn)29個(gè)，PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1）中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)包括IL-1β、TNF、IL-6。

3.1.2 共有靶點(diǎn)富集分析 通過(guò)構(gòu)建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點(diǎn)-AGA”網(wǎng)絡(luò)，直觀地呈現(xiàn)了金藤清痹顆粒治療AGA的11味中藥、110種活性成分、29個(gè)共同靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)模式（圖2）。

GO分析顯示，金藤清痹顆?？赡芨深A(yù)的生物過(guò)程涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，與之有關(guān)的細(xì)胞組分涉及分泌、細(xì)胞外基質(zhì)等，相對(duì)應(yīng)的分子功能有氧化還原酶、細(xì)胞因子等（圖3-A）。經(jīng)KEGG富集分析，前20個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路涉及代謝、凋亡、炎癥等相關(guān)信號(hào)通路，包括TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路等（圖3-B）。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 如表2所示，大鼠踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后逐漸發(fā)生腫脹，6 h達(dá)到高峰。與空白組比較，大鼠造模后6、24、48 h踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著增加（＜0.01），提示大鼠AGA模型成功。與模型組比較，秋水仙堿組各時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（＜0.01）；金藤清痹顆粒中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)直徑顯著降低（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低高劑量組造模后48 h踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（＜0.05）。

圖1 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) (A) 及top 20高靶標(biāo)陣列(B)

紅色菱形代表中藥，藍(lán)色箭頭代表活性成分，墨綠色圓形代表靶點(diǎn)

3.2.2 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠血清SUA、CRP水平的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清SUA及CRP水平均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組SUA及CRP水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 共有靶點(diǎn)GO功能(A) 及KEGG通路(B) 富集分析

表2 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響(, n = 6)

與空白組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，圖6同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as fig. 6

3.2.3 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響 如圖5所示，空白組大鼠踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)清晰，滑膜細(xì)胞排列正常，無(wú)細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血。與空白組比較，模型組滑膜組織增生明顯、結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血。與模型組比較，秋水仙堿組滑膜增生及炎癥浸潤(rùn)程度明顯降低，血管充血明顯緩解；金藤清痹顆粒各劑量組可顯著降低AGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥浸潤(rùn)程度，改善血管充血。以上結(jié)果提示，金藤清痹顆粒與秋水仙堿均具有改善AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥浸潤(rùn)等組織病理的作用。

3.2.4 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織、、、、、、、和mRNA表達(dá)的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中、、、、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和金藤清痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織中、、、、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒中劑量組、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低劑量組、、、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05、0.01）。

圖5 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響(HE, ×100)

表3 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

3.2.5 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平的影響 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平均顯著降低（＜0.01）。

3.2.6 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組NLRP3、NEK7、ASC和GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），金藤清痹顆粒高劑量組NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），金藤清痹顆粒中劑量組NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低劑量組ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。

表4 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平的影響(, n = 6)

圖6 金藤清痹顆粒對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

AGA是尿酸鈉晶體沉積于關(guān)節(jié)腔中，募集巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引起大量炎性因子和趨化因子釋放，而誘發(fā)的炎癥性疾病[11]。AGA以急慢性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石等為臨床特征，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)畸形、腎尿酸結(jié)石、痛風(fēng)性腎病及腎功能不全等病變[12]。因此，本病的治療原則和目標(biāo)在于緩解急性期癥狀，維持SUA水平持續(xù)達(dá)標(biāo)，減少痛風(fēng)發(fā)作，減少合并癥的發(fā)生[13]。

中醫(yī)學(xué)將AGA歸屬“痹證”“歷節(jié)”“痛風(fēng)”等范疇，朱丹溪最早提出“痛風(fēng)”病名，《格致余論·痛風(fēng)論》記載：“痛風(fēng)者，大率因血受熱，已自沸騰，其后或涉冷水，或立濕地，或扇風(fēng)取涼，或臥當(dāng)風(fēng)，寒涼外搏，熱血得寒，汗?jié)崮凉宰魍?，夜則痛甚，行于陰也”。在劉維教授“毒痹論”思想指導(dǎo)下，本研究認(rèn)為AGA的病機(jī)為稟賦不足，脾腎虧虛，濕濁內(nèi)停，濕濁郁久化熱，與濁毒搏結(jié)，流注經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)，而濕濁內(nèi)停，日久阻滯氣血運(yùn)氣，導(dǎo)致瘀血內(nèi)生而發(fā)病。金藤清痹顆粒中金銀花、青風(fēng)藤清熱解毒，通痹止痛，為君藥；鹿銜草、山慈菇和白花蛇舌草清熱解毒、補(bǔ)血活血，強(qiáng)筋健骨，緩急止痛，為臣藥；金銀花配伍玄參、當(dāng)歸、甘草為四妙勇安湯，既能清熱解毒活血又可養(yǎng)陰扶正，配白芍，滋陰涼血，瀉火解毒，為佐藥；蜈蚣既可以解毒通絡(luò)止痛，又可引藥入經(jīng)，直達(dá)病所，為使藥，全方共奏清熱解毒、活血止痛的功效，具有抗炎、止痛、解熱和免疫調(diào)節(jié)作用[14]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點(diǎn)-AGA”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)金藤清痹顆粒治療AGA的目標(biāo)靶點(diǎn)及其潛在機(jī)制，結(jié)果顯示靶點(diǎn)呈現(xiàn)多機(jī)制多通路的多層次趨勢(shì)，主要靶點(diǎn)包括IL-1β、TNF及IL-6，涉及TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路等。為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，闡明金藤清痹顆粒治療AGA的機(jī)制，本研究采用踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體誘導(dǎo)大鼠AGA，經(jīng)金藤清痹顆粒ig治療后，踝關(guān)節(jié)腫脹度有效緩解，SUA及CRP均顯著降低，踝關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到改善，同時(shí)顯著抑制IL-1β、TNF-α及IL-6等靶點(diǎn)和NOD樣受體信號(hào)通路的表達(dá)。

NOD樣受體信號(hào)通路在痛風(fēng)的發(fā)病中具有重要的作用，NLRP3炎性小體由先天免疫傳感器NLRP3、ASC和Caspase-l組成[15]，活化的NLRP3與ASC聚合形成ASC斑點(diǎn)，導(dǎo)致Caspase-l的活化，促進(jìn)IL-1β前體和IL-18前體的切割，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18[16-17]，并分泌到細(xì)胞外引發(fā)炎癥反應(yīng)，因此在先天免疫和炎癥中起著核心作用。研究顯示，MSU可激活NLRP3，促使ASC完成NLRP3炎性小體的裝配，從而激活Caspase-l，促使IL-1β和IL-18的成熟與分泌。而在NLRP3、ASC、Caspase-1缺乏的細(xì)胞中，MSU的刺激不能產(chǎn)生成熟的IL-1β[18]。Caspase-l是胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員之一，含有胱天氨酸募集結(jié)構(gòu)域以及p20、p10 2個(gè)發(fā)揮活性的區(qū)域[19]，ASC一端可與NLRP3聚合，一端可與Caspase-1聚合，是炎性小體重要的接頭分子[20-21]。活性Caspase-1執(zhí)行了GSDMD氨基末端的切割，這是焦亡必經(jīng)的過(guò)程[22]。Gasdermins蛋白家族是一類具有打孔效應(yīng)的蛋白，可使細(xì)胞膜穿孔導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，其中GSDMD可被Caspase切割為具有成孔作用的GSDMD-N和自抑制的GSDMD-C，因此GSDMD也被稱為細(xì)胞焦亡的“執(zhí)行者”[23-24]。當(dāng)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原體/損傷相關(guān)分子模式（pathogen-or damage-associated molecular patterns，PAMPs/DAMPs）細(xì)胞內(nèi)K+外流[25]，線粒體損傷、活性氧釋放增加[26-27]，溶酶體破裂、組織蛋白酶漏出[28-29]，均可導(dǎo)致NLRP3活化。NEK7是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，作用于K+外流的下游，在ROS的誘導(dǎo)下與NLRP3結(jié)合，調(diào)節(jié)NLRP3的寡聚和激活，其缺乏導(dǎo)致NLRP3無(wú)法與ASC聚合，ASC斑點(diǎn)無(wú)法形成，抑制Caspase-1的切割和IL-1β的釋放，提示NEK7在NLRP3上游的炎癥體激活中起著特異性的作用[30-32]。TNF-α是一種高度多效性的細(xì)胞因子，具有細(xì)胞增殖、代謝激活、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡等多種生物學(xué)功能[33]。而IL-6對(duì)感染和組織損傷反應(yīng)迅速，通過(guò)刺激急性期反應(yīng)、造血作用和免疫反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體防御和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[34]。研究表明，MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)大鼠滑膜組織和血清中TNF-α和IL-6水平均明顯升高，與AGA炎癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制顯著相關(guān)，而IL-1β可以促進(jìn)其產(chǎn)生[35-36]。因此，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)是緩解AGA患者臨床癥狀的主要方法。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，探究清熱解毒、活血止痛治法載體金藤清痹顆粒對(duì)大鼠AGA的保護(hù)作用及機(jī)制，結(jié)果表明，金藤清痹顆粒能夠降低SUA及CRP，有效緩解踝關(guān)節(jié)腫脹，其機(jī)制可能與抑制NOD樣受體信號(hào)通路的異常激活，降低炎癥因子水平，改善踝關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。本研究豐富了清熱解毒、活血止痛法治療AGA的研究，為臨床應(yīng)用金藤清痹顆粒提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì). 臨床診療指南: 風(fēng)濕病分冊(cè) [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2005: 120-126.

[2]Dalbeth N, Gosling A L, Gaffo A,. Gout [J]., 2021, 397(10287): 1843-1855.

[3]FitzGerald J D, Dalbeth N, Mikuls T,. 2020 American college of rheumatology guideline for the management of gout [J]., 2020, 72(6): 744-760.

[4]鄧雪蓉, 王昱, 張卓莉. 2016年痛風(fēng)治療理念和治療建議的更新 [J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2017, 37(3): 217-220.

[5]鄭新春, 楊德才. 金藤清痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效觀察 [J]. 湖北中醫(yī)雜志, 2013, 35(3): 15-16.

[6]唐今揚(yáng), 周彩云, 王鑫, 等. 金藤清痹顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的干預(yù)作用 [J]. 中成藥, 2022, 44(11): 3459-3468.

[7]劉維. 毒痹論 [J]. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 13(1): 15.

[8]劉維, 于海浩, 吳沅皞. 毒痹論續(xù) [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(3): 718-721.

[9]牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[10]Coderre T J, Wall P D. Ankle joint urate arthritis (AJUA) in rats: An alternative animal model of arthritis to that produced by Freund’s adjuvant [J]., 1987, 28(3): 379-393.

[11]Desai J, Steiger S, Anders H J. Molecular pathophysiology of gout [J]., 2017, 23(8): 756-768.

[12]Lorenzo J P P, Sollano M H M Z, Salido E O,. 2021 Asia-Pacific League of Associations for Rheumatology clinical practice guideline for treatment of gout [J]., 2022, 25(1): 7-20.

[13]劉維. 痛風(fēng)及高尿酸血癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南 [J]. 中醫(yī)雜志, 2023, 64(1): 98-106.

[14]翟弋焱, 陳美琳, 時(shí)銳, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的金藤清痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究 [J]. 中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析, 2023, 23(4): 385-392.

[15]Martinon F, Mayor A, Tschopp J. The inflammasomes: Guardians of the body [J]., 2009, 27: 229-265.

[16]Chen G, Shaw M H, Kim Y G,. NOD-like receptors: Role in innate immunity and inflammatory disease [J]., 2009, 4: 365-398.

[17]Yang J, Liu Z H, Xiao T S. Post-translational regulation of inflammasomes [J]., 2017, 14(1): 65-79.

[18]Martinon F, Burns K, Tschopp J. The inflammasome: A molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta [J]., 2002, 10(2): 417-426.

[19]Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases: Linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases [J]., 2004, 117(5): 561-574.

[20]Park H H, Lo Y C, Lin S C,. The death domain superfamily in intracellular signaling of apoptosis and inflammation [J]., 2007, 25: 561-586.

[21]Kohl A, Grütter M G. Fire and death: The pyrin domain joins the death-domain superfamily [J]., 2004, 327(12): 1077-1086.

[22]Shi J J, Zhao Y, Wang K,. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death [J]., 2015, 526(7575): 660-665.

[23]Van Opdenbosch N, Lamkanfi M. Caspases in cell death, inflammation, and disease [J]., 2019, 50(6): 1352-1364.

[24]Broz P, Pelegrín P, Shao F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation [J]., 2020, 20(3): 143-157.

[25]Katsnelson M A, Rucker L G, Russo H M,. K+efflux agonists induce NLRP3 inflammasome activation independently of Ca2+signaling [J]., 2015, 194(8): 3937-3952.

[26]Bruchard M, Mignot G, Derangère V,. Chemotherapy-triggered cathepsin B release in myeloid-derived suppressor cells activates the Nlrp3 inflammasome and promotes tumor growth [J]., 2013, 19(1): 57-64.

[27]Kim Y K, Koppula S, Shim D W,. Inhibitory effect and mechanism ofextractinflammasome activation [J]., 2018, 2018: 6346734.

[28]Amaral E P, Riteau N, Moayeri M,. Lysosomal cathepsin release is required for NLRP3-inflammasome activation byin infected macrophages [J]., 2018, 9: 1427.

[29]Orlowski G M, Sharma S, Colbert J D,. Frontline Science: Multiple cathepsins promote inflammasome-independent, particle-induced cell death during NLRP3-dependent IL-1β activation [J]., 2017, 102(1): 7-17.

[30]Xu X J, Zhang L, Ye X C,. Nrf2/ARE pathway inhibits ROS-induced NLRP3 inflammasome activation in BV2 cells after cerebral ischemia reperfusion [J]., 2018, 67(1): 57-65.

[31]He Y, Zeng M Y, Yang D H,. NEK7 is an essential mediator of NLRP3 activation downstream of potassium efflux [J]., 2016, 530(7590): 354-357.

[32]Shi H X, Wang Y, Li X H,. NLRP3 activation and mitosis are mutually exclusive events coordinated by NEK7, a new inflammasome component [J]., 2016, 17(3): 250-258.

[33]Jing Z T, Liu W, Xue C R,. AKT activator SC79 protects hepatocytes from TNF-α-mediated apoptosis and alleviates d-Gal/LPS-induced liver injury [J]., 2019, 316(3): G387-G396.

[34]Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. IL-6 in inflammation, immunity, and disease [J]., 2014, 6(10): a016295.

[35]Li C, Wang C, Guo Y J,. Research on the effect and underlying molecular mechanism of Cangzhu in the treatment of gouty arthritis [J]., 2022, 927: 175044.

[36]So A K, Martinon F. Inflammation in gout: Mechanisms and therapeutic targets [J]., 2017, 13(11): 639-647.

Mechanism of Jinteng Qingbi Granules in treatment of acute gouty arthritis

WEI Bo-wen1, 2, GAO Jing-yue1, 2, LIU Wei1, 2, WANG Ai-hua1, 2, YUE Qing-yun1, 2, GU Qing-xiang1, 2, KA Yu-xiu1, 2, LIN Fang-fang1, 2, GOU Xiao-ping1, 2, WANG Wen1, 2

1. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300193, China

To study the mechanism of Jinteng Qingbi Granules (金藤清痹顆粒) in treating acute gouty arthritis (AGA) by network pharmacology and establish AGA rat model for verification.The active components and targets of Jinteng Qingbi Granules were collected by TCMSP database, and AGA-related targets were collected by GeneCards and NCBI database under the guidance of clearing heat and detoxification, promoting blood circulation and relieving pain. After integrating with the targets of Jinteng Qingbi Granules, protein-protein interaction (PPI) and “Jinteng Qingbi Granules-traditional Chinese medicine-active component-target-AGA” network was constructed, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were carried out. Male SD rats were randomly divided into blank group, model group, colchicine (0.3 mg/kg) group and Jinteng Qingbi Granules low-, medium- and high-dose (1.05, 2.10, 4.20 g/kg) groups, with six rats in each group. The AGA rat model was established by ankle injection of monosodium urate (MSU) crystals. The diameter of ankle joint in rats was measured by vernier caliper, and the swelling degree of ankle joint was calculated. Serum uric acid (SUA) and C-reactive protein (CRP) levels were detected by automatic biochemical analyzer. HE staining was used to observe the pathological changes of ankle joint. qRT-PCR, ELISA and Western blotting were used to detect the expressions of key targets and signal pathways in ankle joint tissue and serum.A total of 110 active ingredients, 212 targets and 272 AGA therapeutic targets were retrieved, with a total of 29 common targets. The key targets were interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor (TNF) and IL-6, involving TNF signaling pathway, IL-17 signaling pathway and NOD-like receptor signaling pathway. After injecting MSU crystal into the ankle joint of rats, the swelling was obvious (< 0.01), SUA and CRP were significantly increased (< 0.05, 0.01), synovial tissue proliferated obviously, the structure was disordered, and a large number of inflammatory cells infiltrated. NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3), NIMA-related kinases 7 (NEK7), apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), cystein-aspartate protease-1 (Caspase-1), gasdermin D (GSDMD), IL-18, IL-1β, IL-6 and TNF-α expression levels were significantly increased (< 0.01). After treatment with colchicine or Jinteng Qingbi Granules, ankle swelling was effectively relieved (< 0.05, 0.01), SUA and CRP were significantly decreased (< 0.05, 0.01), synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration of joints were improved, and the expressions of IL-1β, TNF-α and IL-6 and NOD-like receptor signaling pathway were significantly inhibited (< 0.05, 0.01).Jinteng Qingbi Granules has significant protective effects on AGA rats, and the mechanism may be related to the inhibition of abnormal activation of NOD-like receptor signaling pathway, reducing inflammatory factor levels, and improvement of synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration in joints.

network pharmacology; Jinteng Qingbi Granules; acute gouty arthritis; NOD-like receptor signaling pathway; inflammatory factor; clearing heat and detoxification; promoting blood circulation and relieving pain

R285.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7086 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.017

2023-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074377）；中醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新“百千萬(wàn)”人才工程（岐黃工程）岐黃學(xué)者（20210602-1）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局名老中醫(yī)傳承工作室（975022）；金藤清痹顆粒二次開發(fā)項(xiàng)目（20220626-1）

衛(wèi)博文，男，博士研究生，研究方向?yàn)轱L(fēng)濕免疫類疾病發(fā)病機(jī)制及中藥防治研究。E-mail: 278713948@qq.com

通信作者：劉 維，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轱L(fēng)濕免疫類疾病發(fā)病機(jī)制及中藥防治研究。E-mail: fengshiliuwei@163.com

高晶月，女，主治醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合診療風(fēng)濕病。E-mail: gaojingyue0603@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]